引用本文： 謝黎, 羅毅, 王平, 馬蘭, 李娜, 謝琳暉. 氧誘導視網膜病變大鼠模型的全視野閃光視網膜電圖特征. 中華眼底病雜志, 2017, 33(2): 186-189. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.017 復制
早產兒視網膜病變（ROP）影響視網膜的發育及功能，早期影響視桿細胞，晚期影響視錐細胞[1-4]。這種持續的視網膜功能障礙即使在早期進行控制，其后期屈光不正尤其是近視的發生率仍然較高[5]。氧誘導視網膜病變（OIR）大鼠模型是目前模擬ROP的常用動物模型，其應用基礎源于新生大鼠發育不成熟的視網膜血管系統，與人類早產兒極其相似[6,7]。但OIR對大鼠視網膜功能的影響是否與ROP對早產兒視網膜功能的影響類似目前并不明確。為此，我們建立了OIR大鼠模型并對其全視野閃光視網膜電圖（F-ERG）特征進行了觀察，以評估OIR大鼠模型的視網膜功能特點，以便今后從動物實驗的角度更深入的探索ROP視網膜功能及發育特點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠4只，每只平均生育8～14只；新生SD大鼠24只；由湖南省斯萊克景達動物實驗有限公司提供。自制有機玻璃氧箱、測氧儀器（CY-12C，杭州艾普儀器設備有限公司）、眼底照相機（美國Volk公司）。
將24只新生大鼠采用簡單隨機方法分為實驗組和對照組。實驗組大鼠建立OIR模型。母鼠分娩后與新生大鼠置于自制氧箱中，接入100%濕潤醫用純氧氣，流量控制為0.50～0.75 L/min，氧倉內保持（75±2）%氧濃度。測氧儀全程監測，確保氧濃度恒定。氧箱中飼養7 d后再置于室內空氣中飼養7 d。日光照明，環境濕度控制為（23±2）℃。對照組大鼠與母鼠一并置于室內空氣中連續飼養14 d。每日更換輔料、飼料、水。用電子分析天平稱量體質量，觀察大鼠每天的體質量變化，同時記錄睜眼時間及大鼠毛發的發育情況等。新生大鼠平均5～7 d皮膚絨毛發育，13～14 d睜眼。兩組大鼠體質量變化相當（P＞0.05）。
大鼠14日齡時，兩組大鼠常規充分散大瞳孔后以0.03 ml/g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，眼底照相機觀察其眼底血管情況并照相。隨機抽取兩組各2只大鼠，于左心室心臟穿刺并注射墨汁處死。摘取雙眼眼球，置于4 g/L多聚甲醛中固定48 h。在解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體、玻璃體，將視網膜完整剝離置于載玻片上，以視盤為中心呈放射狀切開視網膜，滴500 ml/L甘油，光學顯微鏡下觀察視網膜血管。
大鼠21日齡時，由同一位經驗豐富的檢查者采用美國Espion視覺電生理系統對兩組大鼠行F-ERG檢查。刺激器為Ganzfeld全視野刺激器。記錄電極為自制Ag-AgCl環狀角膜電極，參考電極和接地電極分別為不銹鋼自制針狀電極，各電極自身阻抗均小于10 Ω。根據國際臨床視覺電生理委員會提出的國際標準化方案[8]并依據我院實驗室大鼠視網膜電圖（ERG）參數設置F-ERG刺激參數（表1）。記錄兩組大鼠雙眼F-ERG波形反應。大鼠暗適應24 h，以0.03 ml/g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常規散瞳5 min后0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液行雙眼眼表麻醉。于暗紅光條件下安放電極，記錄電極置于雙眼角鞏膜緣，參考電極置于雙耳后皮下，接地電極置于尾部。安放電極后再次暗適應5 min，依次記錄視桿反應b波及最大混合反應a、b波振幅與潛伏期。全視野刺激器白色背景光30 cd/m2下明適應20 min后記錄明適應視錐反應a、b波振幅與潛伏期。每個反應檢測2～3次，選取重復性好的結果進行記錄。觀察不同刺激光強度下的視桿反應、最大混合反應及視錐反應。
表1
SD大鼠F-ERG刺激參數
采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，正態計量資料用均數±標準差（ ）表示。兩組暗適應視桿反應、最大混合反應及明適應視錐反應的a、b波振幅和潛伏期的差異采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
眼底照相機及視網膜鋪片光學顯微鏡觀察發現，大鼠14日齡時，對照組大鼠眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；實驗組大鼠血管紆曲，眼底血管異常增生（圖1，2）。
圖1
