引用本文： 聶川, 張亮, 王俊平, 王越, 張春一, 羅先瓊. 基于基因表達芯片和連接網絡技術篩選干預缺氧誘導視網膜血管內皮細胞模型的小分子化合物研究. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 591-595. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.007 復制
早產兒視網膜病變(ROP)的發病初期病理基礎是視網膜血管生成抑制，缺血、缺氧可抑制視網膜血管生成并成為ROP發病的主要病因之一[1]。目前ROP的治療主要集中在氧濃度控制、抗氧化治療、環氧化酶抑制劑、普萘洛爾、血管生成抑制因子等方面，但多數藥物療效存在爭議且無明確結論[2]。近年隨著分子生物學技術的發展，已經可以利用基因芯片技術對疾病的基因譜表達進行分析。Lamb等[3]在2006年建立了在體外培養并采用小生物活性分子處理后的人體細胞基因表達譜的查詢數據庫，也被稱為連接網絡(CMAP)，目前已收錄超過7000個基因表達譜以及與其相關的1309種小分子化合物和藥物。該數據庫可通過基因表達譜的改變探索化合物的分子效果是與基因表達的作用相似或相反而用于藥物的研發，已廣泛應用到腫瘤靶向基因小分子替代物篩選、基于臨床數據和網絡模塊化的新藥物適應證預測、精確醫學藥物研發、利用基因表達譜聚類分析闡明天然藥物藥理機制等方面的研究[4-7]。但目前利用此數據庫進行眼科疾病與小分子物質之間關系的研究尚少。本研究旨在利用基因表達芯片技術和CMAP技術預測可能對ROP有干預效果的小分子化合物，為ROP干預藥物的研制提供相關理論基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
體外培養的人胚視網膜血管內皮細胞采用CoCl2處理，建立視網膜血管內皮細胞缺氧模型，模擬ROP病理改變。雙色微陣列法分析差異基因表達，微陣列顯著分析(SAM)軟件篩選差異表達基因，熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應，基因分類法進行基因功能富集分析。Feature extraction軟件獲取并分析數據，得出基因差異倍數，按差異倍數上調≥2.0倍，差異倍數下調≤0.5進行聚類。結果篩查出326個差異表達基因，其中上調基因198個，下調基因128個(圖 1)[8]。本研究利用已發現的326個差異表達基因，進行后續CMAP研究。
圖1
人胚視網膜血管內皮細胞基因表達染色交換熱圖。1A.配對的人胚視網膜血管內皮細胞(對照組)樣本監督聚類分析，顯示有15 400個基因信號強度大于800；1B.與對照組比較，視網膜血管內皮細胞缺氧模型可見326個差異表達基因，其中上調基因198個，下調基因128個。紅色表示上調基因，綠色表示下調基因
將326個差異表達基因建立成查詢簽名格式文件，進入CMAP網站(http://www.broad.mit.edu/cmap/)。通過疾病特征性差異基因譜與CMAP中的對照基因表達譜之間的逐一比對，得到正相關和負相關的小分子化合物或藥物和藥物。將結果按connectivity score強度進行排序，正相關取 > 0.7，負相關取 < -0.7，篩選出正負相關的小分子化合物和藥物。數據庫自行計算出P值，值越小代表富集越顯著。得分：由perturbagen中所有實例的關聯系數綜合計算出的富集關聯系數，范圍-1~+1。獲得負分數的小分子化合物和藥物表示與某一特殊的生物過程或狀態有相反或拮抗的聯系；獲得正分數的小分子化合物和藥物則表示與這些小分子化合物和藥物有類似的作用機制。得分 > 0.7可能與ROP正相關；得分 < -0.7可能與ROP負相關。特異性：評估perburbagen和差異基因集(signature of interest)之間關聯系數唯一性值，值越小越好，值越大說明被研究的小分子化合物和藥物有多種生物效應。
將篩選出的小分子化合物和藥物進行文獻檢索，檢索數據庫為美國國立醫學圖書館PubMed、中國期刊全文數據庫。搜尋相關文獻，對照ROP發病機制，了解其在抗氧化治療、環氧化酶抑制劑、血管生成抑制等方面作用機制，確定與ROP正相關或負相關的化合物。
2 結果
差異表達基因CMAP檢索發現，44種小分子化合物和藥物與之存在正相關(表 1)；18種小分子化合物與之存在負相關(表 2)。
