引用本文： 王小東, 王彤, 張紅兵. 非動脈炎性前部缺血性視神經病變患者高密度脂蛋白膽固醇和膽固醇酯轉運蛋白TaqⅠB基因多態性研究. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 587-590. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.006 復制
非動脈炎性前部缺血性視神經病變(NA-AION)是一種視盤循環障礙性疾病，由于供應視盤的睫狀后短動脈供血不足，導致視盤的缺血性改變；其發病機制與缺血性腦卒中相似[1]。已有研究表明，膽固醇酯轉運蛋白(CETP) TaqⅠB基因多態性B1等位基因和血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)功能異常是缺血性腦卒中的危險因素[2, 3]。但CETP TaqⅠB基因多態性和HDL-C是否在NA-AION發生發展中發揮作用目前并不清楚。為此，我們對一組NA-AION患者的CETPTaqⅠB基因多態性和血漿HDL-C進行了檢測，以觀察CETPTaqⅠB基因多態性和血漿HDL-C與NA-AION之間的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為經醫院倫理委員會批準并獲受檢者知情同意的配比病例對照研究；所有受檢者均為陜西籍并長期居住在陜西的漢族人，個體間無血緣關系。
2008年2月到2015年8月我院檢查確診的NA-AION患者45例(NA-AION組)納入研究。其中，男性34例，女性11例。年齡48~74歲，平均年齡(60.0±6.9)歲。患者均主訴視力突然下降。行眼底、眼壓、視野、視覺電生理、光相干斷層掃描、熒光素眼底血管造影檢查，其結果符合NA-AION臨床診斷標準[1]。除外糖尿病、嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全等影響血脂水平疾病者。采用1 :1配比法, 選擇年齡、性別與NA-AION患者相匹配的健康體檢者作為對照組。
實驗室檢測在我院陜西省眼科重點實驗室完成。抽取受檢者安靜狀態下靜脈血5 ml, 1 :6枸櫞酸鈉抗凝, 離心半徑10 cm，2000 r/min離心10 min, 收集血細胞、血漿。應用日本東芝TBA-40FR全自動生化分析儀酶聯免疫一步法檢測血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、HDL-C濃度；按試劑盒參考值，HDL-C濃度低于1.20 mmol/L為低HDL-C血癥。采用低滲溶血-鹽析法提取外周血白細胞基因組DNA，應用Primer 5.0軟件設計針對CETP) TaqⅠB基因的序列引物，由上海生物工程公司合成。聚合酶鏈反應(PCR)擴增相應CETP目的片斷, 引物1(P1)：5′-CACTAGCCCAGA GAGAGGAGTGCC-3′, 引物2(P2)：5′-CTGAGCCC AGCCGCACACTAA-3′[4]。反應體系25.00 μl中，10倍PCR反應緩沖液5.00 μl，MgCl2 4.00 μl，10 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷酸1.00 μl，P1、P2各2.00 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，基因組DNA 5.00 μl。PCR反應條件及時間，95℃預變性5 min, 95℃變性30 s；62℃退火30 s；72℃延伸60 s；循環35次, 72℃延伸7 min。PCR擴增產物TaqⅠ酶切, 采用限制性片段長度多態性PCR (PCR-RFLP)方法進行基因分型，以2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片斷，僅出現535堿基對(bp)1條熒光帶者為B2B2基因型；出現361、174 bp 2條熒光帶者為B1B1基因型；出現535、361、174 bp 3條熒光帶者為B1B2基因型[4](圖 1)。
圖1
CETP酶切電泳圖。M:Marker；1、4:B1B2基因型；2、3、6:B2B2基因型；5:B1B1基因型
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析處理。計量資料符合正態分布的以均數±標準差(x±s)表示, 計數資料采用M(QR)表示。受檢者血脂樣本均數間比較行t檢驗；基因型頻率及等位基因頻率之間比較和兩組基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗行χ2檢驗。Logistics回歸分析基因型及HDL-C對疾病發生的相對危險度。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
