引用本文： 黃江, 李翊, 肖建江, 徐國旭, 卜曙旸, 羅蔚鋒. 姜黃素對高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞凋亡的影響. 中華眼底病雜志, 2017, 33(5): 513-517. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.017 復制
氧化應激是糖尿病視網膜病變（DR）發病的關鍵機制[1-3]。核因子（NF）-κB作為一類關鍵性核轉錄因子，可以在多種細胞中激活，并通過調節許多細胞基因的表達，在細胞調控、氧化應激反應中發揮極其重要的作用；激活NF-κB信號通路，可以導致細胞凋亡[4-7]。姜黃素是從植物姜黃的塊莖中提取出來的一種黃色粉末，具有明顯抗炎、抗腫瘤及抗氧化等作用[8-11]。已有研究表明，姜黃素對視網膜色素上皮細胞具有明顯的抗氧化作用，且其作用可能與選擇性抑制NF-κB信號通路有關[12-14]。但目前關于姜黃素對大鼠視網膜血管內皮細胞（RRVEC）是否具有抗氧化作用及其可能的作用機制尚不清楚。為此，本研究觀察了姜黃素對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響，初步分析了姜黃素與NF-κB、RRVEC凋亡三者之間的關系。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
Sprague-Dawley雄性大鼠60只，體重約100 g，由蘇州大學實驗動物中心提供。姜黃素[梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]，胰蛋白酶（美國Invitrogen公司），Ⅱ型膠原酶、噻唑藍、濃度0.04%的錐蟲藍（美國Sigma公司），血管性假性血友病因子（vWF）免疫多克隆抗體（1:200，美國Abcam公司），內皮細胞培養基、熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物有限公司），兔抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，杭州賢至生物有限公司），兔抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體、兔抗大鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、兔抗大鼠Bcl-2相關x蛋白（Bax）（武漢三鷹生物技術有限公司）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、細胞活性氧（ROS）檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），二氨基聯苯胺顯色試劑盒（北京索萊寶科技公司），細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。IX51型倒置顯微鏡、Eppendorf低速離心機、BX53熒光顯微鏡（日本Olymbus公司），尼康E100型生物顯微鏡（日本Nikon公司），酶標儀（美國熱電公司），流式細胞儀（美國BD公司）。
1.2 RRVEC培養及鑒定
實驗動物使用遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。參照文獻[15]的方法進行細胞分離培養。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，脫頸處死，頭部常規消毒后完整摘除眼球，75%乙醇浸泡30 s，取出后放入含200 U/ml青霉素和鏈霉素的冰磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗3遍，洗凈血污后置于含有冰PBS紗布的培養皿中，獲取視網膜組織并剪碎，直接加入培養液進行培養。使用0.1% Ⅰ型膠原酶將視網膜組織置于37 ℃條件下消化30 min，吸收消化液，再經網孔100 μm的兩層不銹鋼細胞篩網過濾，收集洗脫液，室溫下以離心半徑13 cm、轉速1500 r/m離心5 min，去除上清液。取離心后的沉淀物加入含有肝素鈉、胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基，接種于24孔培養板上，然后放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養，定期換液。
取第4代近融合的RRVEC以密度1×104個/ml接種在預先涂有明膠的蓋玻片上，繼續培養24 h，待細胞貼壁后將蓋玻片取出，采用免疫細胞熒光染色法鑒定細胞，并對內皮細胞的特異性標志物vWF的表達進行檢測。陰性對照組以PBS代替一抗，加入Cy3二抗工作液37 ℃孵育顯色。熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。以Cy3發出紅色熒光為陽性表達。
1.3 細胞分組及流式細胞儀、蛋白免疫印跡法（Western blot）、免疫組織化學染色檢測
將RRVEC分為對照組、高糖組和姜黃素干預組。對照組細胞正常培養。高糖組細胞經30 mmol/L的葡萄糖培養。干預組細胞經30 mmol/L的葡萄糖培養24 h后，再加入30 μmol/L的姜黃素處理24 h。
采用流式細胞儀檢測各組RRVEC中ROS相對含量。將各組細胞制成單細胞懸液，以細胞密度2×105個/孔均勻接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養過夜。用不含乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化細胞，終止消化后收集，離心去上清液，用PBS將細胞潤洗2次。按照細胞ROS檢測試劑盒操作說明進行，流式細胞儀檢測。
