遺傳性視網膜變性（IRD）是一組具有高遺傳異質性并且在遺傳模式、發病年齡與視力障礙的嚴重程度等方面表現各異的疾病，基因治療是其治療研究熱點。國內外多項臨床試驗結果證明了基因治療在IRD中的安全性及有效性。以腺相關病毒為基因載體的Leber先天性黑矇及無脈絡膜癥的臨床試驗結果顯示，接受治療后患者視網膜功能均得到了不同程度的改善；另有多個其他IRD疾病相關的臨床試驗正在進行中。為今后更好地治療此類疾病奠定了堅實基礎，為根治IRD帶來了新的可能與希望。
引用本文： 宋清露, 劉慶淮, 范國平. 遺傳性視網膜變性基因治療臨床試驗研究現狀與進展. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 650-653. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.025 復制
遺傳性視網膜變性(IRD)是一組具有高遺傳異質性并且在遺傳模式、發病年齡與視力障礙的嚴重程度等方面表現各異的疾病[
1 IRD基因治療的基礎與實驗研究
IRD由一組較為罕見的、具有嚴重致盲性的疾病組成，其中視網膜色素變性(RP)最為常見，約占40%；視錐-視桿細胞營養不良、遺傳性黃斑變性、Usher綜合征(USH)分別占10%；Leber先天性黑矇(LCA)、脈絡膜視網膜變性、先天性靜止性夜盲分別占5%；視網膜劈裂癥(RS)占3%；無脈絡膜癥(CHM)占2%；其他占10%[1]。不同的IRD在遺傳模式上表現出較大的異質性，其中一大類屬于單基因遺傳病，即只受一對等位基因控制，按其遺傳方式不同可分為常染色體顯性遺傳(如常染色體顯性遺傳RP)、常染色體隱性遺傳(如2型LCA，LCA2)、X連鎖遺傳(如RS)等。
在所有單基因IRD中，基因治療效果最為確切的是由隱性遺傳基因的無功能突變所致的疾病，這些突變所編碼的蛋白主要位于外層視網膜，其中GUCY2D、MYO7A、RS1基因、CNGB3、特異性三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ABCA4)等蛋白定位于PR，而CHM、LRAT、RPE65等蛋白定位于RPE[5]，因此目前基因治療的主要作用靶點就是PR和RPE。多數情況下，常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳基因的突變會導致某種蛋白的缺乏或是無功能蛋白的生成，因而可用基因增加或基因替換療法治療這類疾病，野生型蛋白的表達能夠在很大程度上改善疾病的表型。
為實現基因治療，需要一套運輸系統來傳遞DNA或是RNA等遺傳物質，其中能將目的基因轉移至受體細胞內的這種物質被稱為載體。基因治療中使用的載體主要是非病毒載體和病毒載體。非病毒載體所攜帶的DNA可以無修飾，也可以與脂質體、聚合物、納米顆粒等化學物質結合或是使用電穿孔、離子電滲等物理方法以提高轉導效率[6]。而病毒載體是通過與宿主細胞上膜受體的特異性作用而內攝進入細胞核[7]，在臨床試驗中，通常使用改良后的病毒載體將目的基因傳送至細胞內。視網膜基因傳送過程中研究且應用最多的載體為腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體以及慢病毒載體等，這些載體能夠感染并轉導諸如PR與RPE等不分裂的細胞。