NA-AION組、對照組受檢者血漿TC、TG濃度比較，差異無統計學意義(t=1.907、1.877，P=0.063、0.067)；NA-AION組受檢者血漿HDL-C濃度明顯低于對照組受檢者，差異有統計學意義(t=2.367，P=0.022)(表 1)。Logistics回歸分析結果顯示，低HDL-C濃度為NA-AION發病的危險因素[比值比(OR)=6.143，95%可信區間(CI)為1.262~29.895，χ2=27.676；P=0.013]。
表1
NA-AION組、對照組受檢者TC、TG、HDL-C檢測結果
PCR-RFLP分析結果顯示，總受檢者中B1B1、B1B2、B2B2基因型頻率分別為38.9%、42.2%、18.9%。等位基因B1、B2頻率分別為60.0%、40.0%。NA-AION組、對照組受檢者基因型頻率觀察數和期望數均無明顯差異(χ2=0.61、0.05，P > 0.05)，受檢者符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。NA-AION組受檢者B1B1基因型頻率高于對照組受檢者，B1B2、B2B2基因型頻率低于對照組受檢者，差異均有統計學意義(χ2=17.289、14.706、38.444，P < 0.05)；NA-AION組受檢者B1等位基因頻率高于對照組受檢者，B2等位基因頻率低于對照組受檢者，差異有統計學意義(χ2=15.648，P < 0.05)(表 2, 3)。Logistics回歸分析結果顯示，B1B1基因型在NA-AION患者中顯著增多(OR=2.24，95%CI為2.427~36.323，χ2=10.526；P=0.001)。
表2
NA-AION組、對照組受檢者基因型頻率(例，%)
表3
NA-AION組、對照組受檢者等位基因頻率(例，%)
B1B1、B1B2、B2B2基因型者血漿TC濃度比較，差異無統計學意義(t=2.54、1.28、0.04，P > 0.05)；血漿TG濃度比較，B1B1基因型者與B1B2基因型者差異有統計學意義(t=4.50，P=0.04)，B1B1基因型者與B2B2基因型者、B1B2基因型者與B2B2基因型者比較，差異無統計學意義(t=2.62、0.02，P > 0.05)；不同基因型者之間HDL-C濃度比較，差異有統計學意義(t=3.04、4.87、5.41，P < 0.05)，B1B1基因型者血漿HDL-C濃度最低，B2B2基因型者血漿HDL-C濃度最高(表 4)。
表4
不同基因型者血漿TC、TG、HDL-C濃度檢測結果
3 討論
人類CETP基因位于第16號長臂(16q12-21)，其范圍超過25×103 bp，由16個外顯子和15個內含子組成，其外顯子大小從32~250 bp, TaqⅠB多態性是CETP基因第一內含子中第277核苷酸突變，腺嘌呤被鳥嘌呤取代[5]。本研究結果顯示，陜西漢族人群B1B1、B1B2、B2B2基因型頻率分別為38.9%、42.2%、18.9%，B1、B2等位基因頻率分別為60.0%和40.0%；以B1等位基因為主，與劉靜等[4]對北京市自然人群及其他人群的研究結果一致[6-9]。NA-AION組受檢者B1B1基因型頻率高于對照組受檢者，經logistics回歸分析，B1B1基因型為NA-AION發病的獨立危險因素。目前多數研究認為CETP TaqⅠB基因多態性與血漿HDL-C濃度有關，B2等位基因純合子血漿HDL-C濃度最高，B1等位基因純合子血漿HDL-C濃度最低[10, 11]。而Corella等[12]對西班牙人群、Miltiadous等[13]對瑞士正常血脂人群的研究結果卻發現CETP TaqⅠB基因多態性與HDL-C濃度無關。另外Cuchel等[14]對非裔美國人群與高加索地區人群的比較研究和Mitchell等[15]對澳大利亞的意大利移民與希臘移民人群的比較研究，發現CETP TaqⅠB基因多態性與HDL-C濃度作用存在種族差異。本研究結果顯示，陜西漢族人群B2B2基因型HDL-C濃度最高，B1B2基本型次之，B1B1基因型最低，三者之間差異有統計學意義。提示CETP TaqⅠB基因多態性與血漿HDL-C濃度有關。
本研究結果顯示，NA-AION組、對照組受檢者血漿TC、TG濃度差異無統計學意義，與王潤生等[16]研究結果一致。我們進一步觀察了HDL-C對NA-AION的影響，發現NA-AION組受檢者HDL-C濃度低于對照組受檢者，差異有統計學意義。提示低濃度HDL-C為NA-AION發病的一個危險因素。HDL-C可以增強血管壁一氧化氮的生物利用度來恢復內皮細胞的功能，抑制血管內血栓的形成[17]，其機制可能和HDL-C在mRNA水平和蛋白水平抑制細胞間黏附分子-1、血管細胞間黏附分子-1、內皮細胞選擇素的表達，并抑制鞘氨醇激酶、細胞外信號調節激酶、核因子-κB信號級聯反應有關[18]。HDL-C通過其抗炎、抗氧化、抗血栓作用來保護血管內皮細胞，保證睫狀后動脈血液供應充足，防止NA-AION的發生。
