引用本文： 賈茜鈺, 劉勤, 張書, 白惠玲, 董文. 黃芪注射液對模擬高原缺氧環境大鼠視網膜缺氧誘導因子-1α、p53表達的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(4): 423-427. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.04.018 復制
視網膜組織對缺氧極其敏感，高海拔缺氧可導致高原視網膜疾病[1, 2]。缺氧誘導因子(HIF)-1α是缺氧條件下廣泛存在的核轉錄因子[3]，可調控血管內皮生長因子(VEGF)、p53基因等靶基因的表達，其中p53基因與視網膜新生血管形成和細胞凋亡有關[4, 5]。相關研究發現黃芪具有清除機體氧自由基代謝產物、防止生物膜的脂質過氧化，對缺氧誘導的細胞具有良好的抑制作用[6, 7]。但黃芪對高海拔缺氧環境下視網膜損傷的干預作用報道尚少。為此，我們通過建立模擬高海拔缺氧大鼠模型，觀察探討黃芪注射液對模擬高海拔缺氧大鼠視網膜損傷的干預作用及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
成年健康Sprague Dawley大鼠60只，雌雄各半，鼠齡10周，體重(220±20) g。蘭州大學醫學院實驗動物中心提供。按隨機數字表將大鼠分為黃芪注射液干預組(干預組)和生理鹽水對照組(對照組)，每組各30只。
大鼠置于模擬海拔高度5000 m、氧分壓11.3 kPa的高原環境模擬實驗艙。模擬實驗艙艙內容積660 L，壓力0.00～0.06 MPa，可調節對應海拔高度1～ 10 000 m，溫度20～35℃，濕度25%～45%[8]。 艙內海拔實際高度為實驗室室內海拔高度與調控海拔之和。
干預組大鼠進入高原環境模擬實驗艙前30 min腹腔注射15 ml/kg劑量的黃芪注射液(國藥準字Z13020999，神威藥業集團有限公司)；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。注射后30 min，兩組隨機選取6只大鼠分別于不同時間飼養于高原環境模擬實驗艙2、6、8、12、24 h，每一時間點均為6只。
根據不同進艙時間分別于大鼠出艙后過量麻醉處死，摘除眼球，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24 h。常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作與視神經矢狀軸平行的3 μm厚度的連續切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察大鼠在艙時間2、6、8、12、24 h的視網膜病理形態改變。
免疫組織化學染色法檢測大鼠在艙時間2、6、12、24 h視網膜組織中HIF-1α、p53表達變化。3 μm厚度切片常規脫蠟至水，加入3% H2O2，95℃，10 min，一抗為兔抗鼠HIF-1α(1 ∶300)(美國Immnunoway公司)、小鼠抗大鼠VEGF單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；以0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。4℃過夜，PBS緩沖液沖洗，滴加生物素標記二抗；37℃，30 min，PBS沖洗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃，30 min；PBS沖洗，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒 (北京博奧森生物技術有限公司)顯色。應用Image-Pro Plus圖像分析系統分析視網膜中HIF-1α、p53 mRNA表達情況。以顯微鏡下觀察到細胞核、細胞質或細胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。微弱黃色為弱陽性表達，明顯黃色為陽性表達，棕黃色為中等強度陽性表達，棕黑色為強陽性表達。無黃色或棕黃色顆粒為陰性表達。隨機選取各組10張切片，每張切片高倍鏡下選取7個視網膜視野范圍內棕黃色反應區域，計算陽性細胞的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。