AAV是一種較小的(25 nm)、無包膜的二十面體病毒，能夠包裹大約4.7×103堿基對(bp)大小的線形單鏈DNA基因。AAV獨具一種能夠在神經組織中有效彌散的能力，免疫原性最小并且完全缺乏致病機制同時又能提供高效的基因傳遞[8]。AAV具有的高安全性及低免疫原性使得它既可以用于IRD這類慢性病單次注射后治療基因的長期表達，也可以用于視網膜下區域的重復注射給藥。雖然AAV載體具有眾多優勢，但是阻礙其廣泛應用的一個主要因素在于AAV僅有約4.7×103 bp的包裝容量，使得在Stargardt病(STGD)、USH1B型(USH1B)等致病突變基因的編碼序列超過5.0×103 bp的IRD治療中的應用受到限制。因此，包含腺病毒和慢病毒在內等能夠攜帶更大片段基因的載體作為替代載體被用于IRD的基因治療。
腺病毒是一種無包膜的大分子線形雙鏈DNA病毒，能夠包裹大小最高達37.0×103 bp的基因，通過受體介導的內吞作用進入細胞內，將腺病毒基因組轉移至細胞核內，但不能整合進宿主細胞的基因組中，僅能表達目的蛋白。腺病毒載體的大容量依賴于其自身顆粒的大小(約100 nm)，而由于視網膜下區域有物理屏障的存在，顆粒過大可能會對腺病毒載體定向作用靶細胞產生負面影響。使用腺病毒載體的另一個缺點在于即使在具有免疫赦免的眼球中，它仍有引發免疫反應的可能。
慢病毒載體是一類包含一條正義單鏈RNA的有包膜的反轉錄病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉導、穩定整合所需的遺傳信息，可將8.0×103 bp以內的外源基因有效整合到宿主細胞的基因組中，能夠有效感染神經元細胞、內皮細胞、干細胞等多種不同類型的細胞，達到持久表達目的序列的效果。
腺病毒載體是第一種在視網膜中實驗成功的病毒載體[9]，在動物實驗中，腺病毒載體能夠有效轉導成年小鼠RPE，但對于PR的作用效果較差[10]；慢病毒載體能夠成功轉導新生大鼠和小鼠的PR，從而改善IRD動物模型的表型[11]。盡管近年文獻報道顯示，慢病毒載體可以轉導成年非人靈長類動物的PR，但其對RPE的轉導仍主要局限在成年非靈長類動物中[12]。
2 基因治療IRD的臨床試驗
由于基因治療效果最為確切的是由隱性遺傳基因的無功能突變所致的各類IRD，因此目前使用基因治療的IRD臨床試驗主要為部分隱性遺傳疾病(表 1)[5]。
表1
目前可應用基因治療的IRD疾病
2.1 LCA
LCA是導致兒童時期失明的最為嚴重的IRD疾病，目前已有23個基因被確定與LCA的發病有關(http://www.retnet.org)；這些基因編碼的蛋白在視循環、視覺傳導通路、RPE的吞噬作用以及PR的發育等多個與視網膜發育及生理相關的途徑中發揮重要作用。但是，仍有30%~50%的LCA患者無法明確發病原因。研究者通過遺傳連鎖分析鑒定出芳基烴受體反應性蛋白樣1蛋白(AIPL1)、GUCY2D、RDH12等與LCA相關的基因；而基于視網膜的基因表達水平發現了另一組LCA相關基因，包括RPE65、LRAT、CRB1、IMPDH1、視錐-視桿同源盒基因以及RPGRIP1[
發生頻率較高的LCA突變基因主要有GUCY2D、RPE65、AIPL1、CRB1以及CEP290等，其中RPE65基因突變所致的LCA2是首個獲準進入Ⅰ~Ⅱ期視網膜基因治療臨床試驗的IRD疾病。之所以首選RPE65用于基因治療遺傳性RP，不僅是因為其在遺傳病因學上相對比較易于了解，也是因為從其理論上作用部位相較其他IRD更容易定位[15]。研究表明，有RPE65基因缺陷的患者在青少年期甚至二十多歲時，其PR及RPE細胞等視網膜結構均能相對保存完好，這促進了應用更進一步的基因干預手段治療此類疾病[16]。基因療法用于治療RPE65基因缺陷在狗及嚙齒類動物實驗中也得到了有效證實，在缺乏RPE65的動物模型中增大RPE65的表達能夠改善其視網膜功能，提高視力[17]。
