引用本文： 姜鑒洪, 孔佳慧, 陳松, 段紅濤, 王月欣, 董蒙, 張惟, 王昀, 林錦鏞. 神經干細胞玻璃體腔移植對糖尿病大鼠視網膜功能及結構的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(4): 418-422. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.04.017 復制
糖尿病視網膜病變(DR)是一種神經血管損傷性疾病[1]，在DR早期進行干預對延緩其發展具有重要意義。間充質干細胞(MSC)移植是治療包括DR以及中樞和外周神經系統損傷的新方法[2]。MSC在體內可分化為光感受器細胞和視網膜神經節細胞，替代受損細胞，保護神經組織，減輕視網膜組織損傷，使視網膜功能得以改善[3, 4]。但目前的研究多集中于使用未分化的MSC進行移植，其體內分化效率低、歸巢能力差[5]。為此，本研究在體外將人臍帶間充質干細胞(hUCMSC)分化為神經干細胞(NSC)后注射入玻璃體腔，觀察其對糖尿病大鼠視網膜功能和組織結構的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，6周齡，體重180～210 g，清潔級，標準化飼養，中國軍事醫學科學院動物中心提供，飼養于天津醫科大學實驗動物房。建模前均行裂隙燈顯微鏡、直接檢眼鏡檢查排除影響結果的眼部疾病。隨機數字表法將大鼠分為正常對照組(A組)和糖尿病組，分別為9、31只大鼠。糖尿病組大鼠適應性飼養3 d后，按體重60 mg/kg劑量經腹腔注射2%的鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，72 h后取大鼠尾尖血檢測血糖>16.7 mmol/L為建模成 功；實驗期間每兩周檢測血糖，血糖值均>16.7 mmol/L。A組大鼠腹腔注射等容量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。
建模10周時，隨機數字表法將建模成功的27只大鼠分為糖尿病對照組(B組)、磷酸鹽緩沖液(PBS)組(C組)、NSC組(D組)，各組均為9只大鼠。C組大鼠玻璃體腔注射PBS 2 μl；D組大鼠玻璃體腔注射2 μl的2×104的NSC。A、B組大鼠不予干預。NSC經免疫熒光檢測NSC表面標記物驗證獲得[6]，注射前制成細胞懸液。右眼為實驗眼。實驗過程中，剔除玻璃體積血、血糖恢復、死亡鼠共4只，最終各組均為9只大鼠36只眼計入統計。
建模前，建模后4、10周，干預后2、4、6周各組大鼠右眼行全視野閃光視網膜電圖(F-ERG)檢查。大鼠暗適應30 min，在暗紅燈光下腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg劑量麻醉，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳。在大鼠角鞏膜緣、額部矢狀線與兩眼連線交界處以及尾尖分別放置記錄電極、參考電極和接地電極。使用德國Roland Consult公司的眼電生理系統。標準白色閃光強度0 db時為3.0 cd·s/m2，-25 db時為標準閃光強度衰減2.51og單位。暗適應條件下記錄暗適應視桿細胞反應(Rod-R)b波潛伏期和振幅以及最大混合反應(Max-R)a、b波潛伏期和振幅、OPs總振幅。建模前，A組、糖尿病組大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期及振幅以及Max-R a、b波潛伏期及振幅、OPs總振幅值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。
建模后4、10周，干預后2、4、6周光學顯微鏡下觀察視網膜形態結構的變化。大鼠腹腔注射10%水合氯醛過量麻醉處死，摘除包含約2 mm視神經的眼球，置于含4％多聚甲醛中固定。玻璃體腔注入2.5%戊二醛0.2～0.3 ml，再放入2.5%戊二醛溶液中常溫固定15 min，去除角膜、晶狀體及玻璃體。將組織標本放入10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h。將固定好的標本常規脫水、浸蠟和包埋，將眼球蠟塊平行于視軸方向切片，切片厚度4 μm。蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。
應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析處理。計量資料以均數±標準差(
2 結果