采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。所有數據以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，對照組大鼠在艙2 h時視網膜各層組織疏松水腫(圖 1A)； 6 h時視網膜神經節細胞(RGC)和內叢狀層(IPL)細胞空泡樣變，視網膜厚度增加，間質疏松(圖 1B)； 8 h時視網膜各層水腫增加 (圖 1C)； 12 h時RGC層及內核層(INL)水腫更為明顯，RGC腫脹變性(圖 1D)； 24 h時RGC出現核固縮，INL細胞排列疏松紊亂(圖 1E)。 干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織病理改變與對照組相似，但視網膜腫脹程度較對照組減輕，RCG腫脹程度更輕(圖 2)。
圖1
圖 1 對照組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。1A.2 h,視網膜疏松水腫(黑箭) HE× 400；1B.6 h,RGC層和IPL細胞空泡樣改變(黑箭)，視網膜厚度增加，間質疏松(黑箭) HE×400；1C.8 h,視網膜各層水腫明顯HE×400；1D.12 h,RGC層及INL水腫更為明顯，神經節細胞腫脹變性(黑箭) HE×400；1E.24 h,RGC出現核固縮，INL細胞排列疏松紊亂(黑箭) HE×400??圖 2 干預組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。2A～2E.分別為在艙時間2、6、8、12、24 h。大鼠視網膜組織形態改變較對照組各對應時間點視網膜病理改變相對減輕(黑箭) HE×400
HIF-1α陽性表達主要出現在視網膜各層細胞漿。對照組大鼠在艙2 h時視網膜組織中可見極少量HIF-1α陽性表達點，主要分布于RGC層(圖 3A)；6 h時RCG層和IPL均出現HIF-1α陽性表達(圖 3B)；8 h時HIF-1α陽性表達較6 h明顯；12 h時RCG層HIF-1α陽性表達增強，IPL可見細胞膜及細胞漿陽性染色，RGC核固縮，內核層細胞排列疏松紊亂(圖 3C)； 24 h時HIF-1α表達增強，主要分布于視網膜內層(圖 3D)。與對照組大鼠比較，干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織中HIF-1α陽性表達較對照組減少(圖 4)。
圖3
圖 3 對照組大鼠視網膜組織HIF-1α表達 光學顯微鏡像。3A.2 h,視網膜組織中可見弱陽性表達(黑箭) DAB×400；3B.6 h,RCG層和IPL均出現陽性表達(黑箭) DAB×400；3C.12 h,RCG層和IPL中等強度陽性表達(黑箭) DAB×400；3D.24 h,強陽性表達，主要分布于視網膜內層(黑箭) DAB×400??圖 4 干預組大鼠視網膜組織HIF-1α表達光學顯微鏡像。4A～4D.分別為在艙時間2、6、12、24 h。 各相應在艙時間點視網膜組織中HIF-1α表達陽性趨勢與對照組大鼠相似 DAB×400 ??圖 5 對照組大鼠視網膜組織p53表達光學顯微鏡像。5A.2 h,視網膜組織中可見微弱陽性(黑箭) DAB×400；5B.6 h,可見明顯陽性表達(黑箭) DAB×400；5C.12 h,可見中等強度陽性表達(黑箭) DAB×400；5D.24 h,強陽性表達(黑箭) DAB×400??圖 6 干預組大鼠視網膜組織p53表達光學顯微鏡像。6A～6B.分別為在艙時間2、6、12、24 h。各相應在艙時間點視網膜組織中p53蛋白陽性趨勢與對照組大鼠相似DAB×400