采用Western blot檢測各組RRVEC中Bcl-2、Bax的蛋白表達。提取總蛋白及檢測目的蛋白，將PBS稀釋過的蛋白樣品及標準蛋白分別加入96孔板內，標準品各設2個平行孔，待測樣品設3個平行孔，每孔加入體積20 μl。加入PBS的2個平行孔為空白對照。按50:1比例將BCA蛋白濃度測定試劑盒中A液和B液進行混合，將混合液加入96孔板內，每孔加入200 μl，37 ℃避光孵育30 min。用酶標儀測定波長568 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。根據標準蛋白濃度和相應的A值計算直線回歸方程，根據蛋白樣品A值，利用回歸方程計算樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清與5倍蛋白上樣緩沖液放入沸水中進行沸水浴10 min，進行蛋白變性。參照文獻[16]的方法進行電泳、轉膜，膜封閉，添加一抗4 ℃孵育過夜（GAPDH：1:1000；Bcl-2：1:2000；Bax：1:5000）。洗膜5～6次后添加相應二抗。洗膜后，以化學發光法顯影、定影，并沖洗膠片。應用BandScan分析膠片灰度值，重復實驗3次。
參考文獻[17]的方法采用免疫組織化學染色法檢測各組RRVEC中NF-κB p65的蛋白表達。取出細胞爬片，PBS沖洗3次，分別滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗體，按霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學染色試劑盒說明進行操作。以細胞質呈黃色或棕黃色染色為陽性細胞。每張切片選擇10個高倍視野，顯微鏡下觀察并照相，采用數碼圖像分析系統進行分析。以陽性細胞的平均A值計算目的蛋白的相對表達量。
采用流式細胞儀分析各組RRVEC的凋亡情況。將各組細胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培養72 h收集細胞，制備單細胞懸液，用PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×105個/L，制成單個細胞懸液，每樣本加入5 μl膜聯蛋白和1 μl碘化丙啶工作液，室溫下避光孵育15 min，孵育完成后再加入400 μl的膜聯蛋白結合緩沖液，流式細胞儀進行分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析。數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，細胞凋亡率以百分數表示；其他實驗數據以均數±標準差（
）表示。組間均數經Levene檢驗方差齊性，采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差法 t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
分離得到的RRVEC在1周后呈鋪路石樣單層貼壁生長。培養獲得的細胞vWF表達呈強陽性（圖1）。
圖1
RRVEC倒置相差顯微鏡及免疫熒光顯微鏡像。1A. 倒置相差顯微鏡像，培養1周的RRVEC呈鋪路石樣生長 標尺：100 μm；1B. 免疫熒光顯微鏡像，vWF免疫熒光染色細胞質呈紅色熒光 標尺：20 μm
對照組、高糖組及姜黃素干預組RRVEC中ROS相對含量比較，差異有統計學意義（F=40.957，P=0.000）。與對照組比較，高糖組RRVEC中ROS相對含量明顯增加，差異有統計學意義（t=8.677，P=0.000）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中ROS相對含量明顯降低，差異有統計學意義（t=6.568，P=0.000）（圖2A）。
圖2
各組RRVEC中ROS相對含量及細胞凋亡率比較。**P＜0.01
對照組、高糖組及姜黃素干預組RRVEC凋亡率比較，差異有統計學意義（F=325.137，P=0.000）。與對照組比較，高糖組RRVEC凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（t=25.500，P=0.000）。姜黃素干預組RRVEC凋亡率較高糖組明顯降低，差異有統計學意義（t=12.818，P=0.000）；但仍較對照組升高，差異有統計學意義（t=12.682，P=0.000）（圖2B）。
圖3
各組RRVEC中NF-κBp65蛋白表達比較。*P＜0.05；**P＜0.01
對照組RRVEC細胞質NF-κB p65蛋白呈陽性表達；高糖組RRVEC細胞核和細胞質均可見NF-κB p65蛋白呈強陽性表達；姜黃素干預組RRVEC細胞核和細胞質均可見NF-κB p65蛋白呈陽性表達。與對照組比較，高糖組RRVEC中NF-κB p65蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（t=8.322，P＜0.01）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中NF-κB p65蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（t=2.577，P＜0.05）（圖3）。
圖4
各組RRVEC中Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表達比較。*P＜0.05；**P＜0.01