兩組大鼠14日齡時彩色眼底像。1A. 對照組，眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；1B. 實驗組，眼底血管異常增生，血管紆曲明顯
圖2
兩組大鼠14日齡視網膜鋪片光學顯微鏡像。2A. 對照組，眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；2B. 實驗組，眼底血管異常增生，血管紆曲明顯
與對照組比較，實驗組大鼠視桿反應b波振幅降低（t=3.650）、潛伏期延長（t=2.410），差異均有統計學意義（P＜0.05）；最大混合反應a、b波振幅降低（t=3.333、2.562）、潛伏期延長（t=2.725、2.482），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3，表2）。實驗組與對照組大鼠視錐反應a、b波振幅（t=0.650、0.204）及潛伏期（t=0.422、0.076）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3）。
圖3
不同刺激光強度下兩組大鼠F-ERG暗適應反應波形比較
表2
兩組大鼠視桿反應b波及最大混合反應a、b波振幅、潛伏期比較（
）
表3
兩組大鼠視錐反應a、b波振幅、潛伏期比較（
）
0.001 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG反應波形幾乎無反應，0.010 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG可記錄到波形。隨著刺激光強度的增加，b波振幅增加，a波慢慢引出；在同等刺激光強度下，實驗組相對于對照組振幅降低。
3 討論
氧誘導視網膜缺血新生血管形成與ROP發生相似。當新生鼠在高濃度氧氣中飼養，其周邊視網膜血管發育受阻；當相對缺氧后，新生血管在周邊無血管區和血管化區之間產生[9]。本研究采用常規方式建立OIR模型，并于大鼠14日齡時應用眼底照相機及視網膜鋪片光學顯微鏡觀察發現，實驗組大鼠視網膜血管異常增生及血管紆曲明顯。證明OIR大鼠模型建立成功。
對于大多數物種來說，視網膜神經節細胞、視錐細胞、無長突細胞等在出生前的早期即已經發生分化，而視桿細胞、雙極細胞、Müller細胞發育較晚，視桿細胞外段在第21天發育成熟[10]。因此，我們在大鼠21日齡時進行F-ERG檢查。在ERG各反應中，暗適應視桿反應、最大混合反應和明適應視錐反應代表著光感受器細胞的功能。Liu等[11]對OIR大鼠進行ERG檢測，發現18日齡OIR大鼠的視網膜神經光感受器受到了影響，且血管與ERG參數無相關性。Fulton等[12]記錄25例ROP患兒的全視野ERG，發現其病變可能累及視桿光感受器，且損傷程度與病變程度平行。本研究結果顯示，實驗組大鼠暗適應視桿反應、最大混合反應各波形振幅均低于對照組，潛伏期較對照組延長。這說明OIR大鼠的視網膜功能較正常大鼠差。提示OIR對視桿細胞發育成熟和功能完善產生了較大影響。我們還發現，兩組大鼠明適應視錐反應振幅及潛伏期均無明顯差異。這說明OIR對視錐細胞影響小。我們分析認為，這很可能是因為大鼠視網膜發育模式與人類相似，視錐細胞發育成熟比視桿細胞要早，而OIR主要影響周邊視網膜，所以對視錐細胞影響小[7,10]。
我們運用不同的刺激光強度0.001、0.010、1.000、10.000、30.000 cd.s/m2分別對大鼠進行暗視反應刺激，結果發現在0.001 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG波形幾乎無反應，而在0.010 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG可記錄到波形，且隨著刺激光強度的增加，b波振幅越大；而在同等刺激光強度下，實驗組相對于對照組振幅降低。由此可知刺激光強度對OIR大鼠視桿細胞有影響，隨著刺激光強度的增加，b波振幅增加。這很可能與大鼠的視網膜生理發育有關。視桿細胞的生理發育過程包括視桿細胞外節（ROS）增長和視紫紅質含量的增高。哺乳類動物ROS是視網膜最后發育的結構[13]。未發育成熟的視網膜ROS較短且視紫紅質的含量也較低[14]。當光刺激視網膜時開始激活視紫紅質，然后進行一系列的光電化學反應。如果視紫紅質的含量低，光量子的俘獲也就較低。本研究的實驗對象為21日齡的OIR大鼠，相當于未成年，整個視網膜發育不成熟，所以對光的反應不敏感。另外SD大鼠為白化大鼠，視網膜色素上皮細胞內缺乏色素顆粒，增加了光在眼內的散射，使得光感受器細胞對光的敏感度下降也可能是原因之一。