第一批基因治療LCA2的3項Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗NCT00516477、NCT00643747、NCT00481546旨在測試LCA2患者視網膜下注射AAV2/2的安全性及有效性。由于此3項臨床試驗在調控序列、生產載體方法、載體特性、LCA2患者年齡以及結果的評價措施等方面存在諸多不同，所以難以直接比較三者間的研究結果。但是，仍然可以從中總結出以下重要結論：(1)視網膜下重復注射AAV2/2是安全的，患者耐受性較好；(2)視網膜下注射AAV2/2均能在不同程度上改善視網膜功能以及視功能[18-23]。其中一項研究表明，基因治療在年齡最小的LCA2患者中能達到最大功效，這可能與此類患者視網膜結構及功能仍保存得較好有關[22]。另一項隨訪時間長達3年的LCA2臨床試驗(NCT00643747)結果表明，攜帶RPE65的AAV2/2用于治療LCA2能夠適當地、暫時地改善視網膜的敏感性。對于受LCA2侵襲的患者而言，目前給予的RPE65治療量并不能達到使其獲得耐用且穩健的治療效果所需的范圍[24]。在疾病進展早期時間點給予更為有效的RPE65基因治療對于改善視網膜功能有較好的效果，并能對視網膜起到保護作用，防止其進一步退化變性。然而這些LCA2臨床試驗同時帶來了研究者對于向患病的視網膜下，尤其是黃斑中心凹運送載體所致的侵入性損傷的擔憂。研究者測量了黃斑中心凹下注射載體后的黃斑中心凹厚度，發現其厚度減小[21]；其原因可能是由于感覺神經視網膜暫時性脫離所致的直接結果。盡管能夠預見到黃斑部視網膜脫離這一副作用，但是相較于恢復維甲酸循環所帶來的潛在好處，這種暫時性的視網膜脫離對黃斑中心凹功能造成損傷的風險仍是較小的。鑒于尚沒有證據表明AAV注射治療對于黃斑中心凹視錐細胞有益，所以在AAV運輸技術上應該盡可能考慮將注射高度以及持續作用時間控制在最小，如可以通過多次注射以減少黃斑中心凹視網膜脫離的風險。在視網膜目標作用范圍上，使得AAV在有活力的視網膜上廣泛分布能夠促進增強對于視網膜退化變性的保護作用[24]。
在已有的多項LCA2 Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗的基礎上，美國Spark Therapeutics基因治療藥物公司進行了Ⅲ期臨床試驗，將其自主研發的基因治療藥物SPK-RPE65用于治療RPE65基因缺陷所致的視力損害患者[25]。2015年，Spark Therapeutics公司公布了臨床試驗前期結果。他們通過比較治療前后1年患者雙眼移動測試分數的變化，證明試驗干預組與對照組相比在功能視力方面有所改善，且無與SPK-RPE65相關的嚴重不良反應或是有害的免疫應答發生。此外，試驗結果還顯示，全視野光敏感閾值測試的結果以及第一注射眼的移動測試分數的變化均有統計學意義，而視敏度無統計學意義[26]。基于以上結果，Spark Therapeutics公司計劃于2016年向美國食品藥品監督管理局遞交生物制品許可申請，以期能將RPE65基因治療投入臨床，為更多LCA2及其他RPE65基因缺陷疾病的患者帶來福音。
2.2 CHM
CHM是另一類在基因治療臨床試驗中得到確切療效的IRD。CHM由CHM基因的突變引起，該基因編碼Rab護衛蛋白1(REP1)[27]，至今所有有報道的CHM都是由于CHM的無功能突變所致。CHM蛋白編碼序列只有1.9×103 bp，使得運用AAV載體的基因治療成為CHM極有吸引力的治療策略。一項多中心Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗(NCT01461213)通過向患者黃斑中心凹下注射AAV.REP1來評估基因治療CHM的效果，結果表明，注射6個月后所有患者接受治療眼視網膜敏感性均有提高，且無黃斑中心凹下注射造成的暫時性視網膜脫離[28]。此臨床試驗的結果提示，在視網膜厚度變薄發生之前應給予患者適當的干預措施，這也為進一步評估CHM及老年性黃斑變性等一些其他視網膜疾病的基因治療提供了有力支持。
