引用本文： 付金玲. Crumbs蛋白對斑馬魚視網膜不同種類光感受器細胞的影響. 中華眼底病雜志, 2017, 33(2): 172-175. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.014 復制
光感受器細胞進行性死亡是導致視網膜色素變性（RP）患者視力喪失的主要原因[1]。人類Crumbs（Crb）同系物-1（CRB1）基因突變可以導致RP和Leber先天性黑矇[2-7]。目前大多數CRB1致病突變發生在細胞外區域，表明CRB1能夠感知光感受器細胞維持的細胞外信號。脊椎動物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3種內源性視網膜Crb蛋白[8,9]。作為一種脊椎動物的模式生物，斑馬魚視網膜光感受器細胞由一種視桿細胞和對紫外光（UV）及紅綠藍光（RGB）敏感的4種視錐細胞構成[10]，在部分視網膜疾病的研究上具有獨特優勢[11-13]。我們利用通過抑制內源性Crb2b功能從而破壞光感受器之間黏附的Tg（RH2-2：Crb2b-sf-EX/ RH2-2：GFP）pt108b轉基因斑馬魚（pt108b斑馬魚）[14]，觀察內源性視網膜Crb蛋白對不同種類光感受器細胞的影響，從而為RP發病機制研究提供可能的動物模型。
1 材料和方法
AB野生型斑馬魚及pt108b斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環的恒溫魚房培育飼養。所有實驗步驟均遵循匹茲堡大學動物研究使用及飼養標準。將27個月齡老年野生型斑馬魚及相同月齡pt108b斑馬魚眼球固定于4%多聚甲醛，常溫過夜，梯度酒精脫水。將眼球標本和JB-4混合溶液放入JB-4包埋模具，參照JB-4包埋試劑盒（德國Polysciences公司）說明書進行包埋。超薄切片機（美國Thermo Electron公司）以3 μm厚度沿眼球腹-背及鼻-顳（前-后）兩個方向進行切割成完整視網膜（圖1，2）。收集通過眼球中央區域的3張連續切片，行福爾根染色[8]。光學顯微鏡觀察（BX60，日本奧林巴斯公司），SPOT RT照相機進行完整視網膜照相，SPOT4.6軟件（英國Diagnostic Instruments公司）進行分析。
圖1
斑馬魚眼球延腹-背及鼻-顳（前-后）兩個方向切割示意圖
圖2
27個月齡野生型斑馬魚眼球切割后光學顯微鏡像。2A. 經鼻-顳方向切割；2B. 經腹-背方向切割。可見完整視網膜 福爾根 標尺：50 μm
在三維空間中將沿兩個垂直方向切割染色后的完整視網膜各經36°平均分割為鼻周邊區、鼻中間區、中央區、顳中間區、顳周邊區、背周邊區、背中間區、腹中間區和腹周邊區9個區域。光學顯微鏡鏡下計數視桿細胞、UV視錐細胞、RGB視錐細胞3種類型光感受器細胞密度。細胞核計數區域為每個視網膜局部區域中央200 μm長度范圍。分別計算野生型斑馬魚及pt108b斑馬魚3張連續切片視網膜9個區域上述3種類型光感受器細胞密度的算數平均值（n=5）。
應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析處理。數據以均數±標準差（ ）表示，行配對t檢驗。α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，野生型斑馬魚3種類型光感受器細胞在中央區排列最為緊密，周邊區排列最為稀疏，鼻、顳、腹、背4個區域中央-中間-周邊方向細胞密度逐漸下降。視桿細胞核呈圓形，較視錐細胞核染色深，位于視網膜外核層基底部；UV視錐細胞核也呈圓形，但較視桿細胞核大且比視桿細胞染色淡，位于視桿細胞頂端部、外限制膜基底部；RGB視錐細胞核延頂端-基底方向伸長，較視桿細胞核染色淡，位于外限制膜頂端部（圖3）。
圖3
