引用本文： 徐敏, 田媛媛, 陳雪, 黃健成, 丁思加, 蔣超, 趙晨. 卷曲蛋白4基因新致病突變p.E160K引起家族性滲出性玻璃體視網膜病變. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 582-586. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.005 復制
家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳。Norrie病(NDP)、卷曲蛋白4(FZD4)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)、四旋蛋白12(TSPAN12)、鋅指蛋白408(ZNF408)基因等5個基因被證實與FEVR有關[1-6]。其中，NDP、FZD4、LRP5及TSPAN12等4個基因編碼的蛋白質在調節視網膜血管生成和發育的Norrin/β-肌動蛋白信號通路中發揮著重要的作用，而ZNF408基因所編碼蛋白在該通路中是如何發揮作用目前研究尚未證實[7, 8]。這5個基因的突變可以解釋50%左右的FEVR病例[9]。本研究針對NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408此5個候選基因的全部編碼區及外顯子-內含子交界區剪切位點附近的序列進行測序，借助共分離驗證及生物信息學分析，明確了一FEVR家系新的致病突變位點FZD4基因p.E160K。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究獲南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者或未成年監護人均簽署知情同意書。
一個3代常染色體顯性遺傳FEVR家系(圖 1)中3例患者及1例患者的配偶納入研究。先證者(Ⅲ1)，男，5歲。足月順產，否認吸氧史；1歲時父母發現其視物目光呆滯伴反應遲鈍。雙眼最佳矯正視力(BCVA)均為0.2。眼底檢查，雙眼可見黃白色視網膜下滲出，視網膜受玻璃體牽拉折疊呈鐮刀狀皺襞樣(圖 2)。先證者母親(Ⅱ2)，33歲。BCVA：右眼0.8，左眼1.0。眼底檢查，雙眼周邊部視網膜下黃白色滲出。熒光素眼底血管造影(FFA)檢查，雙眼周邊視網膜血管可見熒光素滲漏，血管分支較多，末端呈毛刷樣吻合，視網膜血管止端無灌注區(圖 3)。先證者外公(Ⅰ1)，70歲。10余年前外院診斷為FEVR并因視網膜脫離行玻璃體切割手術；雙眼白內障摘除手術后，BCVA均為0.15。先證者父親(Ⅱ3)，35歲。雙眼BCVA均為1.0。眼底及FFA檢查均未見明顯異常。依據臨床檢查結果并結合家系分析，患者符合常染色體顯性遺傳FEVR診斷標準[10]。
圖1
患者家系圖。■：男性患者；●：女性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先證者；G/A和G/G分別代表正常者和患者在FZD4基因第478位的基因型
圖2
先證者雙眼彩色眼底像。2A.右眼；2B.左眼。視網膜下黃白色滲出，視網膜受玻璃體牽拉折疊呈鐮刀狀皺襞樣
圖3
先證者母親雙眼FFA像。3A.右眼；3B.左眼。視網膜顳側周邊血管中斷，呈毛刷樣吻合，明顯無灌注區，交界處可見熒光素滲漏`
采集家系中患者及先證者父親外周靜脈血10 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國QIAGEN公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA。應用Primer 5.0引物設計軟件，設計針對候選致病基因NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408的全部編碼區及外顯子-內含子交界區剪切位點附近
的序列引物(
表1
NDP、FZD4、LRP5基因擴增和測序引物
表2
TSPAN12、ZNF408基因擴增和測序引物
采用Chromas軟件對原始測序結果進行分析，查找存在的單核苷酸雜合變異；應用Vector NTI軟件對測序結果和NCBI人類基因組DNA序列進行比對，查找出單核苷酸純和變異以及插入和缺失變異(InDel)，得到候選基因的全部變異。將檢測出的單核苷酸變異(SNV)及InDel首先在單核苷酸多態性數據庫(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp144.txt.gz.)、國際單倍型數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千人基因組計劃(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、炎黃數據庫(http://yh.genomics.org.cn/)、外顯子組變異數據庫(http://evs.gs.Washington.edu/EVS/)及外顯子組集合聯合數據庫(http://exac.broadinstitute.org/)等6個SNP數據庫中進行比對[
