引用本文： 范圍, 熊祥偉, 鄒歡, 張聰, 袁容娣. 2型糖尿病患者不同糖尿病視網膜病變時期角膜神經纖維損害觀察. 中華眼底病雜志, 2017, 33(2): 157-161. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.011 復制
近年來糖尿病引起的角膜神經病變（DCN）引起人們關注。通過活體共聚焦顯微鏡（IVCM）可以快速、無創地觀察角膜神經纖維的形態。眾多研究通過IVCM已經觀察到糖尿病患者DCN的普遍存在，并可作為糖尿病周圍神經病變的評價及預測指標[1-3]。但目前并沒有明確的DCN量化標準及診斷分期標準，而角膜共聚焦顯微鏡在我國也未廣泛普及應用，導致DCN容易忽視和漏診。已有研究表明，糖尿病神經并發癥和微血管并發癥有密切相關性，高糖糖化作用、氧自由基作用、多元醇蓄積等多種致病機制均參與兩者的發病過程[4-6]。微血管損害標志可以作為糖尿病自主神經病變以及周圍神經病變強烈預測指標[7,8]。因此，糖尿病眼部并發癥DR與DCN之間是否具有顯著相關性值得進一步研究。本研究利用IVCM觀察了處于不同時期DR患者的角膜神經纖維損害情況，以此為探討DCN與DR的相關性提供參考。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為經醫院倫理委員會批準的橫斷面觀察性研究。2015年10月至2016年5月在第三軍醫大學新橋醫院眼科就診的2型糖尿病患者120例（糖尿病組）納入本研究。所有患者均符合2型糖尿病的診斷標準[9]。所有患者均行裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡和眼底彩色照相檢查，其中33例同時行熒光素眼底血管造影檢查。采用隨機數字表法隨機選取患者1只眼納入研究。按照2002年DR國際臨床分級標準[10]將糖尿病組患者分為無視網膜病變（NDR，圖1A）、輕中度非增生型DR（mNPDR，圖1B）、重度非增生型DR（sNPDR，圖1C）及增生型DR（PDR，圖1D），并以此分為4個亞組，每亞組30例30只眼。同時選取我院健康體檢者30名30只眼作為對照組。排除標準：（1）有眼部外傷、手術史；（2）有角膜接觸鏡佩戴史；（3）急慢性眼部炎癥；（4）嚴重干眼或瞼板腺功能障礙；（5）青光眼；（6）屈光度大于±6.00 D；（6）其他可能引起角膜病變的全身性疾病。糖尿病組及對照組受檢者年齡（F=1.960，P=0.104）、性別（χ2=8.232，P=0.083）比較，差異均無統計學意義。糖尿病組各亞組患者糖尿病病程比較，差異有統計學意義（χ2=13.615，P=0.003）；糖化血紅蛋白（HbA1c）比較，差異無統計學意義（χ2=7.624，P=0.054）（表1）。
圖1
糖尿病組各亞組患者彩色眼底像。1A. NDR組，未見明顯微血管病變；1B. mNPDR組，可見少許微血管瘤；1C. sNPDR，可見視網膜1個象限內多個出血點；1D. PDR組，可見玻璃體積血及視網膜前出血
表1
各組受檢者基本資料比較
所有受檢者均行HRT3激光IVCM（德國Heidelberg 公司）檢查。激光波長670 nm，放大倍率為800倍，橫向分辨率為1 μm。每幅圖像大小384×384像素，相當于400 μm×400 μm角膜的面積。選取掃描區域為角膜瞳孔區的上皮基底下神經纖維叢（SBP），掃描深度約30～90 μm。每只眼選取5張不同位置的清晰圖像，應用Image-Pro Plus 6.0軟件對角膜神經進行描圖后計算分析，最后取5張圖像數據的平均值。所有檢查均由同一檢查者完成。觀察分析角膜神經纖維長度（NFL）、角膜神經纖維密度（NFD）、角膜神經纖維分支密度（NFB）、角膜神經彎曲度（NT）。NFL為單位面積內神經纖維主干及所有分支的總長度；NFD為單位面積內神經纖維主干數量；NFB為單位面積內神經纖維分支數量；NT根據角膜神經方向改變的頻率和幅度進行評分[11,12]。NT評分：0分：神經纖維基本呈直線；1分：神經纖維稍有彎曲；2分：神經纖維中度彎曲，有頻繁方向變化的神經纖維，但均是小幅度變化；3分：神經纖維明顯彎曲，纖維方向變化幅度較大；4分：神經纖維非常彎曲，表現為突然和頻繁的纖維方向改變。