2.3 STGD與USH1B
目前僅有英國Oxford BioMedica公司開展了慢病毒載體治療STGD與USH1B的臨床試驗[29]。表達于PR的ABCA4基因缺乏可導致STGD1型，在PR和RPE中均有表達的MYO7A基因突變可導致USH1B。這兩個基因的致病突變編碼序列大小均超出了AAV載體的包裝能力，因此Oxford BioMedica公司選擇了基于EIAV且不可復制的非人類重組慢病毒載體制品StarGen以及UshStat，用于兩者的基因治療。StarGen能夠在活化的巨細胞病毒啟動子調節下表達大量的人PR特異性ABCA4基因，視網膜下注射StarGen可以直接作用于視錐、視桿細胞，從而改善STGD患者的PR功能[30]；而視網膜下注射UshStat可用于肌球蛋白Ⅶa編碼基因突變所致的USH1B相關的進展性RP的治療[31]。以上臨床試驗所取得的結果能夠有效地評價使用以慢病毒為基礎的載體平臺轉導大片段基因是否適用于視網膜疾病的基因治療。
2.4 其他
除上述疾病外，另有一些IRD疾病也已經進入基因治療的臨床試驗階段。在RPE中表達的MERTK基因突變能夠引起一種罕見類型的RP 38型，而一項視網膜下注射AAV2-VMD2 -hMERTK (一種攜帶人MERTK蛋白的AAV載體)的臨床試驗(NCT01482195)正在進行中；另一項關于RP的臨床試驗(NCT02556736)則將編碼光敏感通道2蛋白的基因運送至視網膜，當受到光刺激時，這種蛋白能夠去極化并產生傳輸至大腦的信號，刺激腦內視覺神經元，從而達到改善患者視力的目的[32]；表達于視網膜神經節細胞的ND4基因突變可導致Leber遺傳性視神經病變，該疾病目前也已進入Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗(NCT02064569)[33, 34]。
3 展望
早期臨床試驗得到的令人信服的數據表明基因治療在眼科疾病中具有重要的轉化潛力。然而需要注意的是，目前的研究只針對非常小的患者人群，至少在短期內基因治療在更廣泛的范圍內緩解致盲疾病的前景是有限的。以下幾個原因導致了當前基因治療的局限性：(1) CHM和RPE65突變導致的LCA只影響少數患者，而許多其他形式的IRD仍舊需要不同的治療方法；(2)對于較常見的疾病，目前多在疾病的晚期階段人群開展臨床試驗，即使目前的試驗證明安全有效，能否將其推廣運用到更廣泛的發病人群仍然需要進一步觀察；(3)目前臨床試驗中大多數方法的治療窗是依賴于機體剩余的靶細胞以及保留的一定程度的視力；(4)基因治療試驗費用高昂以及從試驗到臨床的轉化成本過高。
近年來關于LCA2及CHM的一些臨床試驗結果證明了基因治療能為患者帶來益處，下一步需完成的是在現有研究結果基礎上，進一步驗證基因治療的安全性及有效性，從已有成果中總結技術與經驗，建立一個較為完備的治療平臺，包含驗證有效的基因載體，只需依據疾病的不同指征更換所裝載的治療基因[35]。尤其是對于那些基因治療可能能夠起效的非常罕見的疾病來說，有限的普及度和昂貴的科研支出使得開發建立一種新的療法在經濟上十分困難，基因治療平臺的建立則對于簡化此類療法的研發以及調控其間所遇的障礙極為重要。此外，在完善方法與技術以提高基因治療安全性及有效性的同時，更為重要的是尋求一種更好的方式以進一步提高基因治療對于患者的準確性和敏感性，為此需要廣泛研究每種疾病的自然病史、基因定位，乃至最終的疾病預測、疾病進程以及臨床終點的驗證。只有對疾病有了更為全面深入的認識理解，才能切實地將基因治療從實驗室研究階段帶入臨床應用，從真正意義上為患者帶去健康的希望。