p53陽性表達主要出現在視網膜各層細胞漿。對照組大鼠在艙2 h時視網膜組織可見p53弱陽性表達(圖 5A)；6 h時p53呈陽性表達(圖 5B)；8 h時p53呈 中等強度陽性表達；12 h時陽性表達較前加深呈棕黑色(圖 5C)；24 h時可見強陽性表達(圖 5D)。與對照組大鼠比較，干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織中p53蛋白陽性趨勢相似(圖 6)。
兩組大鼠視網膜組織中不同在艙時間HIF-1α(t=6.09、5.82、5.05、3.61、17.93)、p53(t=P3.64、9.45、10.91、2.28、4.92)陽性表達結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 7,8)。
圖7
兩組大鼠不同在艙時間視網膜組織中HIF-1α 陽性表達
圖8
兩組大鼠不同在艙時間視網膜組織中p53陽性表達
3 討論
醫學上將海拔3000 m以上區域定義為高原地區，機體可以耐受的海拔高度為3000～5000 m。本研究應用的高原環境模擬艙是一種可通過模擬艙外調控臺控制艙內運轉和條件的模擬高海拔低壓低氧環境的實驗設備，結合手動和自動控制系統控制艙內海拔高度、艙內濕度以及升降速度，模擬出不同海拔高度，對高原實驗提供便利及為實驗準確性提供保障。高原地區氧分壓低是引起高原病的主要致病因素[9]。高原缺氧嚴重可導致高原肺水腫、高原腦水腫、高原眼病等。高原眼病表現為角膜水腫，視覺、視敏感度及對比度下降，導致空間障礙、周邊視野縮小、眼肌調節功能障礙、球結膜血管擴張、翼狀胬肉、慢性結膜炎、白內障和高原視網膜疾病等。視網膜與中樞神經系統關系密切，與大腦細胞耐氧性極為相似，對缺氧極其敏感，高海拔視網膜缺氧病變發生率較高，可引起患者短暫性或永久性的視功能障礙和眼部損害[10-12]。
缺氧是多種疾病發生發展的病因或伴隨的病理過程。機體缺氧時細胞利用氧感受器，通過信號傳導調節控制相應因子引動內源性代償的保護機制。HIF-1α基因涉及細胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝及血管的發生，即介導的轉錄因子基因包括編碼p53、p21、B細胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)基因。HIF-1α對細胞生存具有重要作用，通過其傳導信號細胞才可啟動相應靶基因如p53、p21、bcl-2、VEGF等。p53蛋白在角膜、結膜、晶狀體上高表達，視網膜組織也有相應表達[5]。當細胞處于缺氧等異常環境時，p53通過翻譯后修飾被富集，并解除阻遏抑制而發揮功能[13]。缺氧是p53是最強的生理性誘導劑，同時也參與HIF-1α的調節；有相關研究表明p53與HIF-1α表達呈正相關。本研究結果發現，模擬海拔高度5000 m時，隨模擬時間延長RGC腫脹變性，細胞數量減少、凋亡、核固縮等。這種現象可能與HIF-1α和p53介導的細胞凋亡機制有關。
中藥黃芪有效成分為黃芪總黃酮、黃芪總皂甙、黃芪總多糖和膽堿等。近年研究發現，黃芪具有清除機體氧自由基代謝產物、改善記憶和保護大腦的作用；黃芪總酮和黃芪總甙可清除O2和調控NO；黃芪多糖能改善高眼壓下RGC的凋亡[14]。黃芪具有對缺氧誘導的細胞良好的抑制作用，其機制可能通過激活絲氨酸等進而誘導HIF-1α的表達實現；也有研究證實黃芪
具有抗細胞凋亡和壞死的機制，這種保護機制與黃芪激活HIF-1α下屬的靶基因VEGF密切相關。此外，黃芪可以明顯升高氧分壓，并有抗自由基損傷、穩定細胞膜、抗炎與抗免疫的作用從而對視網膜具有保護作用[15-17]。本研究結果顯示，模擬海拔高度5000 m不同時間點干預組大鼠視網膜組織中HIF-1α、p53表達與對照組表達趨勢相似，但表達均較對照組減少。說明黃芪注射液通過抑制HIF-1α、p53降解途徑，減少HIF-1α、p53的表達。但具體細胞分子途徑和作用機制有待進一步研究探討。