建模后4周，與A組比較，糖尿病組大鼠僅OPs總振幅下降，差異有統計學意義(t=7.61，P<0.05)；暗適應Rod-R b波潛伏期和振幅，Max-R a、b波潛伏期和振幅比較，差異均無統計學意義(t=0.72、-1.17、 0.41、-0.58、0.65、-1.76，P>0.05)。建模后10周，A組大鼠Max-R b波潛伏期及振幅、OPs總振幅與B、C、D組比較，差異均有統計學意義(t=4.24、7.05、9.94,P<0.05)；暗適應Rod-R b波潛伏期和振幅Max-R a波潛伏期和振幅比較，差異均無統計學意義(t=1.03、-0.45、0.16、-0.39，P>0.05)。B、C、D組間F-ERG各波比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。
干預后2周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期比較，差異無統計學意義(F=2.057，P>0.05)；暗適應Rod-R b波振幅(F=6.173)、Max-R b波潛伏期及振幅(F=4.105、30.590)、OPs總振幅(F=51.290)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加，D組大鼠Max-R b波潛伏期較B、C組下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 1)。
圖1
圖 1 干預后2周各組大鼠F-ERG變化。1A.各波不同反應潛伏期變化；1B.各波不同反應振幅變化。??圖 2 干預后4周各組大鼠F-ERG變化。2A.各波不同反應潛伏期變化；2B.各波不同反應振幅變化??圖 3 干預后6周各組大鼠F-ERG變化。3A.各波不同反應潛伏期變化；3B.各波不同反應振幅變化
干預后4周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期及振幅(F=8.174、4.455)以及Max-R a、b波潛伏期(F=5.010、9.237)及振幅(F=13.153、33.830)、OPs總振幅(F=79.820)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠暗適應Rod-R b波振幅以及Max-R a、b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加；暗適應Rod-R b波潛伏期以及Max-R a、b波潛伏期較B、C組下降(圖 2)，差異均有統計學意義(P<0.05)。
干預后6周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波振幅及潛伏期(F=30.031、7.119)、Max-R a、b波潛伏期(F=8.562、17.688)及振幅(F=7.548、34.375)、OPs總振幅(F=135.450)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠暗適應Rod-R b波振幅以及Max-R a、b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加，D組大鼠暗適應Rod-R及Max-R b波潛伏期較B、C組下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 3)。
與A組比較，建模后4周，糖尿病組大鼠視網膜各層組織結構未見明顯差異；10周時，視網膜各層細胞排列紊亂。干預后2周，A組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，內界膜(ILM)完整清晰；B、C、D組大鼠視網膜各層細胞排列紊亂，ILM連續性破壞并出現局部增厚。干預后4周，B、C組大鼠視網膜各層細胞排列較2周時更加紊亂，且細胞數量減少,ILM連續性進一步破壞、局部增厚范圍加大，可見視網膜血管內皮細胞增生；D組大鼠視網膜各層細胞排列紊亂，視網膜神經節細胞(RGC)數量較B、C組增多，血管擴張不明顯。干預后6周，B、C組大鼠RGC數量較D組減少，細胞核深染，神經纖維層(NFL)變薄且水腫明顯，內核層(INL)變薄、結構紊亂，外核層(ONL)排列紊亂，ILM完整性破壞更嚴重(圖 4～7)。
圖4
圖 4 A組大鼠視網膜組織病理像。視網膜各層細胞排列整齊，ILM完整清晰HE×40?0?圖 5 B組大鼠視網膜組織病理像。建模后10周，ILM完整性破壞，NFL變薄，RGC數量減少，細胞邊界欠清；INL和ONL細胞邊界欠清，INL細胞稀疏，密度減少，ONL內側細胞密集，外側部分細胞相對密度減少HE×400?0?圖 6 B組大鼠視網膜組織病理像。6A～6C.干預后2、4、6周。隨干預時間延長視網膜各層細胞數量逐漸減少，ILM完整性逐漸破壞，NFL水腫逐漸加重HE×400?0?圖 7 D組大鼠視網膜組織病理像。7A～7C.干預后2、4、6周。隨干預時間延長各層細胞數逐漸增加，ILM完整性改善，NFL水腫減輕。INL、ONL逐漸增厚HE×400
