中國有800多萬盲人，其中三分之一為視網膜變性疾病所致。干細胞（SC）移植可延緩光感受器細胞變性或替代凋亡的光感器細胞，為光感受器細胞變性為病理損害特征的視網膜變性疾病治療帶來了希望。SC移植治療致盲性眼病過程中，種子細胞是制約SC移植開展并取得成功的瓶頸問題。理想的種子細胞應當具有良好的安全性和再生能力，并且來源廣泛、容易實現標準化和產業化。胚胎SC經三維培養獲得的種子細胞是一種理想的種子細胞，胚胎SC三維培養是獲取治療致盲性眼病種子細胞的新策略。
引用本文： 吳畏, 陰正勤. 加強胚胎干細胞三維培養研究, 優化干細胞移植種子細胞獲取策略. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 573-575. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.003 復制
干細胞(SC)是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，在特定條件下可分化成不同類型、具備特異分子標志和特殊功能的成熟細胞；具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。基于SC的細胞療法有望延緩光感受器細胞變性或替代凋亡的視網膜細胞，為老年性黃斑變性(AMD)、視網膜色素變性(RP)等視網膜變性疾病的治療帶來了希望。根據來源不同，SC可分為胚胎SC (ESC)和成體SC (ASC)。ESC主要來源于胚泡的內細胞團，ASC則來源于出生后的器官或成年個體組織。SC移植治療眼病過程中，種子細胞是制約SC移植開展并取得成功的瓶頸問題。理想的種子細胞應當來源容易，成瘤風險小，安全性好，再生能力強，分化潛能好，容易實現標準化和產業化。如何獲得治療致盲性眼病理想的種子細胞是當下值得特別關注的問題。
1 ESC來源的種子細胞
ESC是從胚泡(由50~100個細胞組成的早期胚胎)未分化的內部細胞團中得到的干細胞，來源于著床前胚胎細胞，是所有身體細胞最初期的形態，并可以發育成各種細胞和三個胚層的組織，具有體外培養無限增生、自我更新和多向分化的特性。1998年，Thomson等[1]建立了第一個人ESC (hESC)系，為利用ESC治療疾病奠定了基礎。
研究發現，ESC可通過添加特定的細胞因子，直接分化為視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞等眼病治療細胞。移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后，能夠有效延緩視網膜變性過程[2, 3]。ESC具有來源穩定，分化潛能好，容易實現產業化等優點，目前國際上已有多家科研單位和公司開展了hESC來源的RPE細胞(hESC-RPE)的臨床試驗。其中，美國ACD公司率先公布了hESC-RPE治療AMD和Stargardt病患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結果。接受治療的18例患者中，13例患者視網膜下出現色素斑，占72%；10例患者視力改善，占56%；視力不變者7眼，占39%；視力降低者1例，占5%。該臨床試驗初步證實了hESC-RPE對于治療視網膜變性疾病的有效性和安全性[4]。我們也采用臨床級hESC系成功誘導出RPE細胞，通過臨床試驗發現，hESC-RPE移植可有效治療濕性AMD，實現了SC治療致盲性眼病新的突破[5]。
但ESC分化潛力巨大，有可能導致腫瘤形成。未分化的ESC混入移植細胞可能會引起畸胎瘤。有實驗結果顯示，移植5000個hESC到各種動物模型中都可形成畸胎瘤[6]。
2 ASC來源的種子細胞
ASC存在于發育成熟個體內已分化組織中具有自我復制能力的未分化細胞，可自我更新并能分化為其所在組織起源的所有細胞類型。特定條件下，ASC或產生新的SC，抑或按一定程序分化為新的成體細胞，從而維持機體正常的新陳代謝，修復已受損細胞組織，使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡。
ASC是組織發育和修復再生的基礎，與ESC “全能性”不同，ASC僅具有一定的分化“可塑性”。ASC存在于特定組織中，不具備自主分裂轉化為人體任何一種細胞的能力，無法獨立產生完整個體，但可向特定組織分化，具有特殊功能。有研究表明，ASC不僅能分化為特定譜系細胞，還能分化成為在發育上無關的其他譜系細胞。這提示ASC具有較大的分化潛能，可在組織修復等多種疾病的治療中發揮重要作用。
