常染色體顯性遺傳視錐-視桿營養不良一家系的基因突變檢測_《中華眼底病雜志》

作者：

315040 寧波市鄞州人民醫院眼科中心寧波大學醫學院附屬鄞州醫院眼科中心;

關鍵詞：

視網膜疾病/遺傳學視網膜疾病/病因學視錐光感受器細胞視網膜視桿光感受器細胞基因密碼子無義

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.017

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引用本文： 趙娜, 陸勤康, 王惠云, 童奇湖. 常染色體顯性遺傳視錐-視桿營養不良一家系的基因突變檢測. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 637-639. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.017 復制

視錐-視桿營養不良(CORD)為高度臨床異質性和遺傳異質性眼病，以視錐細胞受損為主，伴不同程度的視桿細胞損傷^[1-3]。目前, 已明確的CORD致病基因已有25個^[1-3]。其中，常染色體隱性遺傳基因13個；常染色體顯性遺傳基因10個；X連鎖遺傳基因2個。本研究對1個南方漢族常染色體顯性遺傳CORD家系的視錐-視桿同源盒(CRX)基因突變譜進行了測序驗證。現將結果報道如下。

1 對象和方法

本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。參與研究的所有個體均簽署知情同意書。

來自南方的1個4代19人漢族家系，其中CODR患者4例(圖 1)。對所有家系成員均行眼科檢查。先證者，女，52歲。10余年前雙眼開始視力進行性下降。右眼視力0.1，左眼視力0.15，均不能矯正。畏光但無眼球震顫；色覺輕微異常。眼底黃斑區2個視盤直徑(DD)×2 DD金箔樣反光，散在色素沉著，中心凹反光消失，伴黃色斑點；中周部視網膜可見骨細胞樣色素沉著，視網膜動脈血管變細(圖 2)。光相干斷層掃描(OCT)檢查可見黃斑區外層視網膜萎縮變薄(圖 3)。閃光視網膜電圖(FERG)檢查，暗適應b波振幅下降，視桿反應輕度下降；明適應a、b波振幅均明顯下降，視錐反應消失(圖 4)。熒光素眼底血管造影(FFA)檢查黃斑區呈強熒光，未見脈絡膜湮沒(圖 5)。家系其余3例患者中，男性1例，女性2例。年齡分別為75、48、32歲；發病年齡分別為40、39、32歲。視力0.05~0.4。均有畏光但無眼球震顫。色覺檢查，輕微異常、色盲、色弱各1例。眼底黃斑區1.0 DD×1.5 DD金箔樣反光，散在色素沉著1例；黃斑區色素沉著2例。中心凹反光消失，伴黃色斑點，視網膜色素沉著1例；中心凹反光不清2例，其中外周視網膜可見針尖樣骨細胞色素沉著1例。FERG檢查，視錐反應消失1例，明顯下降2例；視桿反應輕度下降2例，正常1例。其余家系成員檢查結果未見異常。依據臨床檢查結果和家系分析，結合國內外文獻^[1-4]，初步診斷為常染色體顯性遺傳CORD (CORD2)。

圖1 患者家系圖。■：男性患者；●：女性患者；↑：先證者；□：正常男性；○：正常女性

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圖2 先證者右眼彩色眼底像。黃斑區不規則圓形黃色萎縮灶，暴露脈絡膜大血管，其間雜色素沉著，后極部見黃色斑點??圖 3??先證者右眼OCT像。黃斑區外層視網膜萎縮變薄??圖 4??先證者雙眼FERG像。4A.暗適應b波振幅下降，視桿反應輕度下降；4B.明適應a、b波振幅明顯下降，視錐反應消失

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圖5 先證者雙眼FFA像。5A.左眼，早期黃斑區見強熒光，晚期呈透見熒光；5B.右眼，黃斑“靶的”狀強熒光，透見與遮蔽熒光相間，晚期色素上皮病變部位呈斑駁狀強熒光

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采集家系所有成員的外周血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。天根血液基因組DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。應用Primer 5.0軟件設計CRX基因的5個外顯子的上、下游引物，聚合酶鏈反應(PCR)擴增目標DNA序列。25.0 μl反應體系中，2倍Taq PCR標準混合物12.5 μl，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μl，100 ng/μl DNA模板2.0 μl，超純水9.5 μl。95℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠和(或)紫外線鑒定，證實PCR擴增陽性片段存在。

采用ABI 3730xl型測序儀熒光標記法對PCR產物進行正、反向DNA測序。測序由深圳華大基因研究院杭州分公司完成。測序結果與Genbank、千人基因組計劃中的野生型CRX參考序列(GenBank: KR709702.1)進行BLAST比對分析，初步確定突變位點。應用Primer 5.0軟件設計針對突變位點的等位基因特異性(AS)-PCR引物(正向引物：CCCACCTCCCTA TCAGGCT；反向引物：GACGGTGTTAGGGTTGAG)，驗證突變。