應用Vector NTI軟件將所發現的突變位點的蛋白序列在人、猩猩、犬、牛、豬、鼠、雞及斑馬魚等多個物種中進行同源性分析和比對；在線工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及ALIGN-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/)預測氨基酸突變對蛋白功能的影響[
2 結果
3例患者及先證者父親共檢測到5個SNV (表 3)，濾過MAF值高于0.001的高頻變異位點4個，可疑致病突變位點1個即FZD4基因c.478G > A。該突變位點所對應的氨基酸改變為FZD4基因所編碼蛋白的第160號氨基酸從谷氨酸突變為賴氨酸(p.E160K)(圖 4)。基因型和表型共分離驗證結果，FZD4 p.E160K為患者的致病突變位點。
表3
3例患者及先證者父親攜帶的所有遺傳突變
圖4
FZD4基因測序圖。4A.先證者，FZD4基因第2外顯子的c.478G > A p.E160K錯義突變(黑箭)；4B.先證者父親，該位點不存在突變
蛋白序列同源性分析結果顯示，FZD4 p.E160K突變所對應的第160號氨基酸位點在多個物種中均高度保守(圖 5)。在線軟件預測結果顯示，該突變PolyPhen-2得分為0.804，提示為可能有害，ALIGN-GVGD等級為C55，提示為可能有害。晶體結構分析結果提示，該突變能夠引起第160號氨基酸位點與第152號天冬酰胺間的氫鍵消失，從而影響蛋白的三級結構(圖 6)。
圖5
FZD4蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。FZD4 p.E160K突變所對應的第160號氨基酸位點在人(H. sapiens)、猩猩(P. troglodytes)、犬(C. lupus)、牛(B. taurus)、豬(S. scrofa)、鼠(M. musculus)、雞(G. Gallus)、斑馬魚(D. rerio)中均高度保守(黑箭)
圖6
FZD4蛋白的晶體結構分析圖。6A.野生型FZD4蛋白第160號氨基酸位點的谷氨酸與第152號氨基酸位點的天冬酰胺間存在氫鍵連接；6B.突變型FZD4蛋白第160號氨基酸位點的賴氨酸與第152號氨基酸位點的天冬酰胺間的氫鍵消失
3 討論
本研究在一個3代常染色體顯性遺傳FEVR家系中發現了FZD4基因新的致病突變p.E160K。FZD4基因位于人類染色體11q14.2，基因全長7383個堿基，包含2個外顯子，其編碼的FZD4蛋白包含有537個氨基酸。FZD4蛋白屬于卷曲蛋白家族，為7次
跨膜蛋白，結構類似于G蛋白偶聯型受體。FZD4蛋白的胞外段含有一個由10個半胱氨酸組成的半胱氨酸富集區(CRD)，該區在卷曲蛋白家族中高度保守，并決定了其與Wnt配體結合的特異性[16]。FZD4作用于胞質內的蓬亂蛋白(Dsh)，Dsh能切斷β-鏈蛋白(beta-catenin)的降解途徑，從而使β-鏈蛋白在細胞質中積累，并進入細胞核，調節靶基因的表達[17]。Wnt信號通路在視網膜的血管發育過程中調控內皮細胞的生長和發育。本研究發現的錯義突變FZD4 p.E160K就位于該CRD區，且突變所在的第160號氨基酸位點在多物種中均高度保守性，提示該突變可能會影響FZD4蛋白與配體的結合而引起嚴重的臨床表型。
FZD4基因突變具有顯著的臨床異質性。不同的FZD4基因突變所引起的蛋白功能異常并不相同，故攜帶有不同FZD4基因突變的患者其臨床表現各異[18]；此外，即使在攜帶有同一FZD4基因突變的同一家系內部，不同患者的臨床表現也各不相同[19]。與既往研究結果相一致，本研究家系中3例患者的臨床表現同樣存在較大差異。此前有研究表明，在一個家系中可能存在多個FEVR的致病基因突變，同時攜帶FZD4和LRP5突變的患者其臨床癥狀更為嚴重[20, 21]。FZD4、LRP5基因均位于11號染色體，LRP5基因所編碼的LRP5蛋白的胞外段與FZD4蛋白相互結合形成受體復合物，與NDP基因所編碼的Wnt信號通路非典型配體Norrin蛋白相互作用，從而將Wnt信號從細胞外傳遞到細胞內[8, 17]。Qin等[22]通過實驗證實，相較于單一突變，FZD4 p.R417Q和LRP5 p.R444C聯合突變能夠導致Wnt信號通路的活性顯著降低。在本家系中，先證者母親視力正常，而先證者及其外公視力明顯較差。因此，我們推測先證者及其外公所檢測出的LRP5 p.A1330V單核苷酸多態性位點可能對患者的表型具有潛在的調節作用。具體是如何發揮調節作用的，需要更進一步的研究結果證實。
FEVR具有明顯的臨床異質性，部分患者早期無明顯視力異常，常規眼科檢查容易漏診。對于有明顯家族史的家系，基因篩查更能明確診斷。本研究采取的目的基因篩查，有助于幫助患者更加明確地了解致病原因，為產前診斷或是試管嬰兒胚胎移植前基因診斷提供重要依據；相比于全外顯子組測序或是全基因組測序具有更加快速、簡便、經濟的優點。還有很多與FEVR有關的致病基因尚未被認知，新的致病基因的發現及其致病機制的研究，將有助于我們對該疾病的進一步認識。