陜西漢族人群中CETP TaqⅠB基因多態性B1等位基因對NA-AION發病有一定作用，其中B1B1基因型為NA-AION發病的危險因素，這可能與B1B1基因型下調血漿HDL-C濃度有關。另外，血漿低HDL-C濃度為陜西漢族NA-AION患者發病的獨立危險因素，為進一步研究HDL-C對視網膜血管的作用提供臨床支持。
非動脈炎性前部缺血性視神經病變(NA-AION)是一種視盤循環障礙性疾病，由于供應視盤的睫狀后短動脈供血不足，導致視盤的缺血性改變；其發病機制與缺血性腦卒中相似[1]。已有研究表明，膽固醇酯轉運蛋白(CETP) TaqⅠB基因多態性B1等位基因和血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)功能異常是缺血性腦卒中的危險因素[2, 3]。但CETP TaqⅠB基因多態性和HDL-C是否在NA-AION發生發展中發揮作用目前并不清楚。為此，我們對一組NA-AION患者的CETPTaqⅠB基因多態性和血漿HDL-C進行了檢測，以觀察CETPTaqⅠB基因多態性和血漿HDL-C與NA-AION之間的相關性。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究為經醫院倫理委員會批準并獲受檢者知情同意的配比病例對照研究；所有受檢者均為陜西籍并長期居住在陜西的漢族人，個體間無血緣關系。
2008年2月到2015年8月我院檢查確診的NA-AION患者45例(NA-AION組)納入研究。其中，男性34例，女性11例。年齡48~74歲，平均年齡(60.0±6.9)歲。患者均主訴視力突然下降。行眼底、眼壓、視野、視覺電生理、光相干斷層掃描、熒光素眼底血管造影檢查，其結果符合NA-AION臨床診斷標準[1]。除外糖尿病、嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全等影響血脂水平疾病者。采用1 :1配比法, 選擇年齡、性別與NA-AION患者相匹配的健康體檢者作為對照組。
實驗室檢測在我院陜西省眼科重點實驗室完成。抽取受檢者安靜狀態下靜脈血5 ml, 1 :6枸櫞酸鈉抗凝, 離心半徑10 cm，2000 r/min離心10 min, 收集血細胞、血漿。應用日本東芝TBA-40FR全自動生化分析儀酶聯免疫一步法檢測血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、HDL-C濃度；按試劑盒參考值，HDL-C濃度低于1.20 mmol/L為低HDL-C血癥。采用低滲溶血-鹽析法提取外周血白細胞基因組DNA，應用Primer 5.0軟件設計針對CETP) TaqⅠB基因的序列引物，由上海生物工程公司合成。聚合酶鏈反應(PCR)擴增相應CETP目的片斷, 引物1(P1)：5′-CACTAGCCCAGA GAGAGGAGTGCC-3′, 引物2(P2)：5′-CTGAGCCC AGCCGCACACTAA-3′[4]。反應體系25.00 μl中，10倍PCR反應緩沖液5.00 μl，MgCl2 4.00 μl，10 mmol/L三磷酸脫氧核糖核苷酸1.00 μl，P1、P2各2.00 μl，Taq DNA聚合酶1.25 U，基因組DNA 5.00 μl。PCR反應條件及時間，95℃預變性5 min, 95℃變性30 s；62℃退火30 s；72℃延伸60 s；循環35次, 72℃延伸7 min。PCR擴增產物TaqⅠ酶切, 采用限制性片段長度多態性PCR (PCR-RFLP)方法進行基因分型，以2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片斷，僅出現535堿基對(bp)1條熒光帶者為B2B2基因型；出現361、174 bp 2條熒光帶者為B1B1基因型；出現535、361、174 bp 3條熒光帶者為B1B2基因型[4](圖 1)。
圖1
CETP酶切電泳圖。M:Marker；1、4:B1B2基因型；2、3、6:B2B2基因型；5:B1B1基因型
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析處理。計量資料符合正態分布的以均數±標準差(x±s)表示, 計數資料采用M(QR)表示。受檢者血脂樣本均數間比較行t檢驗；基因型頻率及等位基因頻率之間比較和兩組基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗行χ2檢驗。Logistics回歸分析基因型及HDL-C對疾病發生的相對危險度。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
NA-AION組、對照組受檢者血漿TC、TG濃度比較，差異無統計學意義(t=1.907、1.877，P=0.063、0.067)；NA-AION組受檢者血漿HDL-C濃度明顯低于對照組受檢者，差異有統計學意義(t=2.367，P=0.022)(表 1)。Logistics回歸分析結果顯示，低HDL-C濃度為NA-AION發病的危險因素[比值比(OR)=6.143，95%可信區間(CI)為1.262~29.895，χ2=27.676；P=0.013]。