野生型斑馬魚視網膜組織光學顯微鏡像。視桿細胞核呈圓形、染色深；UV視錐細胞核呈圓形、染色淡（黑箭）；RGB視錐細胞核染色淡，位于外限制膜頂端部 福爾根 標尺：5 μm
與野生型斑馬魚比較，pt108b斑馬魚位于視網膜外核層頂部細長的RGB視錐細胞核密度明顯減少，中央區和中間區RGB視錐細胞幾乎完全消失（圖4，5）；細胞核呈圓形、淡染并稀疏分布）（圖4）。位于外核層基底部的視桿細胞核小呈圓形、染色深（圖4）。
圖4
pt108b斑馬魚視網膜組織光學顯微鏡像。UV視錐細胞核呈圓形、淡染并稀疏分布（黑箭）；視桿細胞核小呈圓形、染色深 福爾根 標尺：5 μm
圖5
野生型斑馬魚和pt108b斑馬魚視網膜組織不同區域光學顯微鏡像。5A～5E. 野生型斑馬魚；5F～5J. pt108b斑馬魚。pt108b斑馬魚位于視網膜外核層頂部細長的RGB視錐細胞核密度較野生型斑馬魚明顯減少，中央區和中間區RGB視錐細胞幾乎完全消失 福爾根 標尺：10 μm
與野生型斑馬魚比較，pt108b斑馬魚視網膜中央區RGB視錐細胞密度顯著下降，差異有統計學意義（P=0.7689）；UV視錐細胞密度差異無統計學意義變（P=0.000 01）；視桿細胞密度顯著增加，差異有統計學意義（P=0.000 2）（圖5，6）。
圖6
27個月齡野生型斑馬魚和同月齡pt108b斑馬魚視網膜中央區光感受器細胞密度比較。*P＜0.005
3 討論
由于脊椎動物視網膜體積大、形態彎曲，計數整個視網膜細胞數目較為困難，但可以通過系統抽樣局部視網膜區域的細胞密度研究在老化過程中或在疾病中視網膜細胞數目的變化趨勢。因此，本研究設計了一種簡單實用的方法評價在視網膜9個局部區域3種類型光感受器細胞密度的變化。雖然此種采樣策略并不能直接揭示視網膜細胞的總數，但能客觀評價年齡、區域和遺傳變異對視網膜細胞的影響。
作為一種脊椎動物的模式生物，斑馬魚在發育中與人具有很高的相似性。目前以斑馬魚模型研究視網膜的早期發育已經取得了較大進展[15]。脊椎動物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3種內源性視網膜Crb蛋白；而由于基因組的部分重復，斑馬魚存在Crb1、Crb2a、Crb2b、Crb3a和Crb3bCrb等5種內源性視網膜Crb蛋白[9,16]。斑馬魚Crb2a、Crb2b蛋白通過直接介導內節細胞間黏附來維持規律的視錐細胞馬賽克結構，而pt108b斑馬魚轉基因表達的Crb2b-sf-EX通過競爭性結合到內源性視網膜Crb蛋白的細胞外區域從而破壞Crb2a/Crb2b介導的內節黏附，繼而破壞規律的馬賽克結構[14]。
本研究結果顯示，27個月齡的老年pt108b斑馬魚視網膜中位于外核層頂端區域細長的細胞核顯著減少，取代細長細胞核的是一些稀疏分布、圓形淡染的細胞核，這些細胞核有別于位于外核層基底部小而圓形、深染的視桿細胞核。導致其形態變化的原因可能是由于在老年pt108b斑馬魚中RGB視錐細胞被選擇性地逐漸殺死，UV視錐細胞核遷移并占據RGB視錐細胞的位置；Crb2b-sf-EX的過度表達有選擇性地殺死RGB視錐細胞，UV視錐細胞核向頂部遷移并駐留在外限制膜的頂端。本研究同時比較了Crb功能受到抑制的老年pt108b斑馬魚與同月老年野生型斑馬魚視網膜中央區不同類型光感受器細胞的密度。選擇視網膜中央區作為代表區域是因為斑馬魚視網膜中央區細胞出現最早，是評估年齡對細胞密度影響的最佳區域。結果發現，pt108b斑馬魚RGB視錐細胞密度大幅度減少，UV視錐細胞密度幾乎不變；視桿細胞密度大幅度增多。視桿細胞密度增多考慮是由于斑馬魚視網膜具有獨特的自我修復能力[17]，視錐細胞死亡可以直接刺激與之緊密相鄰的視桿細胞增生。