表1
CMAP篩選出與ROP正相關的小分子化合物和藥物
表2
CMAP篩選出與ROP負相關的小分子化合物和藥物
文獻檢索發現，44種存在正相關的小分子化合物和藥物中，環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A等4種化合物和藥物可能與ROP存在正相關；18種存在負相關的小分子化合物中，環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒等4種化合物可能與ROP存在負相關。
3 討論
ROP的發病機制通路主要包括缺氧、氧化應激、炎癥以及生后發育遲緩，其中低氧、氧化應激和炎癥往往相互作用，影響血管生長從而導致ROP[9-13]。另有研究發現高碳酸血癥、酸中毒、系統感染也參與ROP的發病[14]。由于ROP的人體視網膜標本難以獲取，而鼠類動物模型的基因和人類不完全相同，因此通過缺氧誘導的ROP動物模型而獲取的基因表達譜改變不能完全反映人類ROP基因改變。石文靜等[15]發現與正常小鼠相比，缺氧誘導的視網膜病變動物模型小鼠有1347個差異基因表達，并呈現出12類不同表達差異變化模式。Tea等[16]發現Sprague Dawley新生大鼠視網膜疾病模型中，差異基因表達251個。CoCl2是一種常用的化學性低氧模擬劑，能誘導多種細胞產生缺氧性損傷，導致細胞存活率降低和細胞凋亡。我們前期研究采用CoCl2誘導視網膜血管內皮細胞缺氧，成功制備視網膜血管內皮細胞缺氧模型，使用芯片技術對其基因表達譜進行檢測，結果發現326個差異表達基因，其中198個基因上調，128個基因下調[8]，為本研究奠定了基礎。
CMAP是利用小分子藥物處理人類細胞后的基因表達差異，建立的一個小分子藥物、基因表現與疾病相互關連的生物應用數據庫，可以協助研究者在藥物開發領域上，快速利用基因表達譜數據比對出疾病高關聯性的藥物，推論大部分藥物分子的主要化學結構，并能歸納出藥物分子可能作用的機制方向[10]。Lamb等[3]、Yanni等[11]成功利用該數據庫探討了阿茲海默癥的治療藥物和四物湯的作用機制。2006年至今，該數據庫已大量應用于腫瘤靶向基因小分子替代物篩選、新藥物適應證預測、精確醫學藥物研發、闡明天然藥物藥理機制等方面，已成為公認的疾病-基因-藥物開發技術平臺[5-7]。
本研究通過CoCl2誘導的視網膜血管內皮細胞缺氧模型模擬ROP基因表達譜改變，導入CMAP中比對后篩選出44種正相關和18種負相關的小分子化合物和藥物作用機制，并將所有化合物和藥物作用機制進行文獻檢索，結果發現環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A等4種化合物和藥物與ROP發病類似，主要是誘導細胞缺氧，血管生成，促進活性氧產生[17-19]。Linden等[17]研究表明環吡酮胺能夠誘導內源的缺氧誘導因子(HIF-1)靶基因的表達，保持HIF-1在低氧條件下的穩定性，抑制氧傳感蛋白羥化酶的功能，并且發現環吡酮胺能夠誘導血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄，提高mRNA和蛋白質的水平，以及導致新生血管生成。本研究與Linden等[17]分析結果一致，從另一方面也證明了CMAP篩選結果的準確性。
經CMAP篩選發現環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒等4種化合物和藥物與ROP負相關。負相關的化合物，理論上可以逆轉基因表達，從而具有治療疾病的作用。研究表明，環腺苷酸是多藥耐藥相關蛋白4的底物，在缺血性新血管形成中扮演重要角色[20]；去甲駱駝蓬堿能夠清除羥基自由基，具有突出的保護作用，能夠顯著增加細胞的存活率，減少突變的發生[21]。Schindler和Mentlein[22]對21種化合物抑制VEGF的分泌抑制乳腺癌細胞的增長能力進行測試，發現柚皮甙抑制能力最強；Keith等[23]研究表明丙磺舒是一種有機陰離子運輸抑制劑，能夠抑制細胞外的環腺苷酸進入視網膜色素上皮細胞內，進而抑制色素顆粒的聚合。