以150名無血緣關系的健康個體為對照組。應用SIFT功能預測軟件分析所發現的CRX基因突變可能的生物學效應。

2 結果

患者Ⅰ2、Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅲ3的CRX第5外顯子均存在c.C766T (p.Q256X)無義突變(圖 6A)，造成CRX蛋白第256位的谷氨酰胺突變為終止密碼子，形成截短的CRX蛋白。SIFT分析提示，該突變為有害性：damaging。

圖6 DNA測序圖和AS-PCR電泳圖。6A.患者CRX基因第5外顯子的c.C766T突變(黑箭)；6B.對照組該位點不存在突變；6C.AS-PCR顯示，患者可擴增出406堿基對條帶，對照組無擴增條帶

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正常家系成員以及對照組均未見此基因突變(圖 6B)。AS-PCR驗證結果顯示，家系中基因突變攜帶者存在此突變位點；家系中正常成員和對照組中隨機個體均未見此突變位點(圖 6C)。

3 討論

CRX基因定位于19q13.32，包含5個外顯子，編碼含299個氨基酸殘基的CRX蛋白。CRX蛋白為光感受器細胞特異性的反式作用轉錄因子，調控早期光感受器細胞的發育和成熟光感受器細胞的存活^[4-7]。CRX功能的喪失可影響視網膜內多種蛋白的表達，如光轉換通路相關蛋白、視蛋白、感光細胞結構蛋白和磷酸二酯酶等^[4-7]。CRX突變可導致一系列的視網膜光感受器細胞遺傳性疾病，除CORD2外，還有視網膜色素變性和Leber先天性黑矇^[8-11]。此3種疾病在眼科臨床上有不同的定義，但都可以由CRX基因突變導致，因而有理由認為3種疾病具有臨床異質性特點，可能具有相同的分子病因，只是在疾病嚴重度上和對視桿或視錐細胞的影響不同。

本研究本研究在對所有家系成員進行CRX基因突變的檢測中，發現4例患者的共有無義突變c.C766T (p.Gln256X)，不僅為家系的產前DNA診斷、植入前遺傳學診斷等疾病預防措施奠定了基礎，而且補充和豐富了CRX基因突變數據庫。隨著分子遺傳學技術的進步, 收集典型家系尋找新的致病位點, 對CORD發病機制的探討以及分析基因型-表型相關性以預測疾病的發生和發展，將是今后研究的重點^{[2, 3, 5, 11]}。

1 對象和方法

本研究經本院醫學倫理委員會審核批準。參與研究的所有個體均簽署知情同意書。

圖1 患者家系圖。■：男性患者；●：女性患者；↑：先證者；□：正常男性；○：正常女性

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以150名無血緣關系的健康個體為對照組。應用SIFT功能預測軟件分析所發現的CRX基因突變可能的生物學效應。

2 結果

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圖1 患者家系圖。■：男性患者；●：女性患者；↑：先證者；□：正常男性；○：正常女性

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1.	張清炯, 黎仕強, 肖學珊, 等.小兒視錐細胞與視錐桿細胞營養不良的臨床特點與候選基因突變分析[J].中華眼底病雜志, 2001, 17(4):293-295.Zhang QJ, Li SQ, Xiao XS, et al.Clinical characteristics and candidate gene mutational screening in children with cone and cone-rod dystrophy[J].Chin J Ocul Fundus Dis, 2001, 17(4):293-295.
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6.	Freund CL, Gregory-Evans CY, Furukawa T, et al. Cone-rod dystrophy due to mutations in a novel photoreceptor-specific homeobox gene (CRX) essential for maintenance of the photoreceptor[J].Cell, 1997, 91(4):543-553.
7.	Lines MA, Hébert M, McTaggart KE, et al. Electrophysiologic and phenotypic features of an autosomal cone-rod dystrophy caused by a novel CRX mutation[J]. Ophthalmology, 2002, 109(10):1862-1870.
8.	Melanie MS, Lori SS, Helen AM, et al. A range of clinical phenotypes associated with mutations in CRX. a photoreceptor transcription-factor gene[J]. Am J Hum Genet, 1998, 63(5):1307-1315.
9.	Li H, Xue SX, Li SQ, et al.CRX variants in cone-rod dystrophy and mutation overview[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 426(4):498-503. DOI:10.1016/j.bbrc.2012.08.110.
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11.	Lu QK, Zhao N, Lv YS, et al. A novel CRX mutation by whole-exome sequencing in an autosomal dominant cone-rod dystrophy pedigree[J]. Int J Ophthalmol, 2015, 8(6):1112-1117.DOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2015.06.06.

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11. Lu QK, Zhao N, Lv YS, et al. A novel CRX mutation by whole-exome sequencing in an autosomal dominant cone-rod dystrophy pedigree[J]. Int J Ophthalmol, 2015, 8(6):1112-1117.DOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2015.06.06.

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