采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。正態分布資料采用均數±標準差（ ）表示，偏態分布資料采用M（QR）表示。各組受檢者之間性別比較采用列聯表χ2檢驗；各組受檢者之間年齡比較采用單因素方差分析；各組受檢者之間角膜神經指標比較采用單因素方差分析多重比較；糖尿病組各亞組患者之間病程、HbA1c比較采用Kruskal-Wallis檢驗。角膜神經指標與年齡、糖尿病病程、HbA1c的相關性采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
激光IVCM檢查發現，隨DR程度逐漸加重，患眼角膜神經纖維數量及密度減少，神經纖維走形變得紆曲、不規則（圖2）。
圖2
糖尿病組各亞組患者激光IVCM檢查像。2A. NDR組；2B. mNPDR組；2C. sNPDR；2D. PDR組。隨DR程度逐漸加重，角膜神經纖維數量及密度減少，神經纖維走形變得紆曲、不規則
與對照組比較，糖尿病組患者NFL、NFD、NFB減少（F=147.315、142.586、65.898，P=0.000、0.000、0.000），NT增加（F=39.431，P=0.000），差異均有統計學意義。糖尿病組患者NFL、NFD、NFB隨DR嚴重程度逐漸減少，NT隨DR嚴重程度逐漸增加。糖尿病組各亞組組間兩兩比較，sNPDR組與PDR組患者NFL、NFD、NFB、NT之間的差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組患者NFL、NFD、NFB、NT之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組受檢者角膜神經觀察指標比較。3A.NFL；3B.NFD；3C.NFB；3D.NT。*P＞0.05；其余各組間兩兩比較，P＜0.05
相關性分析結果顯示，年齡（r=－0.071、－0.080、0.001、0.100，P=0.391、0.328、0.991、0.224）、HbA1c（r=－0.109、－0.115、－0.126、0.025，P=0.238、0.211、0.169、0.781）與NFL、NFD、NFB、NT均無相關性；糖尿病病程與NFL、NFD呈負相關（r=－0.212、－0.264，P=0.020、0.004），與NT呈正相關（r=0.261，P=0.004），與NFB無相關性（r=－0.119 ，P=0.194）。
3 討論
本研究結果顯示，糖尿病組患者NFL、NFD、NFB均較對照組減少，NT增加。表明糖尿病患者的角膜神經在數量上和形態上均發生改變。我們還發現，從NDR到PDR，NFL、NFD和NFB呈逐漸減少的趨勢，而NT呈逐漸增加的趨勢。據此我們認為，DCN與DR在臨床病程上是具有顯著的相關性。在此基礎上，通過判斷DR的病變程度可能預測角膜神經的狀態；相反，如果在屈光間質不清楚或眼底檢查困難的情況下，通過IVCM量化角膜神經也可能預測DR的嚴重程度。我們在NDR組中也發現了角膜神經NFL、NFD和NFB較對照組減少，NT較對照組增加。Zhivov等[13]和Petropoulos等[14]也有類似的研究結果。這意味著糖尿病患者角膜神經病變可能比微血管病變發生更早，但這還需要進一步研究證實。另外，我們并沒有發現sNPDR組和PDR組角膜神經各項指標存在差異。這說明當DR發展到晚期，角膜神經的損害可能會進展得比較緩慢。但在非增生型DR中，mNPDR組與sNPDR組角膜神經損害是存在顯著差異的。de Cillà等[15]發現，DR患者行全視網膜激光光凝治療眼比未治療眼角膜上皮下神經叢出現33%的神經丟失。Bouheraoua等[16]還發現在視網膜脫離復位手術中行360°激光光凝治療后也會出現角膜神經的丟失。他們均認為激光光凝會造成睫狀短神經的熱損傷。因此，DR發展至sNPDR期，需要十分重視角膜的保護，因為激光光凝、手術等治療可能進一步加重角膜神經的損害。