盡管基因治療用于IRD疾病仍處于初期階段，但是其在LCA2以及CHM臨床試驗中的不俗表現無疑是一個創造性的成就，這為今后更好地治療此類疾病奠定了堅實基礎。
遺傳性視網膜變性(IRD)是一組具有高遺傳異質性并且在遺傳模式、發病年齡與視力障礙的嚴重程度等方面表現各異的疾病[
1 IRD基因治療的基礎與實驗研究
IRD由一組較為罕見的、具有嚴重致盲性的疾病組成，其中視網膜色素變性(RP)最為常見，約占40%；視錐-視桿細胞營養不良、遺傳性黃斑變性、Usher綜合征(USH)分別占10%；Leber先天性黑矇(LCA)、脈絡膜視網膜變性、先天性靜止性夜盲分別占5%；視網膜劈裂癥(RS)占3%；無脈絡膜癥(CHM)占2%；其他占10%[1]。不同的IRD在遺傳模式上表現出較大的異質性，其中一大類屬于單基因遺傳病，即只受一對等位基因控制，按其遺傳方式不同可分為常染色體顯性遺傳(如常染色體顯性遺傳RP)、常染色體隱性遺傳(如2型LCA，LCA2)、X連鎖遺傳(如RS)等。
在所有單基因IRD中，基因治療效果最為確切的是由隱性遺傳基因的無功能突變所致的疾病，這些突變所編碼的蛋白主要位于外層視網膜，其中GUCY2D、MYO7A、RS1基因、CNGB3、特異性三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白(ABCA4)等蛋白定位于PR，而CHM、LRAT、RPE65等蛋白定位于RPE[5]，因此目前基因治療的主要作用靶點就是PR和RPE。多數情況下，常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳基因的突變會導致某種蛋白的缺乏或是無功能蛋白的生成，因而可用基因增加或基因替換療法治療這類疾病，野生型蛋白的表達能夠在很大程度上改善疾病的表型。
為實現基因治療，需要一套運輸系統來傳遞DNA或是RNA等遺傳物質，其中能將目的基因轉移至受體細胞內的這種物質被稱為載體。基因治療中使用的載體主要是非病毒載體和病毒載體。非病毒載體所攜帶的DNA可以無修飾，也可以與脂質體、聚合物、納米顆粒等化學物質結合或是使用電穿孔、離子電滲等物理方法以提高轉導效率[6]。而病毒載體是通過與宿主細胞上膜受體的特異性作用而內攝進入細胞核[7]，在臨床試驗中，通常使用改良后的病毒載體將目的基因傳送至細胞內。視網膜基因傳送過程中研究且應用最多的載體為腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體以及慢病毒載體等，這些載體能夠感染并轉導諸如PR與RPE等不分裂的細胞。
AAV是一種較小的(25 nm)、無包膜的二十面體病毒，能夠包裹大約4.7×103堿基對(bp)大小的線形單鏈DNA基因。AAV獨具一種能夠在神經組織中有效彌散的能力，免疫原性最小并且完全缺乏致病機制同時又能提供高效的基因傳遞[8]。AAV具有的高安全性及低免疫原性使得它既可以用于IRD這類慢性病單次注射后治療基因的長期表達，也可以用于視網膜下區域的重復注射給藥。雖然AAV載體具有眾多優勢，但是阻礙其廣泛應用的一個主要因素在于AAV僅有約4.7×103 bp的包裝容量，使得在Stargardt病(STGD)、USH1B型(USH1B)等致病突變基因的編碼序列超過5.0×103 bp的IRD治療中的應用受到限制。因此，包含腺病毒和慢病毒在內等能夠攜帶更大片段基因的載體作為替代載體被用于IRD的基因治療。