與對照組比較，高糖組RRVEC中Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統計學意義（t=4.362、3.813、6.449，P=0.005、0.009、0.001）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中Bcl-2蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義（t=2.148，P=0.075）；Bax蛋白表達明顯降低（t=3.059，P=0.022），Bcl-2/Bax比值明顯升高（t=3.831，P=0.009），差異均有統計學意義（圖4）。
3 討論
本研究經預實驗篩選出葡萄糖及姜黃素對RRVEC增生影響的最佳濃度為30 mmol/L、30 μmol/L。進一步實驗結果顯示，30 mmol/L高糖作用RRVEC 24 h后細胞內即開始產生大量ROS，而經過30 μmol/L姜黃素作用24 h后，細胞內ROS相對含量顯著降低。說明姜黃素可以明顯抵抗高糖引起的氧化應激反應。而流式細胞儀檢測結果顯示，姜黃素對于氧化應激引起的RRVEC凋亡具有明顯的抑制作用，從細胞功能學角度證實姜黃素能夠保護RRVEC。
Bcl-2、Bax是細胞凋亡的重要相關基因。Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因，且NF-κB調控的下游基因包括Bcl-2、Bax。Bcl-2基因啟動子區含有NF-κB的結合位點，NF-κB能夠直接上調Bcl-2的表達或通過其他途徑促進Bcl-2的表達[18, 19]。為了進一步研究姜黃素抗氧化應激的具體分子機制，我們觀察了高糖作用于RRVEC中NF-κB p65、Bcl-2、Bax的蛋白表達變化。免疫組織化學染色觀察發現，高糖誘導RRVEC后，其細胞核中的NF-κB p65表達明顯升高，而細胞質中NF-κB p65表達降低。說明高糖誘導下，RRVEC細胞質內的NF-κB p65進入細胞核明顯增加，并發揮了轉錄活性；而在姜黃素的干預下，高糖誘導的RRVEC細胞質中NF-κB p65表達降低且進入細胞核明顯受到抑制。提示姜黃素能夠通過阻斷NF-κB信號通路抑制高糖引起的RRVEC氧化應激反應。我們通過Western blot檢測發現，經高糖誘導后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低；而姜黃素干預后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯升高。RRVEC中NF-κB p65蛋白與Bcl-2、Bax蛋白表達以及Bcl-2/Bax比值變化的一致性說明高糖誘導RRVEC可激活NF-κB，進而引起Bcl-2蛋白表達降低、Bax蛋白表達升高。
本研究結果表明，姜黃素能夠抑制高糖引起的RRVEC中ROS的產生以及細胞凋亡的發生，其可能機制是抑制NF-κB表達，上調下游抑凋亡基因Bcl-2表達，下調促凋亡基因Bax表達。提示姜黃素能夠通過抑制NF-κB通路，對抗氧化應激從而起到保護視網膜血管內皮細胞的作用，而更確切深入的機制尚待進一步的分子生物學研究證實。
氧化應激是糖尿病視網膜病變（DR）發病的關鍵機制[1-3]。核因子（NF）-κB作為一類關鍵性核轉錄因子，可以在多種細胞中激活，并通過調節許多細胞基因的表達，在細胞調控、氧化應激反應中發揮極其重要的作用；激活NF-κB信號通路，可以導致細胞凋亡[4-7]。姜黃素是從植物姜黃的塊莖中提取出來的一種黃色粉末，具有明顯抗炎、抗腫瘤及抗氧化等作用[8-11]。已有研究表明，姜黃素對視網膜色素上皮細胞具有明顯的抗氧化作用，且其作用可能與選擇性抑制NF-κB信號通路有關[12-14]。但目前關于姜黃素對大鼠視網膜血管內皮細胞（RRVEC）是否具有抗氧化作用及其可能的作用機制尚不清楚。為此，本研究觀察了姜黃素對高糖誘導的RRVEC凋亡的影響，初步分析了姜黃素與NF-κB、RRVEC凋亡三者之間的關系。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料
Sprague-Dawley雄性大鼠60只，體重約100 g，由蘇州大學實驗動物中心提供。姜黃素[梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]，胰蛋白酶（美國Invitrogen公司），Ⅱ型膠原酶、噻唑藍、濃度0.04%的錐蟲藍（美國Sigma公司），血管性假性血友病因子（vWF）免疫多克隆抗體（1:200，美國Abcam公司），內皮細胞培養基、熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物有限公司），兔抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，杭州賢至生物有限公司），兔抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體、兔抗大鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、兔抗大鼠Bcl-2相關x蛋白（Bax）（武漢三鷹生物技術有限公司）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、細胞活性氧（ROS）檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），二氨基聯苯胺顯色試劑盒（北京索萊寶科技公司），細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司），免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。IX51型倒置顯微鏡、Eppendorf低速離心機、BX53熒光顯微鏡（日本Olymbus公司），尼康E100型生物顯微鏡（日本Nikon公司），酶標儀（美國熱電公司），流式細胞儀（美國BD公司）。