3 討論
大量研究結果提示，DR神經元功能的失調明顯早于微脈管系統的病變[7, 8]，與糖尿病早期患者F-ERG檢查結果異常、暗適應下降、微視野差異相吻合[9, 10]。因此，研究DR的神經損傷與保護，對預防和逆轉早期DR中的神經病變有重要意義。神經細胞的凋亡在糖尿病誘發后1個月即能檢測到[11]。神經元的損傷表現為視網膜功能的失調。F-ERG可反應視網膜不同層次的功能狀態，是一種從視網膜細胞水平評價視覺功能的客觀檢查方法，對觀察DR病變的進程并預測發生增生性視網膜病變的危險具有十分重要的意義[12]。本研究結果顯示，建模后4周大鼠F-ERG的OPs已發生顯著性下降。說明內層視網膜功能受損，與文獻報道結果一致[9, 10]，而組織病理切片染色未發現明顯異常，提示DR早期視網膜可能已經發生了光學顯微鏡檢查未能發現的細微改變。
MSC是細胞注射治療視網膜變性類疾病的理想種子細胞。為了解決hUCMSC體內分化率低、歸巢能力差的問題，本研究中，我們在體外將hUCMSC分化為NSC，并經免疫熒光檢測特異性表面標記物驗證[6]，再通過局部注射移植入玻璃體腔。結果發現，NSC對糖尿病大鼠視網膜功能及結構均有改善作用。干預后2周，注射NSC組大鼠視網膜F-ERG已發生改善，暗適應Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs總振幅較對照組提高，并隨著干預時間的延長，F-ERG各項指標均逐漸進一步好轉。而干預后直到第4周，D組大鼠視網膜損傷較同時間點B組大鼠明顯減輕，RGC數量相對較多，RGC細胞空泡化，染色質邊緣聚集現象較糖尿病大鼠較少，排列也較規整，NFL、INL、及ONL較厚，細胞排列也相對整齊。說明hUCMSC誘導的NSC對視網膜功能的改善作用早于其對結構的改善。另外，NSC可發揮神經營養及替代作用。本研究結果發現，D組大鼠OPs及b波較a波明顯改善。Kowluru等[13]對糖尿病大鼠給予營養補充劑類胡蘿卜素，也發現不但可以阻止糖尿病血管異常的發生，而且可以通過改善F-ERG a、b波振幅從而改善視網膜功能。
玻璃體腔注射hUCMSC體外誘導的NSC對糖尿病大鼠視網膜功能及結構均有改善作用。可能原因為NSC可以替換受損細胞，也可以通過分泌多種神經保護因子增強對糖尿病大鼠視網膜的神經保護作用。但NSC移植后在眼內的定位及分化均有待在今后的研究中進一步探討。
糖尿病視網膜病變(DR)是一種神經血管損傷性疾病[1]，在DR早期進行干預對延緩其發展具有重要意義。間充質干細胞(MSC)移植是治療包括DR以及中樞和外周神經系統損傷的新方法[2]。MSC在體內可分化為光感受器細胞和視網膜神經節細胞，替代受損細胞，保護神經組織，減輕視網膜組織損傷，使視網膜功能得以改善[3, 4]。但目前的研究多集中于使用未分化的MSC進行移植，其體內分化效率低、歸巢能力差[5]。為此，本研究在體外將人臍帶間充質干細胞(hUCMSC)分化為神經干細胞(NSC)后注射入玻璃體腔，觀察其對糖尿病大鼠視網膜功能和組織結構的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只，6周齡，體重180～210 g，清潔級，標準化飼養，中國軍事醫學科學院動物中心提供，飼養于天津醫科大學實驗動物房。建模前均行裂隙燈顯微鏡、直接檢眼鏡檢查排除影響結果的眼部疾病。隨機數字表法將大鼠分為正常對照組(A組)和糖尿病組，分別為9、31只大鼠。糖尿病組大鼠適應性飼養3 d后，按體重60 mg/kg劑量經腹腔注射2%的鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，72 h后取大鼠尾尖血檢測血糖>16.7 mmol/L為建模成 功；實驗期間每兩周檢測血糖，血糖值均>16.7 mmol/L。A組大鼠腹腔注射等容量0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液。
建模10周時，隨機數字表法將建模成功的27只大鼠分為糖尿病對照組(B組)、磷酸鹽緩沖液(PBS)組(C組)、NSC組(D組)，各組均為9只大鼠。C組大鼠玻璃體腔注射PBS 2 μl；D組大鼠玻璃體腔注射2 μl的2×104的NSC。A、B組大鼠不予干預。NSC經免疫熒光檢測NSC表面標記物驗證獲得[6]，注射前制成細胞懸液。右眼為實驗眼。實驗過程中，剔除玻璃體積血、血糖恢復、死亡鼠共4只，最終各組均為9只大鼠36只眼計入統計。
