基因診斷技術的快速發展，為基因治療奠定了基礎并拓展了廣闊空間。基因替代療法、抗新生血管基因療法、光遺傳基因療法等多種方法的視網膜疾病基因治療臨床試驗正在開展并取得豐碩成果，逐步證實了遺傳性視網膜疾病基因治療的有效性和安全性。新興的基因編輯技術在治療視網膜顯性遺傳或基因較大不能應用腺相關病毒載體治療的隱性遺傳病的動物實驗研究也展現了良好的前景，使大部分視網膜遺傳疾病理論上都有希望用安全高效的腺相關病毒載體得到治療。了解遺傳性視網膜疾病基因治療趨勢與面臨的挑戰，共同努力面對挑戰，相信基因治療很快將造福于中國遺傳性視網膜疾病患者。
引用本文： 龐繼景, 徐帆. 遺傳性視網膜疾病基因治療趨勢與面臨的挑戰. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 569-572. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.002 復制
基因診斷與疾病動物模型制作兩方面的技術進步和成本降低，使越來越多的致病基因被發現，其功能被確認。這為疾病基因治療奠定了基礎并且促進了基因治療研究的進展。視網膜具有解剖層次清晰且相對封閉、視網膜下腔具有免疫豁免、載體應用量較少且易于到達病變區域、操作者在直視狀態下可以準確注射和觀察治療變化、療效容易判斷等優勢，使得遺傳性視網膜疾病成為基因治療研究關注研究最多的疾病。上世紀90年代開始興起的基因治療研究，本世紀初終于首先在眼科遺傳性視網膜疾病領域獲得突破[1, 2]。將相關正常基因在不可逆性病理改變出現前轉入由于基因隱性突變造成的具有功能性蛋白缺失的相應細胞，不但可以迅速恢復視功能和(或)視行為，還可以阻止相應視網膜變性的發生，達到治愈目的[1]。從2007年開始第一個視網膜色素上皮(RPE)65基因突變引起的Leber先天性黑矇(LCA)2型(LCA2)臨床床試驗以來，基因治療在遺傳性視網膜疾病中的應用取得了令人矚目的進展。視網膜疾病特別是遺傳性視網膜疾病基因治療已成為基因治療領域的熱點并展現出廣闊的應用前景。
1 遺傳性視網膜疾病基因替代治療
截止2016年10月，已有293種遺傳性視網膜疾病的致病基因被發現，256種基因已經完成功能鑒定(https://sph.uth.edu/retnet/)。針對這些基因，目前已開展多項基因治療臨床試驗。其中較為有影響的包括RPE65基因突變引起的LCA2、MERTK基因突變引起的視網膜色素變性(RP)、REP1基因突變引起的無脈絡膜癥、ABCA4基因突變引起的Stargardt病、視網膜劈裂1(RS1)基因突變引起的青少年型視網膜劈裂癥(性連鎖型視網膜劈裂癥)、MYO7A基因突變引起的Usher綜合征1B型、ND4基因突變引起的Leber遺傳性視神經病變[
應用腺相關病毒(AAV)介導的基因療法治療無脈絡膜癥也獲得較好的長期療效，證明應用AAV介導的基因替代療法治療由較小基因突變造成的隱性視網膜遺傳病，特別是原發病灶在RPE細胞的遺傳病具有較好效果[13, 14]。這個試驗的成功對于漸進式失明類疾病的治療更具有里程碑的意義。中國學者近期也開展了針對線粒體遺傳疾病Leber遺傳性視神經病變的臨床研究并發現治療眼部分視功能得以恢復。表明基因治療對于亞洲人群也具有較好的應用前景[15]。此外，CNGB3突變引起的全色盲1型和(或) CNGA3突變引起的全色盲2型基因替代療法、滲出型老年性黃斑變性抗新生血管基因療法、異種成視力基因轉入晚期RP患者神經節細胞和(或)雙極細胞的光遺傳基因療法等正在開展相關臨床試驗。上述研究大部分應用的是AAV載體并取得了較好的結果。AAV介導的基因替代療法治療由較小基因突變造成的隱性視網膜遺傳病，特別是原發病灶在RPE細胞的遺傳病，很可能成為將來基因替代療法的首選治療方案。