本研究模擬5000 m高海拔環境下黃芪注射液對大鼠視網膜HIF-1α、p53表達的影響，為中藥黃芪在抗缺氧領域的應用提供了新思路。但本研究不足是僅觀察了高海拔環境下不同時間點黃芪注射液對大鼠視網膜病理學改變及視網膜組織中HIF-1α、p53的變化，后續研究將進一步探討黃芪注射液對模擬高海拔環境下大鼠視網膜其他因子的作用情況。
視網膜組織對缺氧極其敏感，高海拔缺氧可導致高原視網膜疾病[1, 2]。缺氧誘導因子(HIF)-1α是缺氧條件下廣泛存在的核轉錄因子[3]，可調控血管內皮生長因子(VEGF)、p53基因等靶基因的表達，其中p53基因與視網膜新生血管形成和細胞凋亡有關[4, 5]。相關研究發現黃芪具有清除機體氧自由基代謝產物、防止生物膜的脂質過氧化，對缺氧誘導的細胞具有良好的抑制作用[6, 7]。但黃芪對高海拔缺氧環境下視網膜損傷的干預作用報道尚少。為此，我們通過建立模擬高海拔缺氧大鼠模型，觀察探討黃芪注射液對模擬高海拔缺氧大鼠視網膜損傷的干預作用及其機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
成年健康Sprague Dawley大鼠60只，雌雄各半，鼠齡10周，體重(220±20) g。蘭州大學醫學院實驗動物中心提供。按隨機數字表將大鼠分為黃芪注射液干預組(干預組)和生理鹽水對照組(對照組)，每組各30只。
大鼠置于模擬海拔高度5000 m、氧分壓11.3 kPa的高原環境模擬實驗艙。模擬實驗艙艙內容積660 L，壓力0.00～0.06 MPa，可調節對應海拔高度1～ 10 000 m，溫度20～35℃，濕度25%～45%[8]。 艙內海拔實際高度為實驗室室內海拔高度與調控海拔之和。
干預組大鼠進入高原環境模擬實驗艙前30 min腹腔注射15 ml/kg劑量的黃芪注射液(國藥準字Z13020999，神威藥業集團有限公司)；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。注射后30 min，兩組隨機選取6只大鼠分別于不同時間飼養于高原環境模擬實驗艙2、6、8、12、24 h，每一時間點均為6只。
根據不同進艙時間分別于大鼠出艙后過量麻醉處死，摘除眼球，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24 h。常規酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，作與視神經矢狀軸平行的3 μm厚度的連續切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察大鼠在艙時間2、6、8、12、24 h的視網膜病理形態改變。
免疫組織化學染色法檢測大鼠在艙時間2、6、12、24 h視網膜組織中HIF-1α、p53表達變化。3 μm厚度切片常規脫蠟至水，加入3% H2O2，95℃，10 min，一抗為兔抗鼠HIF-1α(1 ∶300)(美國Immnunoway公司)、小鼠抗大鼠VEGF單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；以0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。4℃過夜，PBS緩沖液沖洗，滴加生物素標記二抗；37℃，30 min，PBS沖洗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，37℃，30 min；PBS沖洗，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒 (北京博奧森生物技術有限公司)顯色。應用Image-Pro Plus圖像分析系統分析視網膜中HIF-1α、p53 mRNA表達情況。以顯微鏡下觀察到細胞核、細胞質或細胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。微弱黃色為弱陽性表達，明顯黃色為陽性表達，棕黃色為中等強度陽性表達，棕黑色為強陽性表達。無黃色或棕黃色顆粒為陰性表達。隨機選取各組10張切片，每張切片高倍鏡下選取7個視網膜視野范圍內棕黃色反應區域，計算陽性細胞的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。