腺病毒是一種無包膜的大分子線形雙鏈DNA病毒，能夠包裹大小最高達37.0×103 bp的基因，通過受體介導的內吞作用進入細胞內，將腺病毒基因組轉移至細胞核內，但不能整合進宿主細胞的基因組中，僅能表達目的蛋白。腺病毒載體的大容量依賴于其自身顆粒的大小(約100 nm)，而由于視網膜下區域有物理屏障的存在，顆粒過大可能會對腺病毒載體定向作用靶細胞產生負面影響。使用腺病毒載體的另一個缺點在于即使在具有免疫赦免的眼球中，它仍有引發免疫反應的可能。
慢病毒載體是一類包含一條正義單鏈RNA的有包膜的反轉錄病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉導、穩定整合所需的遺傳信息，可將8.0×103 bp以內的外源基因有效整合到宿主細胞的基因組中，能夠有效感染神經元細胞、內皮細胞、干細胞等多種不同類型的細胞，達到持久表達目的序列的效果。
腺病毒載體是第一種在視網膜中實驗成功的病毒載體[9]，在動物實驗中，腺病毒載體能夠有效轉導成年小鼠RPE，但對于PR的作用效果較差[10]；慢病毒載體能夠成功轉導新生大鼠和小鼠的PR，從而改善IRD動物模型的表型[11]。盡管近年文獻報道顯示，慢病毒載體可以轉導成年非人靈長類動物的PR，但其對RPE的轉導仍主要局限在成年非靈長類動物中[12]。
2 基因治療IRD的臨床試驗
由于基因治療效果最為確切的是由隱性遺傳基因的無功能突變所致的各類IRD，因此目前使用基因治療的IRD臨床試驗主要為部分隱性遺傳疾病(表 1)[5]。
表1
目前可應用基因治療的IRD疾病
2.1 LCA
LCA是導致兒童時期失明的最為嚴重的IRD疾病，目前已有23個基因被確定與LCA的發病有關(http://www.retnet.org)；這些基因編碼的蛋白在視循環、視覺傳導通路、RPE的吞噬作用以及PR的發育等多個與視網膜發育及生理相關的途徑中發揮重要作用。但是，仍有30%~50%的LCA患者無法明確發病原因。研究者通過遺傳連鎖分析鑒定出芳基烴受體反應性蛋白樣1蛋白(AIPL1)、GUCY2D、RDH12等與LCA相關的基因；而基于視網膜的基因表達水平發現了另一組LCA相關基因，包括RPE65、LRAT、CRB1、IMPDH1、視錐-視桿同源盒基因以及RPGRIP1[
發生頻率較高的LCA突變基因主要有GUCY2D、RPE65、AIPL1、CRB1以及CEP290等，其中RPE65基因突變所致的LCA2是首個獲準進入Ⅰ~Ⅱ期視網膜基因治療臨床試驗的IRD疾病。之所以首選RPE65用于基因治療遺傳性RP，不僅是因為其在遺傳病因學上相對比較易于了解，也是因為從其理論上作用部位相較其他IRD更容易定位[15]。研究表明，有RPE65基因缺陷的患者在青少年期甚至二十多歲時，其PR及RPE細胞等視網膜結構均能相對保存完好，這促進了應用更進一步的基因干預手段治療此類疾病[16]。基因療法用于治療RPE65基因缺陷在狗及嚙齒類動物實驗中也得到了有效證實，在缺乏RPE65的動物模型中增大RPE65的表達能夠改善其視網膜功能，提高視力[17]。