1.2 RRVEC培養及鑒定
實驗動物使用遵循國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。參照文獻[15]的方法進行細胞分離培養。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，脫頸處死，頭部常規消毒后完整摘除眼球，75%乙醇浸泡30 s，取出后放入含200 U/ml青霉素和鏈霉素的冰磷酸鹽緩沖液（PBS）中清洗3遍，洗凈血污后置于含有冰PBS紗布的培養皿中，獲取視網膜組織并剪碎，直接加入培養液進行培養。使用0.1% Ⅰ型膠原酶將視網膜組織置于37 ℃條件下消化30 min，吸收消化液，再經網孔100 μm的兩層不銹鋼細胞篩網過濾，收集洗脫液，室溫下以離心半徑13 cm、轉速1500 r/m離心5 min，去除上清液。取離心后的沉淀物加入含有肝素鈉、胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基，接種于24孔培養板上，然后放入37 ℃、5%CO2培養箱中培養，定期換液。
取第4代近融合的RRVEC以密度1×104個/ml接種在預先涂有明膠的蓋玻片上，繼續培養24 h，待細胞貼壁后將蓋玻片取出，采用免疫細胞熒光染色法鑒定細胞，并對內皮細胞的特異性標志物vWF的表達進行檢測。陰性對照組以PBS代替一抗，加入Cy3二抗工作液37 ℃孵育顯色。熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。以Cy3發出紅色熒光為陽性表達。
1.3 細胞分組及流式細胞儀、蛋白免疫印跡法（Western blot）、免疫組織化學染色檢測
將RRVEC分為對照組、高糖組和姜黃素干預組。對照組細胞正常培養。高糖組細胞經30 mmol/L的葡萄糖培養。干預組細胞經30 mmol/L的葡萄糖培養24 h后，再加入30 μmol/L的姜黃素處理24 h。
采用流式細胞儀檢測各組RRVEC中ROS相對含量。將各組細胞制成單細胞懸液，以細胞密度2×105個/孔均勻接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養過夜。用不含乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化細胞，終止消化后收集，離心去上清液，用PBS將細胞潤洗2次。按照細胞ROS檢測試劑盒操作說明進行，流式細胞儀檢測。
采用Western blot檢測各組RRVEC中Bcl-2、Bax的蛋白表達。提取總蛋白及檢測目的蛋白，將PBS稀釋過的蛋白樣品及標準蛋白分別加入96孔板內，標準品各設2個平行孔，待測樣品設3個平行孔，每孔加入體積20 μl。加入PBS的2個平行孔為空白對照。按50:1比例將BCA蛋白濃度測定試劑盒中A液和B液進行混合，將混合液加入96孔板內，每孔加入200 μl，37 ℃避光孵育30 min。用酶標儀測定波長568 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。根據標準蛋白濃度和相應的A值計算直線回歸方程，根據蛋白樣品A值，利用回歸方程計算樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清與5倍蛋白上樣緩沖液放入沸水中進行沸水浴10 min，進行蛋白變性。參照文獻[16]的方法進行電泳、轉膜，膜封閉，添加一抗4 ℃孵育過夜（GAPDH：1:1000；Bcl-2：1:2000；Bax：1:5000）。洗膜5～6次后添加相應二抗。洗膜后，以化學發光法顯影、定影，并沖洗膠片。應用BandScan分析膠片灰度值，重復實驗3次。
參考文獻[17]的方法采用免疫組織化學染色法檢測各組RRVEC中NF-κB p65的蛋白表達。取出細胞爬片，PBS沖洗3次，分別滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗體，按霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學染色試劑盒說明進行操作。以細胞質呈黃色或棕黃色染色為陽性細胞。每張切片選擇10個高倍視野，顯微鏡下觀察并照相，采用數碼圖像分析系統進行分析。以陽性細胞的平均A值計算目的蛋白的相對表達量。
采用流式細胞儀分析各組RRVEC的凋亡情況。將各組細胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培養72 h收集細胞，制備單細胞懸液，用PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×105個/L，制成單個細胞懸液，每樣本加入5 μl膜聯蛋白和1 μl碘化丙啶工作液，室溫下避光孵育15 min，孵育完成后再加入400 μl的膜聯蛋白結合緩沖液，流式細胞儀進行分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析。數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，細胞凋亡率以百分數表示；其他實驗數據以均數±標準差（
）表示。組間均數經Levene檢驗方差齊性，采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差法 t 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