本研究運用F-ERG對OIR大鼠進行了視網膜功能的評估，發現OIR影響了大鼠視桿細胞功能。刺激光強度對OIR大鼠有影響，隨著刺激光強度的增大OIR大鼠視桿反應b波振幅增加。但遺憾的是本研究沒有同時觀察OIR大鼠視網膜的結構改變。視網膜的功能與結構有著密切的聯系，但視網膜功能改變與其結構改變往往不一致。這值得今后研究加以完善。
早產兒視網膜病變（ROP）影響視網膜的發育及功能，早期影響視桿細胞，晚期影響視錐細胞[1-4]。這種持續的視網膜功能障礙即使在早期進行控制，其后期屈光不正尤其是近視的發生率仍然較高[5]。氧誘導視網膜病變（OIR）大鼠模型是目前模擬ROP的常用動物模型，其應用基礎源于新生大鼠發育不成熟的視網膜血管系統，與人類早產兒極其相似[6,7]。但OIR對大鼠視網膜功能的影響是否與ROP對早產兒視網膜功能的影響類似目前并不明確。為此，我們建立了OIR大鼠模型并對其全視野閃光視網膜電圖（F-ERG）特征進行了觀察，以評估OIR大鼠模型的視網膜功能特點，以便今后從動物實驗的角度更深入的探索ROP視網膜功能及發育特點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠4只，每只平均生育8～14只；新生SD大鼠24只；由湖南省斯萊克景達動物實驗有限公司提供。自制有機玻璃氧箱、測氧儀器（CY-12C，杭州艾普儀器設備有限公司）、眼底照相機（美國Volk公司）。
將24只新生大鼠采用簡單隨機方法分為實驗組和對照組。實驗組大鼠建立OIR模型。母鼠分娩后與新生大鼠置于自制氧箱中，接入100%濕潤醫用純氧氣，流量控制為0.50～0.75 L/min，氧倉內保持（75±2）%氧濃度。測氧儀全程監測，確保氧濃度恒定。氧箱中飼養7 d后再置于室內空氣中飼養7 d。日光照明，環境濕度控制為（23±2）℃。對照組大鼠與母鼠一并置于室內空氣中連續飼養14 d。每日更換輔料、飼料、水。用電子分析天平稱量體質量，觀察大鼠每天的體質量變化，同時記錄睜眼時間及大鼠毛發的發育情況等。新生大鼠平均5～7 d皮膚絨毛發育，13～14 d睜眼。兩組大鼠體質量變化相當（P＞0.05）。
大鼠14日齡時，兩組大鼠常規充分散大瞳孔后以0.03 ml/g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，眼底照相機觀察其眼底血管情況并照相。隨機抽取兩組各2只大鼠，于左心室心臟穿刺并注射墨汁處死。摘取雙眼眼球，置于4 g/L多聚甲醛中固定48 h。在解剖顯微鏡下去除角膜、晶狀體、玻璃體，將視網膜完整剝離置于載玻片上，以視盤為中心呈放射狀切開視網膜，滴500 ml/L甘油，光學顯微鏡下觀察視網膜血管。
大鼠21日齡時，由同一位經驗豐富的檢查者采用美國Espion視覺電生理系統對兩組大鼠行F-ERG檢查。刺激器為Ganzfeld全視野刺激器。記錄電極為自制Ag-AgCl環狀角膜電極，參考電極和接地電極分別為不銹鋼自制針狀電極，各電極自身阻抗均小于10 Ω。根據國際臨床視覺電生理委員會提出的國際標準化方案[8]并依據我院實驗室大鼠視網膜電圖（ERG）參數設置F-ERG刺激參數（表1）。記錄兩組大鼠雙眼F-ERG波形反應。大鼠暗適應24 h，以0.03 ml/g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，常規散瞳5 min后0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液行雙眼眼表麻醉。于暗紅光條件下安放電極，記錄電極置于雙眼角鞏膜緣，參考電極置于雙耳后皮下，接地電極置于尾部。安放電極后再次暗適應5 min，依次記錄視桿反應b波及最大混合反應a、b波振幅與潛伏期。全視野刺激器白色背景光30 cd/m2下明適應20 min后記錄明適應視錐反應a、b波振幅與潛伏期。每個反應檢測2～3次，選取重復性好的結果進行記錄。觀察不同刺激光強度下的視桿反應、最大混合反應及視錐反應。
表1
SD大鼠F-ERG刺激參數
采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，正態計量資料用均數±標準差（ ）表示。兩組暗適應視桿反應、最大混合反應及明適應視錐反應的a、b波振幅和潛伏期的差異采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
眼底照相機及視網膜鋪片光學顯微鏡觀察發現，大鼠14日齡時，對照組大鼠眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；實驗組大鼠血管紆曲，眼底血管異常增生（圖1，2）。
圖1
兩組大鼠14日齡時彩色眼底像。1A. 對照組，眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；1B. 實驗組，眼底血管異常增生，血管紆曲明顯