第一批基因治療LCA2的3項Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗NCT00516477、NCT00643747、NCT00481546旨在測試LCA2患者視網膜下注射AAV2/2的安全性及有效性。由于此3項臨床試驗在調控序列、生產載體方法、載體特性、LCA2患者年齡以及結果的評價措施等方面存在諸多不同，所以難以直接比較三者間的研究結果。但是，仍然可以從中總結出以下重要結論：(1)視網膜下重復注射AAV2/2是安全的，患者耐受性較好；(2)視網膜下注射AAV2/2均能在不同程度上改善視網膜功能以及視功能[18-23]。其中一項研究表明，基因治療在年齡最小的LCA2患者中能達到最大功效，這可能與此類患者視網膜結構及功能仍保存得較好有關[22]。另一項隨訪時間長達3年的LCA2臨床試驗(NCT00643747)結果表明，攜帶RPE65的AAV2/2用于治療LCA2能夠適當地、暫時地改善視網膜的敏感性。對于受LCA2侵襲的患者而言，目前給予的RPE65治療量并不能達到使其獲得耐用且穩健的治療效果所需的范圍[24]。在疾病進展早期時間點給予更為有效的RPE65基因治療對于改善視網膜功能有較好的效果，并能對視網膜起到保護作用，防止其進一步退化變性。然而這些LCA2臨床試驗同時帶來了研究者對于向患病的視網膜下，尤其是黃斑中心凹運送載體所致的侵入性損傷的擔憂。研究者測量了黃斑中心凹下注射載體后的黃斑中心凹厚度，發現其厚度減小[21]；其原因可能是由于感覺神經視網膜暫時性脫離所致的直接結果。盡管能夠預見到黃斑部視網膜脫離這一副作用，但是相較于恢復維甲酸循環所帶來的潛在好處，這種暫時性的視網膜脫離對黃斑中心凹功能造成損傷的風險仍是較小的。鑒于尚沒有證據表明AAV注射治療對于黃斑中心凹視錐細胞有益，所以在AAV運輸技術上應該盡可能考慮將注射高度以及持續作用時間控制在最小，如可以通過多次注射以減少黃斑中心凹視網膜脫離的風險。在視網膜目標作用范圍上，使得AAV在有活力的視網膜上廣泛分布能夠促進增強對于視網膜退化變性的保護作用[24]。
在已有的多項LCA2 Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗的基礎上，美國Spark Therapeutics基因治療藥物公司進行了Ⅲ期臨床試驗，將其自主研發的基因治療藥物SPK-RPE65用于治療RPE65基因缺陷所致的視力損害患者[25]。2015年，Spark Therapeutics公司公布了臨床試驗前期結果。他們通過比較治療前后1年患者雙眼移動測試分數的變化，證明試驗干預組與對照組相比在功能視力方面有所改善，且無與SPK-RPE65相關的嚴重不良反應或是有害的免疫應答發生。此外，試驗結果還顯示，全視野光敏感閾值測試的結果以及第一注射眼的移動測試分數的變化均有統計學意義，而視敏度無統計學意義[26]。基于以上結果，Spark Therapeutics公司計劃于2016年向美國食品藥品監督管理局遞交生物制品許可申請，以期能將RPE65基因治療投入臨床，為更多LCA2及其他RPE65基因缺陷疾病的患者帶來福音。
2.2 CHM
CHM是另一類在基因治療臨床試驗中得到確切療效的IRD。CHM由CHM基因的突變引起，該基因編碼Rab護衛蛋白1(REP1)[27]，至今所有有報道的CHM都是由于CHM的無功能突變所致。CHM蛋白編碼序列只有1.9×103 bp，使得運用AAV載體的基因治療成為CHM極有吸引力的治療策略。一項多中心Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗(NCT01461213)通過向患者黃斑中心凹下注射AAV.REP1來評估基因治療CHM的效果，結果表明，注射6個月后所有患者接受治療眼視網膜敏感性均有提高，且無黃斑中心凹下注射造成的暫時性視網膜脫離[28]。此臨床試驗的結果提示，在視網膜厚度變薄發生之前應給予患者適當的干預措施，這也為進一步評估CHM及老年性黃斑變性等一些其他視網膜疾病的基因治療提供了有力支持。
2.3 STGD與USH1B