采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析。所有數據以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察，對照組大鼠在艙2 h時視網膜各層組織疏松水腫(圖 1A)； 6 h時視網膜神經節細胞(RGC)和內叢狀層(IPL)細胞空泡樣變，視網膜厚度增加，間質疏松(圖 1B)； 8 h時視網膜各層水腫增加 (圖 1C)； 12 h時RGC層及內核層(INL)水腫更為明顯，RGC腫脹變性(圖 1D)； 24 h時RGC出現核固縮，INL細胞排列疏松紊亂(圖 1E)。 干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織病理改變與對照組相似，但視網膜腫脹程度較對照組減輕，RCG腫脹程度更輕(圖 2)。
圖1
圖 1 對照組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。1A.2 h,視網膜疏松水腫(黑箭) HE× 400；1B.6 h,RGC層和IPL細胞空泡樣改變(黑箭)，視網膜厚度增加，間質疏松(黑箭) HE×400；1C.8 h,視網膜各層水腫明顯HE×400；1D.12 h,RGC層及INL水腫更為明顯，神經節細胞腫脹變性(黑箭) HE×400；1E.24 h,RGC出現核固縮，INL細胞排列疏松紊亂(黑箭) HE×400??圖 2 干預組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。2A～2E.分別為在艙時間2、6、8、12、24 h。大鼠視網膜組織形態改變較對照組各對應時間點視網膜病理改變相對減輕(黑箭) HE×400
HIF-1α陽性表達主要出現在視網膜各層細胞漿。對照組大鼠在艙2 h時視網膜組織中可見極少量HIF-1α陽性表達點，主要分布于RGC層(圖 3A)；6 h時RCG層和IPL均出現HIF-1α陽性表達(圖 3B)；8 h時HIF-1α陽性表達較6 h明顯；12 h時RCG層HIF-1α陽性表達增強，IPL可見細胞膜及細胞漿陽性染色，RGC核固縮，內核層細胞排列疏松紊亂(圖 3C)； 24 h時HIF-1α表達增強，主要分布于視網膜內層(圖 3D)。與對照組大鼠比較，干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織中HIF-1α陽性表達較對照組減少(圖 4)。
圖3
圖 3 對照組大鼠視網膜組織HIF-1α表達 光學顯微鏡像。3A.2 h,視網膜組織中可見弱陽性表達(黑箭) DAB×400；3B.6 h,RCG層和IPL均出現陽性表達(黑箭) DAB×400；3C.12 h,RCG層和IPL中等強度陽性表達(黑箭) DAB×400；3D.24 h,強陽性表達，主要分布于視網膜內層(黑箭) DAB×400??圖 4 干預組大鼠視網膜組織HIF-1α表達光學顯微鏡像。4A～4D.分別為在艙時間2、6、12、24 h。 各相應在艙時間點視網膜組織中HIF-1α表達陽性趨勢與對照組大鼠相似 DAB×400 ??圖 5 對照組大鼠視網膜組織p53表達光學顯微鏡像。5A.2 h,視網膜組織中可見微弱陽性(黑箭) DAB×400；5B.6 h,可見明顯陽性表達(黑箭) DAB×400；5C.12 h,可見中等強度陽性表達(黑箭) DAB×400；5D.24 h,強陽性表達(黑箭) DAB×400??圖 6 干預組大鼠視網膜組織p53表達光學顯微鏡像。6A～6B.分別為在艙時間2、6、12、24 h。各相應在艙時間點視網膜組織中p53蛋白陽性趨勢與對照組大鼠相似DAB×400