CMAP技術可以協助快速利用基因表達譜數據比對出疾病高關聯性的藥物，本研究基于基因表達芯片技術和CMAP技術發現了與ROP正相關的4種化合物和藥物環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A以及4種負相關小分子化合物和藥物環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒目前。但未見以上化合物和藥物在動物模型或體外細胞模型的研究報道，將來有望對其進行相關研究，為ROP防治藥物研發提供理論依據。
早產兒視網膜病變(ROP)的發病初期病理基礎是視網膜血管生成抑制，缺血、缺氧可抑制視網膜血管生成并成為ROP發病的主要病因之一[1]。目前ROP的治療主要集中在氧濃度控制、抗氧化治療、環氧化酶抑制劑、普萘洛爾、血管生成抑制因子等方面，但多數藥物療效存在爭議且無明確結論[2]。近年隨著分子生物學技術的發展，已經可以利用基因芯片技術對疾病的基因譜表達進行分析。Lamb等[3]在2006年建立了在體外培養并采用小生物活性分子處理后的人體細胞基因表達譜的查詢數據庫，也被稱為連接網絡(CMAP)，目前已收錄超過7000個基因表達譜以及與其相關的1309種小分子化合物和藥物。該數據庫可通過基因表達譜的改變探索化合物的分子效果是與基因表達的作用相似或相反而用于藥物的研發，已廣泛應用到腫瘤靶向基因小分子替代物篩選、基于臨床數據和網絡模塊化的新藥物適應證預測、精確醫學藥物研發、利用基因表達譜聚類分析闡明天然藥物藥理機制等方面的研究[4-7]。但目前利用此數據庫進行眼科疾病與小分子物質之間關系的研究尚少。本研究旨在利用基因表達芯片技術和CMAP技術預測可能對ROP有干預效果的小分子化合物，為ROP干預藥物的研制提供相關理論基礎。現將結果報道如下。
1 材料和方法
體外培養的人胚視網膜血管內皮細胞采用CoCl2處理，建立視網膜血管內皮細胞缺氧模型，模擬ROP病理改變。雙色微陣列法分析差異基因表達，微陣列顯著分析(SAM)軟件篩選差異表達基因，熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應，基因分類法進行基因功能富集分析。Feature extraction軟件獲取并分析數據，得出基因差異倍數，按差異倍數上調≥2.0倍，差異倍數下調≤0.5進行聚類。結果篩查出326個差異表達基因，其中上調基因198個，下調基因128個(圖 1)[8]。本研究利用已發現的326個差異表達基因，進行后續CMAP研究。
圖1
人胚視網膜血管內皮細胞基因表達染色交換熱圖。1A.配對的人胚視網膜血管內皮細胞(對照組)樣本監督聚類分析，顯示有15 400個基因信號強度大于800；1B.與對照組比較，視網膜血管內皮細胞缺氧模型可見326個差異表達基因，其中上調基因198個，下調基因128個。紅色表示上調基因，綠色表示下調基因
將326個差異表達基因建立成查詢簽名格式文件，進入CMAP網站(http://www.broad.mit.edu/cmap/)。通過疾病特征性差異基因譜與CMAP中的對照基因表達譜之間的逐一比對，得到正相關和負相關的小分子化合物或藥物和藥物。將結果按connectivity score強度進行排序，正相關取 > 0.7，負相關取 < -0.7，篩選出正負相關的小分子化合物和藥物。數據庫自行計算出P值，值越小代表富集越顯著。得分：由perturbagen中所有實例的關聯系數綜合計算出的富集關聯系數，范圍-1~+1。獲得負分數的小分子化合物和藥物表示與某一特殊的生物過程或狀態有相反或拮抗的聯系；獲得正分數的小分子化合物和藥物則表示與這些小分子化合物和藥物有類似的作用機制。得分 > 0.7可能與ROP正相關；得分 < -0.7可能與ROP負相關。特異性：評估perburbagen和差異基因集(signature of interest)之間關聯系數唯一性值，值越小越好，值越大說明被研究的小分子化合物和藥物有多種生物效應。
將篩選出的小分子化合物和藥物進行文獻檢索，檢索數據庫為美國國立醫學圖書館PubMed、中國期刊全文數據庫。搜尋相關文獻，對照ROP發病機制，了解其在抗氧化治療、環氧化酶抑制劑、血管生成抑制等方面作用機制，確定與ROP正相關或負相關的化合物。
2 結果
差異表達基因CMAP檢索發現，44種小分子化合物和藥物與之存在正相關(表 1)；18種小分子化合物與之存在負相關(表 2)。
表1
CMAP篩選出與ROP正相關的小分子化合物和藥物
表2
CMAP篩選出與ROP負相關的小分子化合物和藥物