目前僅有英國Oxford BioMedica公司開展了慢病毒載體治療STGD與USH1B的臨床試驗[29]。表達于PR的ABCA4基因缺乏可導致STGD1型，在PR和RPE中均有表達的MYO7A基因突變可導致USH1B。這兩個基因的致病突變編碼序列大小均超出了AAV載體的包裝能力，因此Oxford BioMedica公司選擇了基于EIAV且不可復制的非人類重組慢病毒載體制品StarGen以及UshStat，用于兩者的基因治療。StarGen能夠在活化的巨細胞病毒啟動子調節下表達大量的人PR特異性ABCA4基因，視網膜下注射StarGen可以直接作用于視錐、視桿細胞，從而改善STGD患者的PR功能[30]；而視網膜下注射UshStat可用于肌球蛋白Ⅶa編碼基因突變所致的USH1B相關的進展性RP的治療[31]。以上臨床試驗所取得的結果能夠有效地評價使用以慢病毒為基礎的載體平臺轉導大片段基因是否適用于視網膜疾病的基因治療。
2.4 其他
除上述疾病外，另有一些IRD疾病也已經進入基因治療的臨床試驗階段。在RPE中表達的MERTK基因突變能夠引起一種罕見類型的RP 38型，而一項視網膜下注射AAV2-VMD2 -hMERTK (一種攜帶人MERTK蛋白的AAV載體)的臨床試驗(NCT01482195)正在進行中；另一項關于RP的臨床試驗(NCT02556736)則將編碼光敏感通道2蛋白的基因運送至視網膜，當受到光刺激時，這種蛋白能夠去極化并產生傳輸至大腦的信號，刺激腦內視覺神經元，從而達到改善患者視力的目的[32]；表達于視網膜神經節細胞的ND4基因突變可導致Leber遺傳性視神經病變，該疾病目前也已進入Ⅰ~Ⅱ期臨床試驗(NCT02064569)[33, 34]。
3 展望
早期臨床試驗得到的令人信服的數據表明基因治療在眼科疾病中具有重要的轉化潛力。然而需要注意的是，目前的研究只針對非常小的患者人群，至少在短期內基因治療在更廣泛的范圍內緩解致盲疾病的前景是有限的。以下幾個原因導致了當前基因治療的局限性：(1) CHM和RPE65突變導致的LCA只影響少數患者，而許多其他形式的IRD仍舊需要不同的治療方法；(2)對于較常見的疾病，目前多在疾病的晚期階段人群開展臨床試驗，即使目前的試驗證明安全有效，能否將其推廣運用到更廣泛的發病人群仍然需要進一步觀察；(3)目前臨床試驗中大多數方法的治療窗是依賴于機體剩余的靶細胞以及保留的一定程度的視力；(4)基因治療試驗費用高昂以及從試驗到臨床的轉化成本過高。
近年來關于LCA2及CHM的一些臨床試驗結果證明了基因治療能為患者帶來益處，下一步需完成的是在現有研究結果基礎上，進一步驗證基因治療的安全性及有效性，從已有成果中總結技術與經驗，建立一個較為完備的治療平臺，包含驗證有效的基因載體，只需依據疾病的不同指征更換所裝載的治療基因[35]。尤其是對于那些基因治療可能能夠起效的非常罕見的疾病來說，有限的普及度和昂貴的科研支出使得開發建立一種新的療法在經濟上十分困難，基因治療平臺的建立則對于簡化此類療法的研發以及調控其間所遇的障礙極為重要。此外，在完善方法與技術以提高基因治療安全性及有效性的同時，更為重要的是尋求一種更好的方式以進一步提高基因治療對于患者的準確性和敏感性，為此需要廣泛研究每種疾病的自然病史、基因定位，乃至最終的疾病預測、疾病進程以及臨床終點的驗證。只有對疾病有了更為全面深入的認識理解，才能切實地將基因治療從實驗室研究階段帶入臨床應用，從真正意義上為患者帶去健康的希望。
盡管基因治療用于IRD疾病仍處于初期階段，但是其在LCA2以及CHM臨床試驗中的不俗表現無疑是一個創造性的成就，這為今后更好地治療此類疾病奠定了堅實基礎。