建模前，建模后4、10周，干預后2、4、6周各組大鼠右眼行全視野閃光視網膜電圖(F-ERG)檢查。大鼠暗適應30 min，在暗紅燈光下腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg劑量麻醉，復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳。在大鼠角鞏膜緣、額部矢狀線與兩眼連線交界處以及尾尖分別放置記錄電極、參考電極和接地電極。使用德國Roland Consult公司的眼電生理系統。標準白色閃光強度0 db時為3.0 cd·s/m2，-25 db時為標準閃光強度衰減2.51og單位。暗適應條件下記錄暗適應視桿細胞反應(Rod-R)b波潛伏期和振幅以及最大混合反應(Max-R)a、b波潛伏期和振幅、OPs總振幅。建模前，A組、糖尿病組大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期及振幅以及Max-R a、b波潛伏期及振幅、OPs總振幅值比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。
建模后4、10周，干預后2、4、6周光學顯微鏡下觀察視網膜形態結構的變化。大鼠腹腔注射10%水合氯醛過量麻醉處死，摘除包含約2 mm視神經的眼球，置于含4％多聚甲醛中固定。玻璃體腔注入2.5%戊二醛0.2～0.3 ml，再放入2.5%戊二醛溶液中常溫固定15 min，去除角膜、晶狀體及玻璃體。將組織標本放入10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h。將固定好的標本常規脫水、浸蠟和包埋，將眼球蠟塊平行于視軸方向切片，切片厚度4 μm。蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。
應用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析處理。計量資料以均數±標準差(
2 結果
建模后4周，與A組比較，糖尿病組大鼠僅OPs總振幅下降，差異有統計學意義(t=7.61，P<0.05)；暗適應Rod-R b波潛伏期和振幅，Max-R a、b波潛伏期和振幅比較，差異均無統計學意義(t=0.72、-1.17、 0.41、-0.58、0.65、-1.76，P>0.05)。建模后10周，A組大鼠Max-R b波潛伏期及振幅、OPs總振幅與B、C、D組比較，差異均有統計學意義(t=4.24、7.05、9.94,P<0.05)；暗適應Rod-R b波潛伏期和振幅Max-R a波潛伏期和振幅比較，差異均無統計學意義(t=1.03、-0.45、0.16、-0.39，P>0.05)。B、C、D組間F-ERG各波比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。
干預后2周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期比較，差異無統計學意義(F=2.057，P>0.05)；暗適應Rod-R b波振幅(F=6.173)、Max-R b波潛伏期及振幅(F=4.105、30.590)、OPs總振幅(F=51.290)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加，D組大鼠Max-R b波潛伏期較B、C組下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 1)。
圖1
圖 1 干預后2周各組大鼠F-ERG變化。1A.各波不同反應潛伏期變化；1B.各波不同反應振幅變化。??圖 2 干預后4周各組大鼠F-ERG變化。2A.各波不同反應潛伏期變化；2B.各波不同反應振幅變化??圖 3 干預后6周各組大鼠F-ERG變化。3A.各波不同反應潛伏期變化；3B.各波不同反應振幅變化
干預后4周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波潛伏期及振幅(F=8.174、4.455)以及Max-R a、b波潛伏期(F=5.010、9.237)及振幅(F=13.153、33.830)、OPs總振幅(F=79.820)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠暗適應Rod-R b波振幅以及Max-R a、b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加；暗適應Rod-R b波潛伏期以及Max-R a、b波潛伏期較B、C組下降(圖 2)，差異均有統計學意義(P<0.05)。