家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)的遺傳方式有常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖遺傳。Norrie病(NDP)、卷曲蛋白4(FZD4)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)、四旋蛋白12(TSPAN12)、鋅指蛋白408(ZNF408)基因等5個基因被證實與FEVR有關[1-6]。其中，NDP、FZD4、LRP5及TSPAN12等4個基因編碼的蛋白質在調節視網膜血管生成和發育的Norrin/β-肌動蛋白信號通路中發揮著重要的作用，而ZNF408基因所編碼蛋白在該通路中是如何發揮作用目前研究尚未證實[7, 8]。這5個基因的突變可以解釋50%左右的FEVR病例[9]。本研究針對NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408此5個候選基因的全部編碼區及外顯子-內含子交界區剪切位點附近的序列進行測序，借助共分離驗證及生物信息學分析，明確了一FEVR家系新的致病突變位點FZD4基因p.E160K。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究獲南京醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準；嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有受試者或未成年監護人均簽署知情同意書。
一個3代常染色體顯性遺傳FEVR家系(圖 1)中3例患者及1例患者的配偶納入研究。先證者(Ⅲ1)，男，5歲。足月順產，否認吸氧史；1歲時父母發現其視物目光呆滯伴反應遲鈍。雙眼最佳矯正視力(BCVA)均為0.2。眼底檢查，雙眼可見黃白色視網膜下滲出，視網膜受玻璃體牽拉折疊呈鐮刀狀皺襞樣(圖 2)。先證者母親(Ⅱ2)，33歲。BCVA：右眼0.8，左眼1.0。眼底檢查，雙眼周邊部視網膜下黃白色滲出。熒光素眼底血管造影(FFA)檢查，雙眼周邊視網膜血管可見熒光素滲漏，血管分支較多，末端呈毛刷樣吻合，視網膜血管止端無灌注區(圖 3)。先證者外公(Ⅰ1)，70歲。10余年前外院診斷為FEVR并因視網膜脫離行玻璃體切割手術；雙眼白內障摘除手術后，BCVA均為0.15。先證者父親(Ⅱ3)，35歲。雙眼BCVA均為1.0。眼底及FFA檢查均未見明顯異常。依據臨床檢查結果并結合家系分析，患者符合常染色體顯性遺傳FEVR診斷標準[10]。
圖1
患者家系圖。■：男性患者；●：女性患者；□：正常男性；○：正常女性；↑：先證者；G/A和G/G分別代表正常者和患者在FZD4基因第478位的基因型
圖2
先證者雙眼彩色眼底像。2A.右眼；2B.左眼。視網膜下黃白色滲出，視網膜受玻璃體牽拉折疊呈鐮刀狀皺襞樣
圖3
先證者母親雙眼FFA像。3A.右眼；3B.左眼。視網膜顳側周邊血管中斷，呈毛刷樣吻合，明顯無灌注區，交界處可見熒光素滲漏`
采集家系中患者及先證者父親外周靜脈血10 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國QIAGEN公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA。應用Primer 5.0引物設計軟件，設計針對候選致病基因NDP、FZD4、LRP5、TSPAN12及ZNF408的全部編碼區及外顯子-內含子交界區剪切位點附近
的序列引物(
表1
NDP、FZD4、LRP5基因擴增和測序引物
表2
TSPAN12、ZNF408基因擴增和測序引物
采用Chromas軟件對原始測序結果進行分析，查找存在的單核苷酸雜合變異；應用Vector NTI軟件對測序結果和NCBI人類基因組DNA序列進行比對，查找出單核苷酸純和變異以及插入和缺失變異(InDel)，得到候選基因的全部變異。將檢測出的單核苷酸變異(SNV)及InDel首先在單核苷酸多態性數據庫(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp144.txt.gz.)、國際單倍型數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)、千人基因組計劃(ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp)、炎黃數據庫(http://yh.genomics.org.cn/)、外顯子組變異數據庫(http://evs.gs.Washington.edu/EVS/)及外顯子組集合聯合數據庫(http://exac.broadinstitute.org/)等6個SNP數據庫中進行比對[