Crb蛋白能夠影響斑馬魚視網膜不同種類光感受器細胞的密度。研究Crb功能受到抑制對斑馬魚視網膜不同種類光感受器細胞的影響為RP提供動物模型，有助于進一步揭示RP的發病機制；研究Crb2b在斑馬魚視網膜再生中的作用有望恢復人類光感受器細胞的自我修復能力，從而為RP提供有效的治療方法。
志謝 感謝衛翔云教授提供實驗指導，鄒鍵提供技術支持
讀者?作者?編者 關于中華醫學會系列雜志指南共識類文章撰寫與發表的推薦規范 制定和推廣臨床指南是當前規范醫療衛生服務的重要舉措，為保證臨床指南制定的科學、公正和權威，以及使臨床指南適應于我國國情，從而更好地發揮指導作用，中華醫學會雜志社對指南共識類文章的撰寫與發表推薦規范如下。 1 指南共識類文章的撰寫 指南共識類文章指具有學術權威性的指導類文章，包括指南、標準、共識、專家建議、草案等。擬在中華醫學會系列雜志發表的指南共識類文章，需具備以下條件：（1）有明確的應用范圍和目的；（2）制定方為該學科學術代表群體，權益相關各方均有合理參與；（3）有科學的前期研究鋪墊，有循證醫學證據支持，制定過程嚴謹規范，文字表述明確，選題有代表性；（4）內容經過充分的專家論證與臨床檢驗，應用性強；（5）制定者與出版者具有獨立性，必要時明確告知讀者利益沖突情況；（6）制定者提供內容和文字經過審核的終稿。 2 指南共識類文章的發表 （1）指南共識類文章宜在符合其報道范圍和讀者定位的相關學術期刊上發表；（2）不同期刊可共同決定同時或聯合發表某篇指南，版式可有所不同，但內容必須一致；（3）指南類文章二次發表應遵循《關于中華醫學會系列雜志論文二次發表的推薦規范》。 關于縮略語使用的要求 文中盡量少用縮略語。已被公知公認的縮略語可以不加注釋直接使用。例如：DNA、RNA等。不常用的、尚未被公知公認的縮略語以及原詞過長、在文中多次出現者，若為中文可于文中第一次出現時寫出全稱，在圓括號內寫出縮略語；若為外文可于文中第一次出現時寫出中文全稱，在圓括號內寫出其外文縮略語。例如：流行性腦脊髓膜炎（流腦），高度近視圓頂狀黃斑（DSM）。再次出現時方可直接使用其縮略語。不超過4個漢字的名詞不宜使用縮略語，以免影響論文的可讀性。外文縮略語不得拆開轉行。文題中不能使用縮略語。 中華醫學會雜志社
光感受器細胞進行性死亡是導致視網膜色素變性（RP）患者視力喪失的主要原因[1]。人類Crumbs（Crb）同系物-1（CRB1）基因突變可以導致RP和Leber先天性黑矇[2-7]。目前大多數CRB1致病突變發生在細胞外區域，表明CRB1能夠感知光感受器細胞維持的細胞外信號。脊椎動物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3種內源性視網膜Crb蛋白[8,9]。作為一種脊椎動物的模式生物，斑馬魚視網膜光感受器細胞由一種視桿細胞和對紫外光（UV）及紅綠藍光（RGB）敏感的4種視錐細胞構成[10]，在部分視網膜疾病的研究上具有獨特優勢[11-13]。我們利用通過抑制內源性Crb2b功能從而破壞光感受器之間黏附的Tg（RH2-2：Crb2b-sf-EX/ RH2-2：GFP）pt108b轉基因斑馬魚（pt108b斑馬魚）[14]，觀察內源性視網膜Crb蛋白對不同種類光感受器細胞的影響，從而為RP發病機制研究提供可能的動物模型。
1 材料和方法
AB野生型斑馬魚及pt108b斑馬魚在14 h光照/10 h黑暗交替循環的恒溫魚房培育飼養。所有實驗步驟均遵循匹茲堡大學動物研究使用及飼養標準。將27個月齡老年野生型斑馬魚及相同月齡pt108b斑馬魚眼球固定于4%多聚甲醛，常溫過夜，梯度酒精脫水。將眼球標本和JB-4混合溶液放入JB-4包埋模具，參照JB-4包埋試劑盒（德國Polysciences公司）說明書進行包埋。超薄切片機（美國Thermo Electron公司）以3 μm厚度沿眼球腹-背及鼻-顳（前-后）兩個方向進行切割成完整視網膜（圖1，2）。收集通過眼球中央區域的3張連續切片，行福爾根染色[8]。光學顯微鏡觀察（BX60，日本奧林巴斯公司），SPOT RT照相機進行完整視網膜照相，SPOT4.6軟件（英國Diagnostic Instruments公司）進行分析。