研究發現，間充質SC、神經SC和視網膜祖細胞等ASC移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后可通過多種機制有效延緩視網膜變性過程[7, 8]。其中，間充質SC主要是通過抗炎、免疫調節和神經營養的途徑來發揮作用[9]。骨髓間充質SC由于可實現自體移植，大大降低了免疫排斥反應，倍受青睞。國際上已有多家科研單位開展了人骨髓間充質SC治療視網膜變性疾病的臨床試驗，移植方式包括視網膜下腔移植、玻璃體腔移植、靜脈注射、球后注射等。我們研究發現，神經SC可通過抑制小膠質細胞的激活來延緩視網膜變性過程[7]。美國Stem Cells公司已率先開展人神經SC移植治療干性AMD的臨床試驗。視網膜祖細胞可分化為多種視網膜細胞，從而替代修復患者受損的光感受器細胞。我們發現，Ckit是視網膜祖細胞的表面標記物，可通過Ckit來流式篩選、富集視網膜祖細胞；并且Ckit陽性的視網膜祖細胞能夠在體內分化為光感受器細胞，延緩視網膜變性過程[10]。除此之外，我們實驗室將胚胎組織來源的人視網膜祖細胞移植到RP患者視網膜下，手術操作安全；手術后隨訪1年，患者手術后耐受較好，無免疫排斥反應，患者視力得到一定程度改善[11]。
除了直接移植ASC以外，也可在體外將ASC誘導分化為特定的致盲性眼病治療細胞后再移植。我們發現，骨髓間充質SC可分化為RPE細胞和視網膜神經前體樣細胞[12, 13]，自體骨髓間充質SC來源的致盲性眼病治療細胞移植有望大大降低免疫排斥反應，促進種子細胞的存活。與ESC相比，ASC成瘤性小，更加安全，但來源有限，難以實現產業化。為確保細胞的質量和安全，必須對供者進行遺傳病和流行病篩查；ASC來源的多樣性、采集、處理和加工過程難以標準化都限制了ASC的廣泛臨床應用。
3 三維培養技術獲得的種子細胞
三維培養技術是最新的SC分化技術。2011年日本理化研究所笹井芳樹[14]團隊通過三維培養使小鼠ESC自發形成視杯樣結構，2012年又成功地將hESC誘導為視杯樣結構[15]。該研究通過體外培養再現了視網膜的體內發育過程，是SC研究的重大突破。通過三維培養技術來獲得的種子細胞不僅來源廣泛，并且極大地避免了未分化的ESC混入移植細胞，成瘤風險小，安全性好，同時也容易實現標準化和產業化，是治療致盲性眼病的理想的種子細胞。
我們發現，hESC經三維培養可獲得增生能力更強、可塑性更好的RPE種子細胞，移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后可有效延緩視網膜變性過程，是一種新的治療視網膜變性的種子細胞[16]。我們還發現，通過提高氧濃度可有效提高三維培養中神經視網膜的形成[17]。三維培養有望同時獲得多種致盲性眼病治療細胞，并且在疾病模型的制備和藥物篩選等領域也具有巨大的應用前景。
值得注意的是，異體細胞移植所帶來的免疫排斥難以完全避免。因此，必須建立統一規范的移植標準，包括移植時機、移植途徑、移植細胞數量、臨床主要觀察評價指標和相應的處理方案，以確保臨床受試者的安全。如何進一步降低免疫排斥反應也需要進一步深入研究。
SC三維培養的諸多優點使其有望成為獲得致盲性眼病治療種子細胞的重要方法。但是它離大規模臨床應用還有很長的路要走，未來的研究工作需要進一步提高致盲性眼病治療種子細胞的誘導效率，優化誘導方法，加速實現標準化和產業化。
干細胞(SC)是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，在特定條件下可分化成不同類型、具備特異分子標志和特殊功能的成熟細胞；具有再生各種組織器官和人體的潛在功能。基于SC的細胞療法有望延緩光感受器細胞變性或替代凋亡的視網膜細胞，為老年性黃斑變性(AMD)、視網膜色素變性(RP)等視網膜變性疾病的治療帶來了希望。根據來源不同，SC可分為胚胎SC (ESC)和成體SC (ASC)。ESC主要來源于胚泡的內細胞團，ASC則來源于出生后的器官或成年個體組織。SC移植治療眼病過程中，種子細胞是制約SC移植開展并取得成功的瓶頸問題。理想的種子細胞應當來源容易，成瘤風險小，安全性好，再生能力強，分化潛能好，容易實現標準化和產業化。如何獲得治療致盲性眼病理想的種子細胞是當下值得特別關注的問題。
1 ESC來源的種子細胞
ESC是從胚泡(由50~100個細胞組成的早期胚胎)未分化的內部細胞團中得到的干細胞，來源于著床前胚胎細胞，是所有身體細胞最初期的形態，并可以發育成各種細胞和三個胚層的組織，具有體外培養無限增生、自我更新和多向分化的特性。1998年，Thomson等[1]建立了第一個人ESC (hESC)系，為利用ESC治療疾病奠定了基礎。
研究發現，ESC可通過添加特定的細胞因子，直接分化為視網膜色素上皮(RPE)細胞、光感受器細胞等眼病治療細胞。移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后，能夠有效延緩視網膜變性過程[2, 3]。ESC具有來源穩定，分化潛能好，容易實現產業化等優點，目前國際上已有多家科研單位和公司開展了hESC來源的RPE細胞(hESC-RPE)的臨床試驗。其中，美國ACD公司率先公布了hESC-RPE治療AMD和Stargardt病患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗結果。接受治療的18例患者中，13例患者視網膜下出現色素斑，占72%；10例患者視力改善，占56%；視力不變者7眼，占39%；視力降低者1例，占5%。該臨床試驗初步證實了hESC-RPE對于治療視網膜變性疾病的有效性和安全性[4]。我們也采用臨床級hESC系成功誘導出RPE細胞，通過臨床試驗發現，hESC-RPE移植可有效治療濕性AMD，實現了SC治療致盲性眼病新的突破[5]。