基因治療在疾病早期效果較好，然而Cideciyan等[16]對中晚期LCA2患者視網膜下腔注射治療3年后臨床隨訪時發現，雖然治療處視功能明顯改善，但隨時間延長，視細胞凋亡還在緩慢進行，恢復的視功能也有逐漸下降趨勢。有學者認為，治療孤島區視細胞繼續死亡除了可能與視網膜下腔注射引起的視網膜脫離以及較小治療孤島(占全部視網膜的20%左右)區周圍變性和(或)死亡細胞釋放有害物質滲透有關外，主要與治療區視細胞在治療前已開始不可逆性凋亡過程相關[12]。解決方法有兩種：一是開發通過玻璃體腔注射就能轉染全部或包括黃斑部的大部分視網膜的新型高效AAV載體及相關技術，使全部或大部分視網膜病變細胞同時得到治療，阻止未治療區對治療區的侵蝕，同時解除因視網膜脫離而造成的副損傷，這對各期患者都有意義，特別是對黃斑部和(或)視錐細胞疾病患者以及早期未發病患者能否能得到徹底治愈具有重要意義；另一種是基因替代療法聯合應用抗細胞凋亡療法阻止或延緩治療區的細胞死亡，這可在恢復殘存視細胞功能同時，盡量延緩這些細胞存活時間，進而使治療眼獲得的視力得到盡可能長時間的保存。這對中晚期患者更重要。
2 遺傳性視網膜疾病基因編輯治療
由于AAV只有4.7千堿基對(kb)，僅能滿足現有293種致病基因中不到一半的致病基因裝載要求，對于較大致病基因目前只能應用容量較大的慢病毒載體或腺病毒(Ad)載體。但Ad載體表達時間有限，不適合需要終生表達的遺傳病；慢病毒載體除安全性外，還存在轉染率低的問題，特別是對于成熟的視細胞轉染效率更差。所以，現在進行的兩個Stargardt病(ABCA4基因突變)和Usher綜合征1B型(MYO7A基因突變)慢病毒載體相關臨床試驗都是和RPE病變有關，而且療效報道也不如LCA2和無脈絡膜癥等應用AAV載體的臨床試驗出現得快。
但是，對于顯性遺傳病，僅轉入正常基因尚不夠；還需要首先將能產生毒性產物的突變基因糾正或用正常基因替代。近年來研究者正在嘗試通過基因編輯技術克服上述瓶頸。這也是未來發展的一個重要方向[17, 18]。基因編輯技術是對基因組進行切割編輯，并利用基因組自身的修復功能，最終實現對突變致病基因進行改造的一種有效方法[17]。目前，已經發展了鋅指核酸內切酶(ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)以及近兩年剛出現就引起研究者極大興趣的規律成簇的間隔短回文重復序列/Cas內切酶9(CRISPR/Cas9)等多項基因編輯技術[19]。與ZFN和TALEN以蛋白質介導的DNA識別方式不同，CRISPR/Cas9用核苷酸介導的堿基配對方法識別DNA，極大提高了識別效率，同時降低了脫靶幾率。和其他基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9還有設計簡單且可以實現多靶點操作等優點。
針對遺傳性視網膜疾病治療途徑，目前有離體基因編輯和在體基因編輯兩大方向。離體基因編輯主要研究思路為在體外將自體皮膚來源的細胞去分化轉變為誘導多能干細胞(iPSCs)后，利用基因編輯技術糾正突變的致病基因，再將iPSCs誘導為RPE或光感受器細胞，最終再移植回患者眼中[20]。近期有學者將其使用在性連鎖遺傳性RP (RPGR基因突變)患者中誘導出的iPSCs，利用CRISPR-Cas9技術首次在iPSCs中成功修復了導致光感受器退行性改變的致病基因[21]。在體基因編輯技術可避免上述繁瑣誘導分化過程。有學者利用Cas9 mRNA和靶向sgRNA聯合注射方法，成功修復了攜帶致病基因的小鼠受精卵細胞[22]。結果表明該方法可糾正突變基因，且編輯后的基因可穩定遺傳。由于基因編輯技術存在不穩定性以及倫理問題，目前仍主要是用于開展基因診斷和產前咨詢階段，針對人類生殖細胞基因編輯相關研究短期內尚不具有進入臨床的現實可行性[23]。