圖1
斑馬魚眼球延腹-背及鼻-顳（前-后）兩個方向切割示意圖
圖2
27個月齡野生型斑馬魚眼球切割后光學顯微鏡像。2A. 經鼻-顳方向切割；2B. 經腹-背方向切割。可見完整視網膜 福爾根 標尺：50 μm
在三維空間中將沿兩個垂直方向切割染色后的完整視網膜各經36°平均分割為鼻周邊區、鼻中間區、中央區、顳中間區、顳周邊區、背周邊區、背中間區、腹中間區和腹周邊區9個區域。光學顯微鏡鏡下計數視桿細胞、UV視錐細胞、RGB視錐細胞3種類型光感受器細胞密度。細胞核計數區域為每個視網膜局部區域中央200 μm長度范圍。分別計算野生型斑馬魚及pt108b斑馬魚3張連續切片視網膜9個區域上述3種類型光感受器細胞密度的算數平均值（n=5）。
應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析處理。數據以均數±標準差（ ）表示，行配對t檢驗。α=0.05。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，野生型斑馬魚3種類型光感受器細胞在中央區排列最為緊密，周邊區排列最為稀疏，鼻、顳、腹、背4個區域中央-中間-周邊方向細胞密度逐漸下降。視桿細胞核呈圓形，較視錐細胞核染色深，位于視網膜外核層基底部；UV視錐細胞核也呈圓形，但較視桿細胞核大且比視桿細胞染色淡，位于視桿細胞頂端部、外限制膜基底部；RGB視錐細胞核延頂端-基底方向伸長，較視桿細胞核染色淡，位于外限制膜頂端部（圖3）。
圖3
野生型斑馬魚視網膜組織光學顯微鏡像。視桿細胞核呈圓形、染色深；UV視錐細胞核呈圓形、染色淡（黑箭）；RGB視錐細胞核染色淡，位于外限制膜頂端部 福爾根 標尺：5 μm
與野生型斑馬魚比較，pt108b斑馬魚位于視網膜外核層頂部細長的RGB視錐細胞核密度明顯減少，中央區和中間區RGB視錐細胞幾乎完全消失（圖4，5）；細胞核呈圓形、淡染并稀疏分布）（圖4）。位于外核層基底部的視桿細胞核小呈圓形、染色深（圖4）。
圖4
pt108b斑馬魚視網膜組織光學顯微鏡像。UV視錐細胞核呈圓形、淡染并稀疏分布（黑箭）；視桿細胞核小呈圓形、染色深 福爾根 標尺：5 μm
圖5
野生型斑馬魚和pt108b斑馬魚視網膜組織不同區域光學顯微鏡像。5A～5E. 野生型斑馬魚；5F～5J. pt108b斑馬魚。pt108b斑馬魚位于視網膜外核層頂部細長的RGB視錐細胞核密度較野生型斑馬魚明顯減少，中央區和中間區RGB視錐細胞幾乎完全消失 福爾根 標尺：10 μm
與野生型斑馬魚比較，pt108b斑馬魚視網膜中央區RGB視錐細胞密度顯著下降，差異有統計學意義（P=0.7689）；UV視錐細胞密度差異無統計學意義變（P=0.000 01）；視桿細胞密度顯著增加，差異有統計學意義（P=0.000 2）（圖5，6）。
圖6
27個月齡野生型斑馬魚和同月齡pt108b斑馬魚視網膜中央區光感受器細胞密度比較。*P＜0.005
3 討論
由于脊椎動物視網膜體積大、形態彎曲，計數整個視網膜細胞數目較為困難，但可以通過系統抽樣局部視網膜區域的細胞密度研究在老化過程中或在疾病中視網膜細胞數目的變化趨勢。因此，本研究設計了一種簡單實用的方法評價在視網膜9個局部區域3種類型光感受器細胞密度的變化。雖然此種采樣策略并不能直接揭示視網膜細胞的總數，但能客觀評價年齡、區域和遺傳變異對視網膜細胞的影響。