我們發現，DCN與年齡、HbA1c并沒有顯著相關性。Erie等[17]在正常人群中也未發現年齡與角膜神經密度相關。而HbA1c僅代表近期3個月內的血糖情況，這也表明DCN是一個慢性進展的過程，短期血糖變化不足以引起角膜神經的變化。我們還發現，NFL、NFD與糖尿病病程呈負相關，NT與糖尿病病程呈正相關，但相關系數值較小。這可能是因為患者主觀描述的病程與患者實際病程往往是不符合的，病程的長短也無法反應長期血糖控制情況。
本研究也存在一些不足，一方面局限于2型糖尿病患者，未與1型糖尿病患者進行對比分析；另一方面僅從角膜神經超微結構的變化來體現DCN的存在，未進行角膜神經功能評價。同時本研究是橫斷面研究，需進一步縱向隨訪研究來動態觀察DCN的變化情況。目前利用HRT系列IVCM觀察角膜中央區SBP形態，從而評價角膜神經的應用最為廣泛[18]；但國際上評估角膜神經仍缺乏統一量化標準，IVCM可重復性差、無法自動分析圖像等問題也都需要進一步解決。
讀者?作者?編者 遵章守紀，共同擔當，杜絕與論文發表有關的學術不端 根據2016年9月1日起施行的《高等學校預防與處理學術不端行為辦法》規定，在科學研究及相關活動中有下列行為之一的，應當認定為構成學術不端行為：（1）剽竊、抄襲、侵占他人學術成果；（2）篡改他人研究成果；（3）偽造科研數據、資料、文獻、注釋，或者捏造事實、編造虛假研究成果；（4）未參加研究或創作而在研究成果、學術論文上署名，未經他人許可而不當使用他人署名，虛構合作者共同署名，或者多人共同完成研究而在成果中未注明他人工作、貢獻；（5）在申報課題、成果、獎勵和職務評審評定、申請學位等過程中提供虛假學術信息；（6）買賣論文、由他人代寫或者為他人代寫論文；（7）其他根據高等學校或者有關學術組織、相關科研管理機構制定的規則，屬于學術不端的行為。 為了杜絕與論文發表有關的學術不端，特將本刊的相關要求重申如下： 1 投稿必須附第一作者所在單位的論文介紹信。所有參與署名的作者以及作者所在科室、單位對論文的真實性以及署名的合理性均具有不可推卸的把關責任。沒有體現對論文的真實性以及署名的合理性審核把關作用的論文介紹信，文稿不能進入下一稿件處理流程。 2 作者、作者單位署名必須符合要求并且表達規范得體。對于作者、作者單位署名不合理或存在疑問的文稿，編輯部有權要求作者予以說明或按本要求修改。作者、作者單位署名存在問題的文稿不得進入下一稿件處理流程；作者、作者單位署名不能按要求進行說明或修改的文稿，編輯部有權拒絕接收。 3 體現論文真實性、科學性的信息資料必須完整。對于初審以及同行評議過程中發現反映論文真實性、科學性相關的信息缺乏或不完整以及疑似他人代寫的論文，編輯部有權向作者索要反映研究工作真實性、科學性的相關證據資料，不能提供者將作為退稿處理。 4 除方家神韻、述評等欄目編輯部組織邀約的文稿外，所有自由來稿均必須根據編輯部現行的稿件處理流程進行同行評議。以文稿的科學性、學術性、規范性為稿件取舍的基本原則。所有擬錄用刊發的文稿均必須進行編輯加工、送修、校對等出版前的全部工作。同行評議后不能接納的文稿均必須陳述退稿理由。對送修及退稿意見有異議者，作者有權利說明和申訴。 5 來稿一經接受，由作者親筆簽署中華醫學會系列雜志論文授權書，該論文的專有使用權即歸中華醫學會所有；中華醫學會有權以電子期刊、光盤版、網絡出版等其他方式出版該論文。未經中華醫學會同意，該論文的任何部分不得轉載他處。未經本刊同意，任何公司和個人不得盜用本刊名義擅自制作任何形式的已發表文章的抽印本。 本刊編輯部