雖然目前的以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯修復系統在理論上可以糾正大部分遺傳病的病因，在治療具有較大致病基因的隱性視網膜遺傳病方面也有其獨到的作用。但對大多數顯性遺傳造成的視網膜疾病，要想獲得長久的療效，需要盡可能多地修復全視網膜病變細胞的基因突變，避免周圍未治療區釋放的毒性產物侵蝕治療區視網膜組織。這不但需要高效的基因編輯系統，還要有相應的高效載體和合適的給藥方法配合。這些都需要在將來的基礎研究以及臨床試驗中進一步完善并進行驗證。
3 遺傳性視網膜疾病基因治療的未來發展
基因治療的安全性和有效性已經得到越來越多的臨床試驗證實，未來基因治療會有廣闊的市場前景。目前基因編輯的先鋒公司Editas已宣布了利用基因編輯技術在2017年開始進行LCA10型(CEP290基因突變)和Usher綜合征2A亞型(USH2A基因突變)這兩個具有較大致病基因的隱性視網膜遺傳病基因治療臨床試驗的計劃。若新興的CRISPR/cas9基因編輯修復系統通過臨床試驗證明確實如預測那樣簡單安全有效，那么具有較大突變基因和顯性遺傳這兩個目前視網膜遺傳病基因治療中的難點都將可能通過AAV介導的基因治療得到很大程度的解決。這也是基因治療在這兩年進入商業化快速軌道的基礎。
未來中國基因治療領域的發展首先應盡快普及基因檢測，確認中國視網膜遺傳病患者的發病情況。先治療隱性遺傳病，后治顯性遺傳病；先治療能用AAV載體的疾病，后治療需要應用其他載體的疾病；先治療小基因突變，后治療大基因突變疾病。同時考慮病變部位，是單純功能性和(或)靜止性病變或者有視細胞器質性和(或)進展性病變，并根據動物實驗結果做綜合判斷。最后還要根據患者視細胞存活狀況和病變發展程度，確定適用傳統的基因替代療法或異種成視力基因導入的光遺傳療法。由簡入繁，先易后難，應用相對成熟技術，選擇已確認安全有效的方法開始對特定研究較深入的疾病進行基因治療，爭取有一個好的開端，不走彎路，逐漸深入。對患者較多的病種，采用新藥開發的商業模式；對患者較少的罕見突變病種，也可以采取科學研究的方式通過臨床試驗解決。通過各方共同努力，相信基因治療很快將造福于中國遺傳性視網膜疾病患者。
基因診斷與疾病動物模型制作兩方面的技術進步和成本降低，使越來越多的致病基因被發現，其功能被確認。這為疾病基因治療奠定了基礎并且促進了基因治療研究的進展。視網膜具有解剖層次清晰且相對封閉、視網膜下腔具有免疫豁免、載體應用量較少且易于到達病變區域、操作者在直視狀態下可以準確注射和觀察治療變化、療效容易判斷等優勢，使得遺傳性視網膜疾病成為基因治療研究關注研究最多的疾病。上世紀90年代開始興起的基因治療研究，本世紀初終于首先在眼科遺傳性視網膜疾病領域獲得突破[1, 2]。將相關正常基因在不可逆性病理改變出現前轉入由于基因隱性突變造成的具有功能性蛋白缺失的相應細胞，不但可以迅速恢復視功能和(或)視行為，還可以阻止相應視網膜變性的發生，達到治愈目的[1]。從2007年開始第一個視網膜色素上皮(RPE)65基因突變引起的Leber先天性黑矇(LCA)2型(LCA2)臨床床試驗以來，基因治療在遺傳性視網膜疾病中的應用取得了令人矚目的進展。視網膜疾病特別是遺傳性視網膜疾病基因治療已成為基因治療領域的熱點并展現出廣闊的應用前景。
1 遺傳性視網膜疾病基因替代治療