作為一種脊椎動物的模式生物，斑馬魚在發育中與人具有很高的相似性。目前以斑馬魚模型研究視網膜的早期發育已經取得了較大進展[15]。脊椎動物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3種內源性視網膜Crb蛋白；而由于基因組的部分重復，斑馬魚存在Crb1、Crb2a、Crb2b、Crb3a和Crb3bCrb等5種內源性視網膜Crb蛋白[9,16]。斑馬魚Crb2a、Crb2b蛋白通過直接介導內節細胞間黏附來維持規律的視錐細胞馬賽克結構，而pt108b斑馬魚轉基因表達的Crb2b-sf-EX通過競爭性結合到內源性視網膜Crb蛋白的細胞外區域從而破壞Crb2a/Crb2b介導的內節黏附，繼而破壞規律的馬賽克結構[14]。
本研究結果顯示，27個月齡的老年pt108b斑馬魚視網膜中位于外核層頂端區域細長的細胞核顯著減少，取代細長細胞核的是一些稀疏分布、圓形淡染的細胞核，這些細胞核有別于位于外核層基底部小而圓形、深染的視桿細胞核。導致其形態變化的原因可能是由于在老年pt108b斑馬魚中RGB視錐細胞被選擇性地逐漸殺死，UV視錐細胞核遷移并占據RGB視錐細胞的位置；Crb2b-sf-EX的過度表達有選擇性地殺死RGB視錐細胞，UV視錐細胞核向頂部遷移并駐留在外限制膜的頂端。本研究同時比較了Crb功能受到抑制的老年pt108b斑馬魚與同月老年野生型斑馬魚視網膜中央區不同類型光感受器細胞的密度。選擇視網膜中央區作為代表區域是因為斑馬魚視網膜中央區細胞出現最早，是評估年齡對細胞密度影響的最佳區域。結果發現，pt108b斑馬魚RGB視錐細胞密度大幅度減少，UV視錐細胞密度幾乎不變；視桿細胞密度大幅度增多。視桿細胞密度增多考慮是由于斑馬魚視網膜具有獨特的自我修復能力[17]，視錐細胞死亡可以直接刺激與之緊密相鄰的視桿細胞增生。
Crb蛋白能夠影響斑馬魚視網膜不同種類光感受器細胞的密度。研究Crb功能受到抑制對斑馬魚視網膜不同種類光感受器細胞的影響為RP提供動物模型，有助于進一步揭示RP的發病機制；研究Crb2b在斑馬魚視網膜再生中的作用有望恢復人類光感受器細胞的自我修復能力，從而為RP提供有效的治療方法。
志謝 感謝衛翔云教授提供實驗指導，鄒鍵提供技術支持
讀者?作者?編者 關于中華醫學會系列雜志指南共識類文章撰寫與發表的推薦規范 制定和推廣臨床指南是當前規范醫療衛生服務的重要舉措，為保證臨床指南制定的科學、公正和權威，以及使臨床指南適應于我國國情，從而更好地發揮指導作用，中華醫學會雜志社對指南共識類文章的撰寫與發表推薦規范如下。 1 指南共識類文章的撰寫 指南共識類文章指具有學術權威性的指導類文章，包括指南、標準、共識、專家建議、草案等。擬在中華醫學會系列雜志發表的指南共識類文章，需具備以下條件：（1）有明確的應用范圍和目的；（2）制定方為該學科學術代表群體，權益相關各方均有合理參與；（3）有科學的前期研究鋪墊，有循證醫學證據支持，制定過程嚴謹規范，文字表述明確，選題有代表性；（4）內容經過充分的專家論證與臨床檢驗，應用性強；（5）制定者與出版者具有獨立性，必要時明確告知讀者利益沖突情況；（6）制定者提供內容和文字經過審核的終稿。 2 指南共識類文章的發表 （1）指南共識類文章宜在符合其報道范圍和讀者定位的相關學術期刊上發表；（2）不同期刊可共同決定同時或聯合發表某篇指南，版式可有所不同，但內容必須一致；（3）指南類文章二次發表應遵循《關于中華醫學會系列雜志論文二次發表的推薦規范》。 關于縮略語使用的要求 文中盡量少用縮略語。已被公知公認的縮略語可以不加注釋直接使用。例如：DNA、RNA等。不常用的、尚未被公知公認的縮略語以及原詞過長、在文中多次出現者，若為中文可于文中第一次出現時寫出全稱，在圓括號內寫出縮略語；若為外文可于文中第一次出現時寫出中文全稱，在圓括號內寫出其外文縮略語。例如：流行性腦脊髓膜炎（流腦），高度近視圓頂狀黃斑（DSM）。再次出現時方可直接使用其縮略語。不超過4個漢字的名詞不宜使用縮略語，以免影響論文的可讀性。外文縮略語不得拆開轉行。文題中不能使用縮略語。 中華醫學會雜志社