分離得到的RRVEC在1周后呈鋪路石樣單層貼壁生長。培養獲得的細胞vWF表達呈強陽性（圖1）。
圖1
RRVEC倒置相差顯微鏡及免疫熒光顯微鏡像。1A. 倒置相差顯微鏡像，培養1周的RRVEC呈鋪路石樣生長 標尺：100 μm；1B. 免疫熒光顯微鏡像，vWF免疫熒光染色細胞質呈紅色熒光 標尺：20 μm
對照組、高糖組及姜黃素干預組RRVEC中ROS相對含量比較，差異有統計學意義（F=40.957，P=0.000）。與對照組比較，高糖組RRVEC中ROS相對含量明顯增加，差異有統計學意義（t=8.677，P=0.000）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中ROS相對含量明顯降低，差異有統計學意義（t=6.568，P=0.000）（圖2A）。
圖2
各組RRVEC中ROS相對含量及細胞凋亡率比較。**P＜0.01
對照組、高糖組及姜黃素干預組RRVEC凋亡率比較，差異有統計學意義（F=325.137，P=0.000）。與對照組比較，高糖組RRVEC凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（t=25.500，P=0.000）。姜黃素干預組RRVEC凋亡率較高糖組明顯降低，差異有統計學意義（t=12.818，P=0.000）；但仍較對照組升高，差異有統計學意義（t=12.682，P=0.000）（圖2B）。
圖3
各組RRVEC中NF-κBp65蛋白表達比較。*P＜0.05；**P＜0.01
對照組RRVEC細胞質NF-κB p65蛋白呈陽性表達；高糖組RRVEC細胞核和細胞質均可見NF-κB p65蛋白呈強陽性表達；姜黃素干預組RRVEC細胞核和細胞質均可見NF-κB p65蛋白呈陽性表達。與對照組比較，高糖組RRVEC中NF-κB p65蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（t=8.322，P＜0.01）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中NF-κB p65蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（t=2.577，P＜0.05）（圖3）。
圖4
各組RRVEC中Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表達比較。*P＜0.05；**P＜0.01
與對照組比較，高糖組RRVEC中Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統計學意義（t=4.362、3.813、6.449，P=0.005、0.009、0.001）。與高糖組比較，姜黃素干預組RRVEC中Bcl-2蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義（t=2.148，P=0.075）；Bax蛋白表達明顯降低（t=3.059，P=0.022），Bcl-2/Bax比值明顯升高（t=3.831，P=0.009），差異均有統計學意義（圖4）。
3 討論
本研究經預實驗篩選出葡萄糖及姜黃素對RRVEC增生影響的最佳濃度為30 mmol/L、30 μmol/L。進一步實驗結果顯示，30 mmol/L高糖作用RRVEC 24 h后細胞內即開始產生大量ROS，而經過30 μmol/L姜黃素作用24 h后，細胞內ROS相對含量顯著降低。說明姜黃素可以明顯抵抗高糖引起的氧化應激反應。而流式細胞儀檢測結果顯示，姜黃素對于氧化應激引起的RRVEC凋亡具有明顯的抑制作用，從細胞功能學角度證實姜黃素能夠保護RRVEC。
Bcl-2、Bax是細胞凋亡的重要相關基因。Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因，且NF-κB調控的下游基因包括Bcl-2、Bax。Bcl-2基因啟動子區含有NF-κB的結合位點，NF-κB能夠直接上調Bcl-2的表達或通過其他途徑促進Bcl-2的表達[18, 19]。為了進一步研究姜黃素抗氧化應激的具體分子機制，我們觀察了高糖作用于RRVEC中NF-κB p65、Bcl-2、Bax的蛋白表達變化。免疫組織化學染色觀察發現，高糖誘導RRVEC后，其細胞核中的NF-κB p65表達明顯升高，而細胞質中NF-κB p65表達降低。說明高糖誘導下，RRVEC細胞質內的NF-κB p65進入細胞核明顯增加，并發揮了轉錄活性；而在姜黃素的干預下，高糖誘導的RRVEC細胞質中NF-κB p65表達降低且進入細胞核明顯受到抑制。提示姜黃素能夠通過阻斷NF-κB信號通路抑制高糖引起的RRVEC氧化應激反應。我們通過Western blot檢測發現，經高糖誘導后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯降低；而姜黃素干預后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值明顯升高。RRVEC中NF-κB p65蛋白與Bcl-2、Bax蛋白表達以及Bcl-2/Bax比值變化的一致性說明高糖誘導RRVEC可激活NF-κB，進而引起Bcl-2蛋白表達降低、Bax蛋白表達升高。
本研究結果表明，姜黃素能夠抑制高糖引起的RRVEC中ROS的產生以及細胞凋亡的發生，其可能機制是抑制NF-κB表達，上調下游抑凋亡基因Bcl-2表達，下調促凋亡基因Bax表達。提示姜黃素能夠通過抑制NF-κB通路，對抗氧化應激從而起到保護視網膜血管內皮細胞的作用，而更確切深入的機制尚待進一步的分子生物學研究證實。