文獻檢索發現，44種存在正相關的小分子化合物和藥物中，環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A等4種化合物和藥物可能與ROP存在正相關；18種存在負相關的小分子化合物中，環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒等4種化合物可能與ROP存在負相關。
3 討論
ROP的發病機制通路主要包括缺氧、氧化應激、炎癥以及生后發育遲緩，其中低氧、氧化應激和炎癥往往相互作用，影響血管生長從而導致ROP[9-13]。另有研究發現高碳酸血癥、酸中毒、系統感染也參與ROP的發病[14]。由于ROP的人體視網膜標本難以獲取，而鼠類動物模型的基因和人類不完全相同，因此通過缺氧誘導的ROP動物模型而獲取的基因表達譜改變不能完全反映人類ROP基因改變。石文靜等[15]發現與正常小鼠相比，缺氧誘導的視網膜病變動物模型小鼠有1347個差異基因表達，并呈現出12類不同表達差異變化模式。Tea等[16]發現Sprague Dawley新生大鼠視網膜疾病模型中，差異基因表達251個。CoCl2是一種常用的化學性低氧模擬劑，能誘導多種細胞產生缺氧性損傷，導致細胞存活率降低和細胞凋亡。我們前期研究采用CoCl2誘導視網膜血管內皮細胞缺氧，成功制備視網膜血管內皮細胞缺氧模型，使用芯片技術對其基因表達譜進行檢測，結果發現326個差異表達基因，其中198個基因上調，128個基因下調[8]，為本研究奠定了基礎。
CMAP是利用小分子藥物處理人類細胞后的基因表達差異，建立的一個小分子藥物、基因表現與疾病相互關連的生物應用數據庫，可以協助研究者在藥物開發領域上，快速利用基因表達譜數據比對出疾病高關聯性的藥物，推論大部分藥物分子的主要化學結構，并能歸納出藥物分子可能作用的機制方向[10]。Lamb等[3]、Yanni等[11]成功利用該數據庫探討了阿茲海默癥的治療藥物和四物湯的作用機制。2006年至今，該數據庫已大量應用于腫瘤靶向基因小分子替代物篩選、新藥物適應證預測、精確醫學藥物研發、闡明天然藥物藥理機制等方面，已成為公認的疾病-基因-藥物開發技術平臺[5-7]。
本研究通過CoCl2誘導的視網膜血管內皮細胞缺氧模型模擬ROP基因表達譜改變，導入CMAP中比對后篩選出44種正相關和18種負相關的小分子化合物和藥物作用機制，并將所有化合物和藥物作用機制進行文獻檢索，結果發現環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A等4種化合物和藥物與ROP發病類似，主要是誘導細胞缺氧，血管生成，促進活性氧產生[17-19]。Linden等[17]研究表明環吡酮胺能夠誘導內源的缺氧誘導因子(HIF-1)靶基因的表達，保持HIF-1在低氧條件下的穩定性，抑制氧傳感蛋白羥化酶的功能，并且發現環吡酮胺能夠誘導血管內皮生長因子(VEGF)的轉錄，提高mRNA和蛋白質的水平，以及導致新生血管生成。本研究與Linden等[17]分析結果一致，從另一方面也證明了CMAP篩選結果的準確性。
經CMAP篩選發現環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒等4種化合物和藥物與ROP負相關。負相關的化合物，理論上可以逆轉基因表達，從而具有治療疾病的作用。研究表明，環腺苷酸是多藥耐藥相關蛋白4的底物，在缺血性新血管形成中扮演重要角色[20]；去甲駱駝蓬堿能夠清除羥基自由基，具有突出的保護作用，能夠顯著增加細胞的存活率，減少突變的發生[21]。Schindler和Mentlein[22]對21種化合物抑制VEGF的分泌抑制乳腺癌細胞的增長能力進行測試，發現柚皮甙抑制能力最強；Keith等[23]研究表明丙磺舒是一種有機陰離子運輸抑制劑，能夠抑制細胞外的環腺苷酸進入視網膜色素上皮細胞內，進而抑制色素顆粒的聚合。
CMAP技術可以協助快速利用基因表達譜數據比對出疾病高關聯性的藥物，本研究基于基因表達芯片技術和CMAP技術發現了與ROP正相關的4種化合物和藥物環吡酮胺、CoCl2、棉酚和醉茄素A以及4種負相關小分子化合物和藥物環腺苷酸、去甲駱駝蓬堿、柚皮甙和丙磺舒目前。但未見以上化合物和藥物在動物模型或體外細胞模型的研究報道，將來有望對其進行相關研究，為ROP防治藥物研發提供理論依據。