近年來糖尿病引起的角膜神經病變（DCN）引起人們關注。通過活體共聚焦顯微鏡（IVCM）可以快速、無創地觀察角膜神經纖維的形態。眾多研究通過IVCM已經觀察到糖尿病患者DCN的普遍存在，并可作為糖尿病周圍神經病變的評價及預測指標[1-3]。但目前并沒有明確的DCN量化標準及診斷分期標準，而角膜共聚焦顯微鏡在我國也未廣泛普及應用，導致DCN容易忽視和漏診。已有研究表明，糖尿病神經并發癥和微血管并發癥有密切相關性，高糖糖化作用、氧自由基作用、多元醇蓄積等多種致病機制均參與兩者的發病過程[4-6]。微血管損害標志可以作為糖尿病自主神經病變以及周圍神經病變強烈預測指標[7,8]。因此，糖尿病眼部并發癥DR與DCN之間是否具有顯著相關性值得進一步研究。本研究利用IVCM觀察了處于不同時期DR患者的角膜神經纖維損害情況，以此為探討DCN與DR的相關性提供參考。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為經醫院倫理委員會批準的橫斷面觀察性研究。2015年10月至2016年5月在第三軍醫大學新橋醫院眼科就診的2型糖尿病患者120例（糖尿病組）納入本研究。所有患者均符合2型糖尿病的診斷標準[9]。所有患者均行裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡和眼底彩色照相檢查，其中33例同時行熒光素眼底血管造影檢查。采用隨機數字表法隨機選取患者1只眼納入研究。按照2002年DR國際臨床分級標準[10]將糖尿病組患者分為無視網膜病變（NDR，圖1A）、輕中度非增生型DR（mNPDR，圖1B）、重度非增生型DR（sNPDR，圖1C）及增生型DR（PDR，圖1D），并以此分為4個亞組，每亞組30例30只眼。同時選取我院健康體檢者30名30只眼作為對照組。排除標準：（1）有眼部外傷、手術史；（2）有角膜接觸鏡佩戴史；（3）急慢性眼部炎癥；（4）嚴重干眼或瞼板腺功能障礙；（5）青光眼；（6）屈光度大于±6.00 D；（6）其他可能引起角膜病變的全身性疾病。糖尿病組及對照組受檢者年齡（F=1.960，P=0.104）、性別（χ2=8.232，P=0.083）比較，差異均無統計學意義。糖尿病組各亞組患者糖尿病病程比較，差異有統計學意義（χ2=13.615，P=0.003）；糖化血紅蛋白（HbA1c）比較，差異無統計學意義（χ2=7.624，P=0.054）（表1）。
圖1
糖尿病組各亞組患者彩色眼底像。1A. NDR組，未見明顯微血管病變；1B. mNPDR組，可見少許微血管瘤；1C. sNPDR，可見視網膜1個象限內多個出血點；1D. PDR組，可見玻璃體積血及視網膜前出血
表1
各組受檢者基本資料比較
所有受檢者均行HRT3激光IVCM（德國Heidelberg 公司）檢查。激光波長670 nm，放大倍率為800倍，橫向分辨率為1 μm。每幅圖像大小384×384像素，相當于400 μm×400 μm角膜的面積。選取掃描區域為角膜瞳孔區的上皮基底下神經纖維叢（SBP），掃描深度約30～90 μm。每只眼選取5張不同位置的清晰圖像，應用Image-Pro Plus 6.0軟件對角膜神經進行描圖后計算分析，最后取5張圖像數據的平均值。所有檢查均由同一檢查者完成。觀察分析角膜神經纖維長度（NFL）、角膜神經纖維密度（NFD）、角膜神經纖維分支密度（NFB）、角膜神經彎曲度（NT）。NFL為單位面積內神經纖維主干及所有分支的總長度；NFD為單位面積內神經纖維主干數量；NFB為單位面積內神經纖維分支數量；NT根據角膜神經方向改變的頻率和幅度進行評分[11,12]。NT評分：0分：神經纖維基本呈直線；1分：神經纖維稍有彎曲；2分：神經纖維中度彎曲，有頻繁方向變化的神經纖維，但均是小幅度變化；3分：神經纖維明顯彎曲，纖維方向變化幅度較大；4分：神經纖維非常彎曲，表現為突然和頻繁的纖維方向改變。
