半乳糖凝集素-1抑制劑OTX008對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管的抑制作用_《中華眼底病雜志》

作者：

楊寧 , 張雯茜 , 賀濤 ,  邢怡橋

430070 武漢大學人民醫院眼科中心;

關鍵詞：

視網膜新生血管化/預防和控制半乳糖凝集素1/拮抗劑和抑制劑動物實驗

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.016

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目的觀察半乳糖凝集素-1（Galectin-1）特異性抑制劑OTX008對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管（RNV）的抑制作用，并探討其作用機制。方法 7日齡C57BL/6J小鼠128只采用隨機數字表法隨機分為正常組、單純模型組、OTX008干預組和磷酸鹽緩沖液（PBS）空白對照組，每組32只。正常組小鼠在正常氧環境下飼養；其余3組小鼠建立氧誘導視網膜病變模型。小鼠12日齡時，OTX008干預組小鼠雙眼按0.25 μg/μl的劑量玻璃體腔注射OTX008 1 μl，PBS空白對照組注射等體積PBS。正常組及單純模型組小鼠不做其他任何干預和處理。小鼠17日齡時，各組作視網膜冰凍切片并行免疫熒光染色，定性觀察Galectin-1蛋白的分布情況；作視網膜組織石蠟切片并行蘇木精-伊紅染色，計數突破內界膜的血管內皮細胞核；作全視網膜鋪片并行免疫熒光染色，觀察視網膜血管變化并統計RNV區、無灌注區、缺氧區面積；采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Galectin-1、神經纖毛蛋白質-1（Neuropilin-1）、磷酸化血管內皮生長因子受體2（pVEGFR2）的蛋白相對表達量。結果與正常組比較，單純模型組、PBS空白對照組小鼠視網膜Galectin-1蛋白熒光在視網膜神經節細胞層、內叢狀層及內核層明顯增強；OTX008干預組小鼠視網膜Galectin-1蛋白熒光較單純模型組、PBS空白對照組明顯減弱。單純模型組、PBS空白對照組小鼠視網膜中突破內界膜的血管內皮細胞核計數較正常組明顯增加，差異有統計學意義（t=9.314，P＜0.05）；OTX008干預組小鼠視網膜中突破內界膜的血管內皮細胞核計數較單純模型組、PBS空白對照組明顯下降，差異有統計學意義（t=8.038、7.774，P＜0.05）。與單純模型組、PBS空白對照組比較，OTX008干預組小鼠RNV區（t=13.250、12.570）、無灌注區（t=15.590、12.430）和缺氧區（t=9.542、9.928）面積明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，與單純模型組及PBS空白對照組相比，OTX008干預組小鼠視網膜Galectin-1（t=24.800、23.060）、Neuropilin-1（t=4.120、3.530）、pVEGFR2（t=25.880、15.480）蛋白相對表達量明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 Galectin-1特異性抑制劑OTX008可抑制氧誘導RNV形成，降低視網膜組織缺氧。其機制可能與抑制Galectin-1表達，減少Galectin-1與Neuropilin-1結合，降低pVEGFR2表達有關。

引用本文： 楊寧, 張雯茜, 賀濤, 邢怡橋. 半乳糖凝集素-1抑制劑OTX008對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管的抑制作用. 中華眼底病雜志, 2017, 33(2): 181-185. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.016 復制

視網膜組織缺血缺氧可誘發視網膜新生血管（RNV）形成，但其作用機制尚未完全闡明^[1-3]。半乳糖凝集素-1（Galectin-1）定位于細胞核、細胞漿和細胞外間隙，在細胞增生、細胞凋亡、免疫調控和新生血管形成等病理生理進程中發揮作用^[4-6]。現已有較多研究表明，Galectin-1與腫瘤新生血管形成存在密切聯系，但其在眼部新生血管中的作用尚不明確^[7-9]。OTX008作為新一代Galectin-1選擇性小分子抑制劑，已被證實可特異性抑制Galectin-1蛋白表達，并具有下調腫瘤細胞遷移、侵襲和腫瘤新生血管形成等作用^[10]。本研究通過玻璃體腔注射OTX008干預氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠模型，探討OTX008對RNV形成的抑制作用及機制。現將結果報道如下。