截止2016年10月，已有293種遺傳性視網膜疾病的致病基因被發現，256種基因已經完成功能鑒定(https://sph.uth.edu/retnet/)。針對這些基因，目前已開展多項基因治療臨床試驗。其中較為有影響的包括RPE65基因突變引起的LCA2、MERTK基因突變引起的視網膜色素變性(RP)、REP1基因突變引起的無脈絡膜癥、ABCA4基因突變引起的Stargardt病、視網膜劈裂1(RS1)基因突變引起的青少年型視網膜劈裂癥(性連鎖型視網膜劈裂癥)、MYO7A基因突變引起的Usher綜合征1B型、ND4基因突變引起的Leber遺傳性視神經病變[
應用腺相關病毒(AAV)介導的基因療法治療無脈絡膜癥也獲得較好的長期療效，證明應用AAV介導的基因替代療法治療由較小基因突變造成的隱性視網膜遺傳病，特別是原發病灶在RPE細胞的遺傳病具有較好效果[13, 14]。這個試驗的成功對于漸進式失明類疾病的治療更具有里程碑的意義。中國學者近期也開展了針對線粒體遺傳疾病Leber遺傳性視神經病變的臨床研究并發現治療眼部分視功能得以恢復。表明基因治療對于亞洲人群也具有較好的應用前景[15]。此外，CNGB3突變引起的全色盲1型和(或) CNGA3突變引起的全色盲2型基因替代療法、滲出型老年性黃斑變性抗新生血管基因療法、異種成視力基因轉入晚期RP患者神經節細胞和(或)雙極細胞的光遺傳基因療法等正在開展相關臨床試驗。上述研究大部分應用的是AAV載體并取得了較好的結果。AAV介導的基因替代療法治療由較小基因突變造成的隱性視網膜遺傳病，特別是原發病灶在RPE細胞的遺傳病，很可能成為將來基因替代療法的首選治療方案。
基因治療在疾病早期效果較好，然而Cideciyan等[16]對中晚期LCA2患者視網膜下腔注射治療3年后臨床隨訪時發現，雖然治療處視功能明顯改善，但隨時間延長，視細胞凋亡還在緩慢進行，恢復的視功能也有逐漸下降趨勢。有學者認為，治療孤島區視細胞繼續死亡除了可能與視網膜下腔注射引起的視網膜脫離以及較小治療孤島(占全部視網膜的20%左右)區周圍變性和(或)死亡細胞釋放有害物質滲透有關外，主要與治療區視細胞在治療前已開始不可逆性凋亡過程相關[12]。解決方法有兩種：一是開發通過玻璃體腔注射就能轉染全部或包括黃斑部的大部分視網膜的新型高效AAV載體及相關技術，使全部或大部分視網膜病變細胞同時得到治療，阻止未治療區對治療區的侵蝕，同時解除因視網膜脫離而造成的副損傷，這對各期患者都有意義，特別是對黃斑部和(或)視錐細胞疾病患者以及早期未發病患者能否能得到徹底治愈具有重要意義；另一種是基因替代療法聯合應用抗細胞凋亡療法阻止或延緩治療區的細胞死亡，這可在恢復殘存視細胞功能同時，盡量延緩這些細胞存活時間，進而使治療眼獲得的視力得到盡可能長時間的保存。這對中晚期患者更重要。
2 遺傳性視網膜疾病基因編輯治療
由于AAV只有4.7千堿基對(kb)，僅能滿足現有293種致病基因中不到一半的致病基因裝載要求，對于較大致病基因目前只能應用容量較大的慢病毒載體或腺病毒(Ad)載體。但Ad載體表達時間有限，不適合需要終生表達的遺傳病；慢病毒載體除安全性外，還存在轉染率低的問題，特別是對于成熟的視細胞轉染效率更差。所以，現在進行的兩個Stargardt病(ABCA4基因突變)和Usher綜合征1B型(MYO7A基因突變)慢病毒載體相關臨床試驗都是和RPE病變有關，而且療效報道也不如LCA2和無脈絡膜癥等應用AAV載體的臨床試驗出現得快。