但ESC分化潛力巨大，有可能導致腫瘤形成。未分化的ESC混入移植細胞可能會引起畸胎瘤。有實驗結果顯示，移植5000個hESC到各種動物模型中都可形成畸胎瘤[6]。
2 ASC來源的種子細胞
ASC存在于發育成熟個體內已分化組織中具有自我復制能力的未分化細胞，可自我更新并能分化為其所在組織起源的所有細胞類型。特定條件下，ASC或產生新的SC，抑或按一定程序分化為新的成體細胞，從而維持機體正常的新陳代謝，修復已受損細胞組織，使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡。
ASC是組織發育和修復再生的基礎，與ESC “全能性”不同，ASC僅具有一定的分化“可塑性”。ASC存在于特定組織中，不具備自主分裂轉化為人體任何一種細胞的能力，無法獨立產生完整個體，但可向特定組織分化，具有特殊功能。有研究表明，ASC不僅能分化為特定譜系細胞，還能分化成為在發育上無關的其他譜系細胞。這提示ASC具有較大的分化潛能，可在組織修復等多種疾病的治療中發揮重要作用。
研究發現，間充質SC、神經SC和視網膜祖細胞等ASC移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后可通過多種機制有效延緩視網膜變性過程[7, 8]。其中，間充質SC主要是通過抗炎、免疫調節和神經營養的途徑來發揮作用[9]。骨髓間充質SC由于可實現自體移植，大大降低了免疫排斥反應，倍受青睞。國際上已有多家科研單位開展了人骨髓間充質SC治療視網膜變性疾病的臨床試驗，移植方式包括視網膜下腔移植、玻璃體腔移植、靜脈注射、球后注射等。我們研究發現，神經SC可通過抑制小膠質細胞的激活來延緩視網膜變性過程[7]。美國Stem Cells公司已率先開展人神經SC移植治療干性AMD的臨床試驗。視網膜祖細胞可分化為多種視網膜細胞，從而替代修復患者受損的光感受器細胞。我們發現，Ckit是視網膜祖細胞的表面標記物，可通過Ckit來流式篩選、富集視網膜祖細胞；并且Ckit陽性的視網膜祖細胞能夠在體內分化為光感受器細胞，延緩視網膜變性過程[10]。除此之外，我們實驗室將胚胎組織來源的人視網膜祖細胞移植到RP患者視網膜下，手術操作安全；手術后隨訪1年，患者手術后耐受較好，無免疫排斥反應，患者視力得到一定程度改善[11]。
除了直接移植ASC以外，也可在體外將ASC誘導分化為特定的致盲性眼病治療細胞后再移植。我們發現，骨髓間充質SC可分化為RPE細胞和視網膜神經前體樣細胞[12, 13]，自體骨髓間充質SC來源的致盲性眼病治療細胞移植有望大大降低免疫排斥反應，促進種子細胞的存活。與ESC相比，ASC成瘤性小，更加安全，但來源有限，難以實現產業化。為確保細胞的質量和安全，必須對供者進行遺傳病和流行病篩查；ASC來源的多樣性、采集、處理和加工過程難以標準化都限制了ASC的廣泛臨床應用。
3 三維培養技術獲得的種子細胞
三維培養技術是最新的SC分化技術。2011年日本理化研究所笹井芳樹[14]團隊通過三維培養使小鼠ESC自發形成視杯樣結構，2012年又成功地將hESC誘導為視杯樣結構[15]。該研究通過體外培養再現了視網膜的體內發育過程，是SC研究的重大突破。通過三維培養技術來獲得的種子細胞不僅來源廣泛，并且極大地避免了未分化的ESC混入移植細胞，成瘤風險小，安全性好，同時也容易實現標準化和產業化，是治療致盲性眼病的理想的種子細胞。
我們發現，hESC經三維培養可獲得增生能力更強、可塑性更好的RPE種子細胞，移植到視網膜變性動物模型的視網膜下腔后可有效延緩視網膜變性過程，是一種新的治療視網膜變性的種子細胞[16]。我們還發現，通過提高氧濃度可有效提高三維培養中神經視網膜的形成[17]。三維培養有望同時獲得多種致盲性眼病治療細胞，并且在疾病模型的制備和藥物篩選等領域也具有巨大的應用前景。
值得注意的是，異體細胞移植所帶來的免疫排斥難以完全避免。因此，必須建立統一規范的移植標準，包括移植時機、移植途徑、移植細胞數量、臨床主要觀察評價指標和相應的處理方案，以確保臨床受試者的安全。如何進一步降低免疫排斥反應也需要進一步深入研究。
SC三維培養的諸多優點使其有望成為獲得致盲性眼病治療種子細胞的重要方法。但是它離大規模臨床應用還有很長的路要走，未來的研究工作需要進一步提高致盲性眼病治療種子細胞的誘導效率，優化誘導方法，加速實現標準化和產業化。