干預后6周，A、B、C、D組間大鼠暗適應Rod-R b波振幅及潛伏期(F=30.031、7.119)、Max-R a、b波潛伏期(F=8.562、17.688)及振幅(F=7.548、34.375)、OPs總振幅(F=135.450)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較，D組大鼠暗適應Rod-R b波振幅以及Max-R a、b波振幅、OPs總振幅較B、C組增加，D組大鼠暗適應Rod-R及Max-R b波潛伏期較B、C組下降，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖 3)。
與A組比較，建模后4周，糖尿病組大鼠視網膜各層組織結構未見明顯差異；10周時，視網膜各層細胞排列紊亂。干預后2周，A組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，內界膜(ILM)完整清晰；B、C、D組大鼠視網膜各層細胞排列紊亂，ILM連續性破壞并出現局部增厚。干預后4周，B、C組大鼠視網膜各層細胞排列較2周時更加紊亂，且細胞數量減少,ILM連續性進一步破壞、局部增厚范圍加大，可見視網膜血管內皮細胞增生；D組大鼠視網膜各層細胞排列紊亂，視網膜神經節細胞(RGC)數量較B、C組增多，血管擴張不明顯。干預后6周，B、C組大鼠RGC數量較D組減少，細胞核深染，神經纖維層(NFL)變薄且水腫明顯，內核層(INL)變薄、結構紊亂，外核層(ONL)排列紊亂，ILM完整性破壞更嚴重(圖 4～7)。
圖4
圖 4 A組大鼠視網膜組織病理像。視網膜各層細胞排列整齊，ILM完整清晰HE×40?0?圖 5 B組大鼠視網膜組織病理像。建模后10周，ILM完整性破壞，NFL變薄，RGC數量減少，細胞邊界欠清；INL和ONL細胞邊界欠清，INL細胞稀疏，密度減少，ONL內側細胞密集，外側部分細胞相對密度減少HE×400?0?圖 6 B組大鼠視網膜組織病理像。6A～6C.干預后2、4、6周。隨干預時間延長視網膜各層細胞數量逐漸減少，ILM完整性逐漸破壞，NFL水腫逐漸加重HE×400?0?圖 7 D組大鼠視網膜組織病理像。7A～7C.干預后2、4、6周。隨干預時間延長各層細胞數逐漸增加，ILM完整性改善，NFL水腫減輕。INL、ONL逐漸增厚HE×400
3 討論
大量研究結果提示，DR神經元功能的失調明顯早于微脈管系統的病變[7, 8]，與糖尿病早期患者F-ERG檢查結果異常、暗適應下降、微視野差異相吻合[9, 10]。因此，研究DR的神經損傷與保護，對預防和逆轉早期DR中的神經病變有重要意義。神經細胞的凋亡在糖尿病誘發后1個月即能檢測到[11]。神經元的損傷表現為視網膜功能的失調。F-ERG可反應視網膜不同層次的功能狀態，是一種從視網膜細胞水平評價視覺功能的客觀檢查方法，對觀察DR病變的進程并預測發生增生性視網膜病變的危險具有十分重要的意義[12]。本研究結果顯示，建模后4周大鼠F-ERG的OPs已發生顯著性下降。說明內層視網膜功能受損，與文獻報道結果一致[9, 10]，而組織病理切片染色未發現明顯異常，提示DR早期視網膜可能已經發生了光學顯微鏡檢查未能發現的細微改變。
MSC是細胞注射治療視網膜變性類疾病的理想種子細胞。為了解決hUCMSC體內分化率低、歸巢能力差的問題，本研究中，我們在體外將hUCMSC分化為NSC，并經免疫熒光檢測特異性表面標記物驗證[6]，再通過局部注射移植入玻璃體腔。結果發現，NSC對糖尿病大鼠視網膜功能及結構均有改善作用。干預后2周，注射NSC組大鼠視網膜F-ERG已發生改善，暗適應Rod-R b波振幅、Max-R b波振幅、OPs總振幅較對照組提高，并隨著干預時間的延長，F-ERG各項指標均逐漸進一步好轉。而干預后直到第4周，D組大鼠視網膜損傷較同時間點B組大鼠明顯減輕，RGC數量相對較多，RGC細胞空泡化，染色質邊緣聚集現象較糖尿病大鼠較少，排列也較規整，NFL、INL、及ONL較厚，細胞排列也相對整齊。說明hUCMSC誘導的NSC對視網膜功能的改善作用早于其對結構的改善。另外，NSC可發揮神經營養及替代作用。本研究結果發現，D組大鼠OPs及b波較a波明顯改善。Kowluru等[13]對糖尿病大鼠給予營養補充劑類胡蘿卜素，也發現不但可以阻止糖尿病血管異常的發生，而且可以通過改善F-ERG a、b波振幅從而改善視網膜功能。
玻璃體腔注射hUCMSC體外誘導的NSC對糖尿病大鼠視網膜功能及結構均有改善作用。可能原因為NSC可以替換受損細胞，也可以通過分泌多種神經保護因子增強對糖尿病大鼠視網膜的神經保護作用。但NSC移植后在眼內的定位及分化均有待在今后的研究中進一步探討。