采用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。正態分布資料采用均數±標準差（ ）表示，偏態分布資料采用M（QR）表示。各組受檢者之間性別比較采用列聯表χ2檢驗；各組受檢者之間年齡比較采用單因素方差分析；各組受檢者之間角膜神經指標比較采用單因素方差分析多重比較；糖尿病組各亞組患者之間病程、HbA1c比較采用Kruskal-Wallis檢驗。角膜神經指標與年齡、糖尿病病程、HbA1c的相關性采用Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
激光IVCM檢查發現，隨DR程度逐漸加重，患眼角膜神經纖維數量及密度減少，神經纖維走形變得紆曲、不規則（圖2）。
圖2
糖尿病組各亞組患者激光IVCM檢查像。2A. NDR組；2B. mNPDR組；2C. sNPDR；2D. PDR組。隨DR程度逐漸加重，角膜神經纖維數量及密度減少，神經纖維走形變得紆曲、不規則
與對照組比較，糖尿病組患者NFL、NFD、NFB減少（F=147.315、142.586、65.898，P=0.000、0.000、0.000），NT增加（F=39.431，P=0.000），差異均有統計學意義。糖尿病組患者NFL、NFD、NFB隨DR嚴重程度逐漸減少，NT隨DR嚴重程度逐漸增加。糖尿病組各亞組組間兩兩比較，sNPDR組與PDR組患者NFL、NFD、NFB、NT之間的差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組患者NFL、NFD、NFB、NT之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3）。
圖3
各組受檢者角膜神經觀察指標比較。3A.NFL；3B.NFD；3C.NFB；3D.NT。*P＞0.05；其余各組間兩兩比較，P＜0.05
相關性分析結果顯示，年齡（r=－0.071、－0.080、0.001、0.100，P=0.391、0.328、0.991、0.224）、HbA1c（r=－0.109、－0.115、－0.126、0.025，P=0.238、0.211、0.169、0.781）與NFL、NFD、NFB、NT均無相關性；糖尿病病程與NFL、NFD呈負相關（r=－0.212、－0.264，P=0.020、0.004），與NT呈正相關（r=0.261，P=0.004），與NFB無相關性（r=－0.119 ，P=0.194）。
3 討論
本研究結果顯示，糖尿病組患者NFL、NFD、NFB均較對照組減少，NT增加。表明糖尿病患者的角膜神經在數量上和形態上均發生改變。我們還發現，從NDR到PDR，NFL、NFD和NFB呈逐漸減少的趨勢，而NT呈逐漸增加的趨勢。據此我們認為，DCN與DR在臨床病程上是具有顯著的相關性。在此基礎上，通過判斷DR的病變程度可能預測角膜神經的狀態；相反，如果在屈光間質不清楚或眼底檢查困難的情況下，通過IVCM量化角膜神經也可能預測DR的嚴重程度。我們在NDR組中也發現了角膜神經NFL、NFD和NFB較對照組減少，NT較對照組增加。Zhivov等[13]和Petropoulos等[14]也有類似的研究結果。這意味著糖尿病患者角膜神經病變可能比微血管病變發生更早，但這還需要進一步研究證實。另外，我們并沒有發現sNPDR組和PDR組角膜神經各項指標存在差異。這說明當DR發展到晚期，角膜神經的損害可能會進展得比較緩慢。但在非增生型DR中，mNPDR組與sNPDR組角膜神經損害是存在顯著差異的。de Cillà等[15]發現，DR患者行全視網膜激光光凝治療眼比未治療眼角膜上皮下神經叢出現33%的神經丟失。Bouheraoua等[16]還發現在視網膜脫離復位手術中行360°激光光凝治療后也會出現角膜神經的丟失。他們均認為激光光凝會造成睫狀短神經的熱損傷。因此，DR發展至sNPDR期，需要十分重視角膜的保護，因為激光光凝、手術等治療可能進一步加重角膜神經的損害。