但是，對于顯性遺傳病，僅轉入正常基因尚不夠；還需要首先將能產生毒性產物的突變基因糾正或用正常基因替代。近年來研究者正在嘗試通過基因編輯技術克服上述瓶頸。這也是未來發展的一個重要方向[17, 18]。基因編輯技術是對基因組進行切割編輯，并利用基因組自身的修復功能，最終實現對突變致病基因進行改造的一種有效方法[17]。目前，已經發展了鋅指核酸內切酶(ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)以及近兩年剛出現就引起研究者極大興趣的規律成簇的間隔短回文重復序列/Cas內切酶9(CRISPR/Cas9)等多項基因編輯技術[19]。與ZFN和TALEN以蛋白質介導的DNA識別方式不同，CRISPR/Cas9用核苷酸介導的堿基配對方法識別DNA，極大提高了識別效率，同時降低了脫靶幾率。和其他基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9還有設計簡單且可以實現多靶點操作等優點。
針對遺傳性視網膜疾病治療途徑，目前有離體基因編輯和在體基因編輯兩大方向。離體基因編輯主要研究思路為在體外將自體皮膚來源的細胞去分化轉變為誘導多能干細胞(iPSCs)后，利用基因編輯技術糾正突變的致病基因，再將iPSCs誘導為RPE或光感受器細胞，最終再移植回患者眼中[20]。近期有學者將其使用在性連鎖遺傳性RP (RPGR基因突變)患者中誘導出的iPSCs，利用CRISPR-Cas9技術首次在iPSCs中成功修復了導致光感受器退行性改變的致病基因[21]。在體基因編輯技術可避免上述繁瑣誘導分化過程。有學者利用Cas9 mRNA和靶向sgRNA聯合注射方法，成功修復了攜帶致病基因的小鼠受精卵細胞[22]。結果表明該方法可糾正突變基因，且編輯后的基因可穩定遺傳。由于基因編輯技術存在不穩定性以及倫理問題，目前仍主要是用于開展基因診斷和產前咨詢階段，針對人類生殖細胞基因編輯相關研究短期內尚不具有進入臨床的現實可行性[23]。
雖然目前的以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯修復系統在理論上可以糾正大部分遺傳病的病因，在治療具有較大致病基因的隱性視網膜遺傳病方面也有其獨到的作用。但對大多數顯性遺傳造成的視網膜疾病，要想獲得長久的療效，需要盡可能多地修復全視網膜病變細胞的基因突變，避免周圍未治療區釋放的毒性產物侵蝕治療區視網膜組織。這不但需要高效的基因編輯系統，還要有相應的高效載體和合適的給藥方法配合。這些都需要在將來的基礎研究以及臨床試驗中進一步完善并進行驗證。
3 遺傳性視網膜疾病基因治療的未來發展
基因治療的安全性和有效性已經得到越來越多的臨床試驗證實，未來基因治療會有廣闊的市場前景。目前基因編輯的先鋒公司Editas已宣布了利用基因編輯技術在2017年開始進行LCA10型(CEP290基因突變)和Usher綜合征2A亞型(USH2A基因突變)這兩個具有較大致病基因的隱性視網膜遺傳病基因治療臨床試驗的計劃。若新興的CRISPR/cas9基因編輯修復系統通過臨床試驗證明確實如預測那樣簡單安全有效，那么具有較大突變基因和顯性遺傳這兩個目前視網膜遺傳病基因治療中的難點都將可能通過AAV介導的基因治療得到很大程度的解決。這也是基因治療在這兩年進入商業化快速軌道的基礎。
未來中國基因治療領域的發展首先應盡快普及基因檢測，確認中國視網膜遺傳病患者的發病情況。先治療隱性遺傳病，后治顯性遺傳病；先治療能用AAV載體的疾病，后治療需要應用其他載體的疾病；先治療小基因突變，后治療大基因突變疾病。同時考慮病變部位，是單純功能性和(或)靜止性病變或者有視細胞器質性和(或)進展性病變，并根據動物實驗結果做綜合判斷。最后還要根據患者視細胞存活狀況和病變發展程度，確定適用傳統的基因替代療法或異種成視力基因導入的光遺傳療法。由簡入繁，先易后難，應用相對成熟技術，選擇已確認安全有效的方法開始對特定研究較深入的疾病進行基因治療，爭取有一個好的開端，不走彎路，逐漸深入。對患者較多的病種，采用新藥開發的商業模式；對患者較少的罕見突變病種，也可以采取科學研究的方式通過臨床試驗解決。通過各方共同努力，相信基因治療很快將造福于中國遺傳性視網膜疾病患者。