表1
NA-AION組、對照組受檢者TC、TG、HDL-C檢測結果
PCR-RFLP分析結果顯示，總受檢者中B1B1、B1B2、B2B2基因型頻率分別為38.9%、42.2%、18.9%。等位基因B1、B2頻率分別為60.0%、40.0%。NA-AION組、對照組受檢者基因型頻率觀察數和期望數均無明顯差異(χ2=0.61、0.05，P > 0.05)，受檢者符合Hardy-Weinberg遺傳平衡。NA-AION組受檢者B1B1基因型頻率高于對照組受檢者，B1B2、B2B2基因型頻率低于對照組受檢者，差異均有統計學意義(χ2=17.289、14.706、38.444，P < 0.05)；NA-AION組受檢者B1等位基因頻率高于對照組受檢者，B2等位基因頻率低于對照組受檢者，差異有統計學意義(χ2=15.648，P < 0.05)(表 2, 3)。Logistics回歸分析結果顯示，B1B1基因型在NA-AION患者中顯著增多(OR=2.24，95%CI為2.427~36.323，χ2=10.526；P=0.001)。
表2
NA-AION組、對照組受檢者基因型頻率(例，%)
表3
NA-AION組、對照組受檢者等位基因頻率(例，%)
B1B1、B1B2、B2B2基因型者血漿TC濃度比較，差異無統計學意義(t=2.54、1.28、0.04，P > 0.05)；血漿TG濃度比較，B1B1基因型者與B1B2基因型者差異有統計學意義(t=4.50，P=0.04)，B1B1基因型者與B2B2基因型者、B1B2基因型者與B2B2基因型者比較，差異無統計學意義(t=2.62、0.02，P > 0.05)；不同基因型者之間HDL-C濃度比較，差異有統計學意義(t=3.04、4.87、5.41，P < 0.05)，B1B1基因型者血漿HDL-C濃度最低，B2B2基因型者血漿HDL-C濃度最高(表 4)。
表4
不同基因型者血漿TC、TG、HDL-C濃度檢測結果
3 討論
人類CETP基因位于第16號長臂(16q12-21)，其范圍超過25×103 bp，由16個外顯子和15個內含子組成，其外顯子大小從32~250 bp, TaqⅠB多態性是CETP基因第一內含子中第277核苷酸突變，腺嘌呤被鳥嘌呤取代[5]。本研究結果顯示，陜西漢族人群B1B1、B1B2、B2B2基因型頻率分別為38.9%、42.2%、18.9%，B1、B2等位基因頻率分別為60.0%和40.0%；以B1等位基因為主，與劉靜等[4]對北京市自然人群及其他人群的研究結果一致[6-9]。NA-AION組受檢者B1B1基因型頻率高于對照組受檢者，經logistics回歸分析，B1B1基因型為NA-AION發病的獨立危險因素。目前多數研究認為CETP TaqⅠB基因多態性與血漿HDL-C濃度有關，B2等位基因純合子血漿HDL-C濃度最高，B1等位基因純合子血漿HDL-C濃度最低[10, 11]。而Corella等[12]對西班牙人群、Miltiadous等[13]對瑞士正常血脂人群的研究結果卻發現CETP TaqⅠB基因多態性與HDL-C濃度無關。另外Cuchel等[14]對非裔美國人群與高加索地區人群的比較研究和Mitchell等[15]對澳大利亞的意大利移民與希臘移民人群的比較研究，發現CETP TaqⅠB基因多態性與HDL-C濃度作用存在種族差異。本研究結果顯示，陜西漢族人群B2B2基因型HDL-C濃度最高，B1B2基本型次之，B1B1基因型最低，三者之間差異有統計學意義。提示CETP TaqⅠB基因多態性與血漿HDL-C濃度有關。
本研究結果顯示，NA-AION組、對照組受檢者血漿TC、TG濃度差異無統計學意義，與王潤生等[16]研究結果一致。我們進一步觀察了HDL-C對NA-AION的影響，發現NA-AION組受檢者HDL-C濃度低于對照組受檢者，差異有統計學意義。提示低濃度HDL-C為NA-AION發病的一個危險因素。HDL-C可以增強血管壁一氧化氮的生物利用度來恢復內皮細胞的功能，抑制血管內血栓的形成[17]，其機制可能和HDL-C在mRNA水平和蛋白水平抑制細胞間黏附分子-1、血管細胞間黏附分子-1、內皮細胞選擇素的表達，并抑制鞘氨醇激酶、細胞外信號調節激酶、核因子-κB信號級聯反應有關[18]。HDL-C通過其抗炎、抗氧化、抗血栓作用來保護血管內皮細胞，保證睫狀后動脈血液供應充足，防止NA-AION的發生。
陜西漢族人群中CETP TaqⅠB基因多態性B1等位基因對NA-AION發病有一定作用，其中B1B1基因型為NA-AION發病的危險因素，這可能與B1B1基因型下調血漿HDL-C濃度有關。另外，血漿低HDL-C濃度為陜西漢族NA-AION患者發病的獨立危險因素，為進一步研究HDL-C對視網膜血管的作用提供臨床支持。