圖2
兩組大鼠14日齡視網膜鋪片光學顯微鏡像。2A. 對照組，眼底血管走行正常，未見明顯異常血管增生；2B. 實驗組，眼底血管異常增生，血管紆曲明顯
與對照組比較，實驗組大鼠視桿反應b波振幅降低（t=3.650）、潛伏期延長（t=2.410），差異均有統計學意義（P＜0.05）；最大混合反應a、b波振幅降低（t=3.333、2.562）、潛伏期延長（t=2.725、2.482），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3，表2）。實驗組與對照組大鼠視錐反應a、b波振幅（t=0.650、0.204）及潛伏期（t=0.422、0.076）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3）。
圖3
不同刺激光強度下兩組大鼠F-ERG暗適應反應波形比較
表2
兩組大鼠視桿反應b波及最大混合反應a、b波振幅、潛伏期比較（
）
表3
兩組大鼠視錐反應a、b波振幅、潛伏期比較（
）
0.001 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG反應波形幾乎無反應，0.010 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG可記錄到波形。隨著刺激光強度的增加，b波振幅增加，a波慢慢引出；在同等刺激光強度下，實驗組相對于對照組振幅降低。
3 討論
氧誘導視網膜缺血新生血管形成與ROP發生相似。當新生鼠在高濃度氧氣中飼養，其周邊視網膜血管發育受阻；當相對缺氧后，新生血管在周邊無血管區和血管化區之間產生[9]。本研究采用常規方式建立OIR模型，并于大鼠14日齡時應用眼底照相機及視網膜鋪片光學顯微鏡觀察發現，實驗組大鼠視網膜血管異常增生及血管紆曲明顯。證明OIR大鼠模型建立成功。
對于大多數物種來說，視網膜神經節細胞、視錐細胞、無長突細胞等在出生前的早期即已經發生分化，而視桿細胞、雙極細胞、Müller細胞發育較晚，視桿細胞外段在第21天發育成熟[10]。因此，我們在大鼠21日齡時進行F-ERG檢查。在ERG各反應中，暗適應視桿反應、最大混合反應和明適應視錐反應代表著光感受器細胞的功能。Liu等[11]對OIR大鼠進行ERG檢測，發現18日齡OIR大鼠的視網膜神經光感受器受到了影響，且血管與ERG參數無相關性。Fulton等[12]記錄25例ROP患兒的全視野ERG，發現其病變可能累及視桿光感受器，且損傷程度與病變程度平行。本研究結果顯示，實驗組大鼠暗適應視桿反應、最大混合反應各波形振幅均低于對照組，潛伏期較對照組延長。這說明OIR大鼠的視網膜功能較正常大鼠差。提示OIR對視桿細胞發育成熟和功能完善產生了較大影響。我們還發現，兩組大鼠明適應視錐反應振幅及潛伏期均無明顯差異。這說明OIR對視錐細胞影響小。我們分析認為，這很可能是因為大鼠視網膜發育模式與人類相似，視錐細胞發育成熟比視桿細胞要早，而OIR主要影響周邊視網膜，所以對視錐細胞影響小[7,10]。
我們運用不同的刺激光強度0.001、0.010、1.000、10.000、30.000 cd.s/m2分別對大鼠進行暗視反應刺激，結果發現在0.001 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG波形幾乎無反應，而在0.010 cd.s/m2刺激光強度下大鼠F-ERG可記錄到波形，且隨著刺激光強度的增加，b波振幅越大；而在同等刺激光強度下，實驗組相對于對照組振幅降低。由此可知刺激光強度對OIR大鼠視桿細胞有影響，隨著刺激光強度的增加，b波振幅增加。這很可能與大鼠的視網膜生理發育有關。視桿細胞的生理發育過程包括視桿細胞外節（ROS）增長和視紫紅質含量的增高。哺乳類動物ROS是視網膜最后發育的結構[13]。未發育成熟的視網膜ROS較短且視紫紅質的含量也較低[14]。當光刺激視網膜時開始激活視紫紅質，然后進行一系列的光電化學反應。如果視紫紅質的含量低，光量子的俘獲也就較低。本研究的實驗對象為21日齡的OIR大鼠，相當于未成年，整個視網膜發育不成熟，所以對光的反應不敏感。另外SD大鼠為白化大鼠，視網膜色素上皮細胞內缺乏色素顆粒，增加了光在眼內的散射，使得光感受器細胞對光的敏感度下降也可能是原因之一。
本研究運用F-ERG對OIR大鼠進行了視網膜功能的評估，發現OIR影響了大鼠視桿細胞功能。刺激光強度對OIR大鼠有影響，隨著刺激光強度的增大OIR大鼠視桿反應b波振幅增加。但遺憾的是本研究沒有同時觀察OIR大鼠視網膜的結構改變。視網膜的功能與結構有著密切的聯系，但視網膜功能改變與其結構改變往往不一致。這值得今后研究加以完善。