1 材料和方法

7日齡C57BL/6J幼鼠128只，雌雄不限，由武漢大學A3實驗動物中心提供（動物許可證號：SCXK鄂2014-0004）。采用隨機數字表法將小鼠分為正常組、單純模型組、OTX008干預組、磷酸鹽緩沖液（PBS）空白對照組，每組32只。正常組小鼠在正常氧環境下飼養；其余3組小鼠置于（75±2）%的密閉氧箱內，測氧儀每日檢測氧箱中氧氣濃度。飼養5 d后取出氧箱，建立OIR模型^[11,12]。小鼠12日齡時，OTX008干預組小鼠于角鞏緣后0.5 mm處用配有33G針頭的微量注射器（美國Hamilton公司）對雙眼進行玻璃體腔注射0.25 μg/μl的OTX008（美國QCC公司）1 μl；PBS空白對照組小鼠采用同樣給藥方式注射等體積PBS。正常組和單純模型組小鼠不做其他任何干預和處理。

小鼠17日齡時，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組分別取眼球10只行視網膜冰凍切片凍頭制作^[11]。冰凍切片機（CM1950，德國萊卡公司）將視杯視神經矢狀切成12 μm厚的冰凍切片，用Galectin-1一抗（美國R&D公司）和異硫氰酸熒光素（FITC）標記熒光二抗孵育，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育后封片，共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）觀察Galectin-1在視網膜組織上的熒光分布和變化情況。

小鼠17日齡時，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組分別取眼球10只，放入4%多聚甲醛溶液中4°固定24 h。常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，與視神經矢狀軸平行方向進行連續切片，厚度為5 μm。每只眼球取切片10張行蘇木精-伊紅（HE）染色，雙盲計數法在200倍光學顯微鏡下計數突破內界膜的血管內皮細胞核數目。

小鼠17日齡時，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組分別取眼球10只，去除眼前節后于4%多聚甲醛固定1 h，平鋪視網膜后于5%牛血清白蛋白封閉液中室溫封閉2 h，加入西非單葉豆凝集素IB4（1∶200，美國Invitrogen公司）及派莫唑侖缺氧探針Hypoxyprobe兔血清抗體（1∶100，美國Hypoxyprobe公司）。孵育3 d后，置于FITC標記的驢抗兔熒光二抗中孵育過夜，次日封片。熒光顯微鏡下觀察視網膜血管等變化。

小鼠17日齡時，頸椎脫臼法處死小鼠后摘除眼球，每組取24只小鼠的視網膜組織，提取蛋白質后，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測Galectin-1、神經纖毛蛋白質-1（Neuropilin-1）、磷酸化血管內皮生長因子受體2（pVEGFR2）的蛋白相對表達量。孵育Galectin-1（0.1 μg/ml，美國R&D公司）、Neuropilin-1（1∶1000，美國CST公司）、pVEGFR2（1∶500，美國CST公司）、β-肌動蛋白（β-actin，1∶1000，美國CST公司）等相應抗體后進行對應種屬辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，然后行顯色、顯影、定影。采用Image-J分析條帶灰度值，以β-actin矯正上樣誤差。

采用Graph Pad Prism 5.0統計學軟件進行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素和兩因素方差分析。組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

共聚焦顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜神經節細胞層（GCL）、內叢狀層（IPL）、內核層（INL）、外叢狀層（OPL）及外核層（ONL）的Galectin-1蛋白熒光均不明顯；單純模型組、PBS空白對照組小鼠視網膜GCL、IPL以及INL可見大量Galectin-1蛋白熒光；OTX008干預組小鼠視網膜各層Galectin-1蛋白熒光較單純模型組、PBS空白對照組弱（圖1）。

圖1 小鼠視網膜冰凍切片共聚焦顯微鏡像。1A. 正常組；1B. 單純模型組；1C. PBS空白對照組；1D. OTX008干預組。正常組小鼠視網膜各層Galectin-1蛋白熒光均不明顯；單純模型組、PBS空白對照組小鼠視網膜GCL、IPL、INL可見大量Galectin-1蛋白熒光；OTX008干預組小鼠視網膜各層Galectin-1蛋白熒光較單純模型組、PBS空白對照組弱 DAPI 標尺：50 μm

圖選項

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《中華眼底病雜志》

半乳糖凝集素-1抑制劑OTX008對氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管的抑制作用

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1 材料和方法

2 結果

3 討論

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