p53陽性表達主要出現在視網膜各層細胞漿。對照組大鼠在艙2 h時視網膜組織可見p53弱陽性表達(圖 5A)；6 h時p53呈陽性表達(圖 5B)；8 h時p53呈 中等強度陽性表達；12 h時陽性表達較前加深呈棕黑色(圖 5C)；24 h時可見強陽性表達(圖 5D)。與對照組大鼠比較，干預組大鼠各相應在艙時間點視網膜組織中p53蛋白陽性趨勢相似(圖 6)。
兩組大鼠視網膜組織中不同在艙時間HIF-1α(t=6.09、5.82、5.05、3.61、17.93)、p53(t=P3.64、9.45、10.91、2.28、4.92)陽性表達結果比較，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 7,8)。
圖7
兩組大鼠不同在艙時間視網膜組織中HIF-1α 陽性表達
圖8
兩組大鼠不同在艙時間視網膜組織中p53陽性表達
3 討論
醫學上將海拔3000 m以上區域定義為高原地區，機體可以耐受的海拔高度為3000～5000 m。本研究應用的高原環境模擬艙是一種可通過模擬艙外調控臺控制艙內運轉和條件的模擬高海拔低壓低氧環境的實驗設備，結合手動和自動控制系統控制艙內海拔高度、艙內濕度以及升降速度，模擬出不同海拔高度，對高原實驗提供便利及為實驗準確性提供保障。高原地區氧分壓低是引起高原病的主要致病因素[9]。高原缺氧嚴重可導致高原肺水腫、高原腦水腫、高原眼病等。高原眼病表現為角膜水腫，視覺、視敏感度及對比度下降，導致空間障礙、周邊視野縮小、眼肌調節功能障礙、球結膜血管擴張、翼狀胬肉、慢性結膜炎、白內障和高原視網膜疾病等。視網膜與中樞神經系統關系密切，與大腦細胞耐氧性極為相似，對缺氧極其敏感，高海拔視網膜缺氧病變發生率較高，可引起患者短暫性或永久性的視功能障礙和眼部損害[10-12]。
缺氧是多種疾病發生發展的病因或伴隨的病理過程。機體缺氧時細胞利用氧感受器，通過信號傳導調節控制相應因子引動內源性代償的保護機制。HIF-1α基因涉及細胞能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝及血管的發生，即介導的轉錄因子基因包括編碼p53、p21、B細胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)基因。HIF-1α對細胞生存具有重要作用，通過其傳導信號細胞才可啟動相應靶基因如p53、p21、bcl-2、VEGF等。p53蛋白在角膜、結膜、晶狀體上高表達，視網膜組織也有相應表達[5]。當細胞處于缺氧等異常環境時，p53通過翻譯后修飾被富集，并解除阻遏抑制而發揮功能[13]。缺氧是p53是最強的生理性誘導劑，同時也參與HIF-1α的調節；有相關研究表明p53與HIF-1α表達呈正相關。本研究結果發現，模擬海拔高度5000 m時，隨模擬時間延長RGC腫脹變性，細胞數量減少、凋亡、核固縮等。這種現象可能與HIF-1α和p53介導的細胞凋亡機制有關。
中藥黃芪有效成分為黃芪總黃酮、黃芪總皂甙、黃芪總多糖和膽堿等。近年研究發現，黃芪具有清除機體氧自由基代謝產物、改善記憶和保護大腦的作用；黃芪總酮和黃芪總甙可清除O2和調控NO；黃芪多糖能改善高眼壓下RGC的凋亡[14]。黃芪具有對缺氧誘導的細胞良好的抑制作用，其機制可能通過激活絲氨酸等進而誘導HIF-1α的表達實現；也有研究證實黃芪
具有抗細胞凋亡和壞死的機制，這種保護機制與黃芪激活HIF-1α下屬的靶基因VEGF密切相關。此外，黃芪可以明顯升高氧分壓，并有抗自由基損傷、穩定細胞膜、抗炎與抗免疫的作用從而對視網膜具有保護作用[15-17]。本研究結果顯示，模擬海拔高度5000 m不同時間點干預組大鼠視網膜組織中HIF-1α、p53表達與對照組表達趨勢相似，但表達均較對照組減少。說明黃芪注射液通過抑制HIF-1α、p53降解途徑，減少HIF-1α、p53的表達。但具體細胞分子途徑和作用機制有待進一步研究探討。
本研究模擬5000 m高海拔環境下黃芪注射液對大鼠視網膜HIF-1α、p53表達的影響，為中藥黃芪在抗缺氧領域的應用提供了新思路。但本研究不足是僅觀察了高海拔環境下不同時間點黃芪注射液對大鼠視網膜病理學改變及視網膜組織中HIF-1α、p53的變化，后續研究將進一步探討黃芪注射液對模擬高海拔環境下大鼠視網膜其他因子的作用情況。