我們發現，DCN與年齡、HbA1c并沒有顯著相關性。Erie等[17]在正常人群中也未發現年齡與角膜神經密度相關。而HbA1c僅代表近期3個月內的血糖情況，這也表明DCN是一個慢性進展的過程，短期血糖變化不足以引起角膜神經的變化。我們還發現，NFL、NFD與糖尿病病程呈負相關，NT與糖尿病病程呈正相關，但相關系數值較小。這可能是因為患者主觀描述的病程與患者實際病程往往是不符合的，病程的長短也無法反應長期血糖控制情況。
本研究也存在一些不足，一方面局限于2型糖尿病患者，未與1型糖尿病患者進行對比分析；另一方面僅從角膜神經超微結構的變化來體現DCN的存在，未進行角膜神經功能評價。同時本研究是橫斷面研究，需進一步縱向隨訪研究來動態觀察DCN的變化情況。目前利用HRT系列IVCM觀察角膜中央區SBP形態，從而評價角膜神經的應用最為廣泛[18]；但國際上評估角膜神經仍缺乏統一量化標準，IVCM可重復性差、無法自動分析圖像等問題也都需要進一步解決。
讀者?作者?編者 遵章守紀，共同擔當，杜絕與論文發表有關的學術不端 根據2016年9月1日起施行的《高等學校預防與處理學術不端行為辦法》規定，在科學研究及相關活動中有下列行為之一的，應當認定為構成學術不端行為：（1）剽竊、抄襲、侵占他人學術成果；（2）篡改他人研究成果；（3）偽造科研數據、資料、文獻、注釋，或者捏造事實、編造虛假研究成果；（4）未參加研究或創作而在研究成果、學術論文上署名，未經他人許可而不當使用他人署名，虛構合作者共同署名，或者多人共同完成研究而在成果中未注明他人工作、貢獻；（5）在申報課題、成果、獎勵和職務評審評定、申請學位等過程中提供虛假學術信息；（6）買賣論文、由他人代寫或者為他人代寫論文；（7）其他根據高等學校或者有關學術組織、相關科研管理機構制定的規則，屬于學術不端的行為。 為了杜絕與論文發表有關的學術不端，特將本刊的相關要求重申如下： 1 投稿必須附第一作者所在單位的論文介紹信。所有參與署名的作者以及作者所在科室、單位對論文的真實性以及署名的合理性均具有不可推卸的把關責任。沒有體現對論文的真實性以及署名的合理性審核把關作用的論文介紹信，文稿不能進入下一稿件處理流程。 2 作者、作者單位署名必須符合要求并且表達規范得體。對于作者、作者單位署名不合理或存在疑問的文稿，編輯部有權要求作者予以說明或按本要求修改。作者、作者單位署名存在問題的文稿不得進入下一稿件處理流程；作者、作者單位署名不能按要求進行說明或修改的文稿，編輯部有權拒絕接收。 3 體現論文真實性、科學性的信息資料必須完整。對于初審以及同行評議過程中發現反映論文真實性、科學性相關的信息缺乏或不完整以及疑似他人代寫的論文，編輯部有權向作者索要反映研究工作真實性、科學性的相關證據資料，不能提供者將作為退稿處理。 4 除方家神韻、述評等欄目編輯部組織邀約的文稿外，所有自由來稿均必須根據編輯部現行的稿件處理流程進行同行評議。以文稿的科學性、學術性、規范性為稿件取舍的基本原則。所有擬錄用刊發的文稿均必須進行編輯加工、送修、校對等出版前的全部工作。同行評議后不能接納的文稿均必須陳述退稿理由。對送修及退稿意見有異議者，作者有權利說明和申訴。 5 來稿一經接受，由作者親筆簽署中華醫學會系列雜志論文授權書，該論文的專有使用權即歸中華醫學會所有；中華醫學會有權以電子期刊、光盤版、網絡出版等其他方式出版該論文。未經中華醫學會同意，該論文的任何部分不得轉載他處。未經本刊同意，任何公司和個人不得盜用本刊名義擅自制作任何形式的已發表文章的抽印本。 本刊編輯部