應用Vector NTI軟件將所發現的突變位點的蛋白序列在人、猩猩、犬、牛、豬、鼠、雞及斑馬魚等多個物種中進行同源性分析和比對；在線工具PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)及ALIGN-GVGD (http://agvgd.iarc.fr/)預測氨基酸突變對蛋白功能的影響[
2 結果
3例患者及先證者父親共檢測到5個SNV (表 3)，濾過MAF值高于0.001的高頻變異位點4個，可疑致病突變位點1個即FZD4基因c.478G > A。該突變位點所對應的氨基酸改變為FZD4基因所編碼蛋白的第160號氨基酸從谷氨酸突變為賴氨酸(p.E160K)(圖 4)。基因型和表型共分離驗證結果，FZD4 p.E160K為患者的致病突變位點。
表3
3例患者及先證者父親攜帶的所有遺傳突變
圖4
FZD4基因測序圖。4A.先證者，FZD4基因第2外顯子的c.478G > A p.E160K錯義突變(黑箭)；4B.先證者父親，該位點不存在突變
蛋白序列同源性分析結果顯示，FZD4 p.E160K突變所對應的第160號氨基酸位點在多個物種中均高度保守(圖 5)。在線軟件預測結果顯示，該突變PolyPhen-2得分為0.804，提示為可能有害，ALIGN-GVGD等級為C55，提示為可能有害。晶體結構分析結果提示，該突變能夠引起第160號氨基酸位點與第152號天冬酰胺間的氫鍵消失，從而影響蛋白的三級結構(圖 6)。
圖5
FZD4蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。FZD4 p.E160K突變所對應的第160號氨基酸位點在人(H. sapiens)、猩猩(P. troglodytes)、犬(C. lupus)、牛(B. taurus)、豬(S. scrofa)、鼠(M. musculus)、雞(G. Gallus)、斑馬魚(D. rerio)中均高度保守(黑箭)
圖6
FZD4蛋白的晶體結構分析圖。6A.野生型FZD4蛋白第160號氨基酸位點的谷氨酸與第152號氨基酸位點的天冬酰胺間存在氫鍵連接；6B.突變型FZD4蛋白第160號氨基酸位點的賴氨酸與第152號氨基酸位點的天冬酰胺間的氫鍵消失
3 討論
本研究在一個3代常染色體顯性遺傳FEVR家系中發現了FZD4基因新的致病突變p.E160K。FZD4基因位于人類染色體11q14.2，基因全長7383個堿基，包含2個外顯子，其編碼的FZD4蛋白包含有537個氨基酸。FZD4蛋白屬于卷曲蛋白家族，為7次
跨膜蛋白，結構類似于G蛋白偶聯型受體。FZD4蛋白的胞外段含有一個由10個半胱氨酸組成的半胱氨酸富集區(CRD)，該區在卷曲蛋白家族中高度保守，并決定了其與Wnt配體結合的特異性[16]。FZD4作用于胞質內的蓬亂蛋白(Dsh)，Dsh能切斷β-鏈蛋白(beta-catenin)的降解途徑，從而使β-鏈蛋白在細胞質中積累，并進入細胞核，調節靶基因的表達[17]。Wnt信號通路在視網膜的血管發育過程中調控內皮細胞的生長和發育。本研究發現的錯義突變FZD4 p.E160K就位于該CRD區，且突變所在的第160號氨基酸位點在多物種中均高度保守性，提示該突變可能會影響FZD4蛋白與配體的結合而引起嚴重的臨床表型。
FZD4基因突變具有顯著的臨床異質性。不同的FZD4基因突變所引起的蛋白功能異常并不相同，故攜帶有不同FZD4基因突變的患者其臨床表現各異[18]；此外，即使在攜帶有同一FZD4基因突變的同一家系內部，不同患者的臨床表現也各不相同[19]。與既往研究結果相一致，本研究家系中3例患者的臨床表現同樣存在較大差異。此前有研究表明，在一個家系中可能存在多個FEVR的致病基因突變，同時攜帶FZD4和LRP5突變的患者其臨床癥狀更為嚴重[20, 21]。FZD4、LRP5基因均位于11號染色體，LRP5基因所編碼的LRP5蛋白的胞外段與FZD4蛋白相互結合形成受體復合物，與NDP基因所編碼的Wnt信號通路非典型配體Norrin蛋白相互作用，從而將Wnt信號從細胞外傳遞到細胞內[8, 17]。Qin等[22]通過實驗證實，相較于單一突變，FZD4 p.R417Q和LRP5 p.R444C聯合突變能夠導致Wnt信號通路的活性顯著降低。在本家系中，先證者母親視力正常，而先證者及其外公視力明顯較差。因此，我們推測先證者及其外公所檢測出的LRP5 p.A1330V單核苷酸多態性位點可能對患者的表型具有潛在的調節作用。具體是如何發揮調節作用的，需要更進一步的研究結果證實。
FEVR具有明顯的臨床異質性，部分患者早期無明顯視力異常，常規眼科檢查容易漏診。對于有明顯家族史的家系，基因篩查更能明確診斷。本研究采取的目的基因篩查，有助于幫助患者更加明確地了解致病原因，為產前診斷或是試管嬰兒胚胎移植前基因診斷提供重要依據；相比于全外顯子組測序或是全基因組測序具有更加快速、簡便、經濟的優點。還有很多與FEVR有關的致病基因尚未被認知，新的致病基因的發現及其致病機制的研究，將有助于我們對該疾病的進一步認識。
