引用本文： 余天, 邢怡橋, 陳長征. 小干擾RNA介導絲氨酸蛋白酶HtrA1沉默對光損傷人視網膜色素上皮細胞的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(4): 413-417. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.04.016 復制
絲氨酸蛋白酶HtrAl基因與老年性黃斑變性(AMD)具有顯著相關性；AMD患眼的玻璃膜疣、視網膜色素上皮(RPE)以及脈絡膜新生血管(CNV)的HtrA1表達均增高[1, 2]。Kumar等[3]在HtrA1過表達的小鼠RPE層觀察到細胞外基質的降解以及新生血管形成。可見光及紫外線尤其是光譜中的藍光可對RPE細胞產生光化學損傷，從而參與到AMD病理過程中[4, 5]。血管內皮生長因子(VEGF)在CNV形成過程中發揮著重要的作用。Kernt等[6]研究發現，光損傷后RPE分泌VEGF上升。但HtrA1在藍光光照RPE細胞中發揮的作用以及與VEGF之間是否存在關聯尚不明確。為此，我們通過體外培養人RPE細胞建立光損傷模型，應用小干擾RNA(siRNA)技術特異性干擾光損傷模型人RPE細胞中HtrA1的表達，觀察HtrA1沉默對RPE細胞的影響以及VEGF-A的表達情況。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人RPE細胞株ARPE-19(美國ATCC公司)，針對HtrA1的siRNA(美國Santa Cruz公司)，脂質體RNAimax (美國Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒、定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒以及逆轉錄試劑盒(德國QIAGEN公司)，細胞計數試劑盒(CCK-8，日本Dojindo公司)，transwell小室(美國Coming公司)，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)流式凋亡檢測以及細胞周期檢測試劑盒(美國R&D公司)，鼠抗人HtrA1抗體(美國R&D公司)，兔抗人VEGF-A抗體(美國Bioworld公司)，辣根過氧化物酶標記二抗(武漢博士德生物公司)，15 W藍色節能燈(荷蘭Philips公司)，MS6610數字式照度儀(深圳華誼儀表有限公司)，細胞培養箱(美國Thermo公司)。
采用含10％胎牛血清，100 U/L青鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)/F12培養基，在37℃、5％CO2培養箱中培養ARPE-19細胞。取第8～12代生長狀態良好的傳代細胞用于實驗。將細胞分為正常對照組、光損傷模型組。參照蔡善君等[7]方法及前期預實驗建立細胞光損傷模型。波長400 nm的15 W藍色燈自制成光照器，細胞平面光照強度控制在(2000±500) Lux，溫度變化在36.5～37.5℃，持續照射6 h。光損傷模型組建模后再分為HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組。
應用脂質體RNAimax將HtrA1 siRNA轉染至HtrA1 siRNA組細胞。將各組細胞接種于六孔板，調整細胞密度1×103個/孔，當細胞密度達到50％時換成OPTI-MEM培養基,加入預先配制HtrA1 siRNA/ 脂質體RNAimax復合物，使siRNA終濃度為100 nmol/L，轉染4 h后換液，改用DMEM/F12培養基繼續培養20 h后結束培養；陰性對照組細胞轉染非特異的陰性siRNA；空白對照組為單純光損傷細胞。
采用CCK-8增生分析法檢測干擾HtrA1表達對HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞增生的影響。各組細胞消化并接種于96孔板，調整細胞密度1×103個/孔加入含10％胎牛血清DMEM/F12培養基200 μl，各組細胞分別培養12、24、48 h后加入CCK-8液20 μl孵育4 h。酶標儀上以490 nm波長測定吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，以細胞A值平均值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。
Transwell小室法檢測HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞遷徙。含10％胎牛血清的DMEM/F12培養基600 μl置入下室，200 μl含1×105個各組培養的細胞加入上室，放入37℃、5％CO2培養箱培養24 h，棉簽擦去基底膜上室細胞，甲醛固定，吉姆薩染色，計數、拍照。
流式細胞儀檢測HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組凋亡以及細胞周期。收集細胞，80％乙醇4℃過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加入核糖核酸酶 5 μl(10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入PI(100 μg/ml) 染色液室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。Annexin V-FITC/PI雙標記法流式細胞儀分析細胞凋亡，具體方法按試劑盒說明書進行，采用Cellquest軟件分析。
RT-PCR檢測各組細胞中HtrA1、VEGF-A mRNA表達。RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上海生工生物技術服務有限公司合成。分別擴增HtrA1、VEGF-A和內參照β-肌動蛋白(actin)。HtrA1上游引物：5-AGTAAACCTGGACGGTGAA GTGATTG-3,下游引物：5-TTGGCTTTGCTGGAC GTGAGTG-3,合成產物192堿基對(bp)；VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3′，合成產物226 bp；β-actin上游引物：5′-GTCCACCGCA AATGCTTCTA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTT CACCGTTC -3′，合成產物190 bp。PCR反應條件：HtrA1 94℃預變性5 min，94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35個循環。其他的擴增反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重復40個循環。PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統行A掃描并用所測指標A/β-actin A值作為mRNA表達的相對強度。
蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組細胞HtrA1、VEGF-A蛋白表達。各組細胞光照24 h后提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉。以β-actin作為內參抗體，抗HtrA1及VEGF-A一抗4℃孵育過夜(分別按1 ∶200、 1 ∶5000稀釋)，洗膜緩沖液(TBST)洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，顯影定影。
各獨立實驗均重復3次。采用SPSS 13.0統計軟件行統計學分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
光損傷模型組細胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達均較正常對照組細胞明顯升高，差異有統計學意義(t=17.62、15.09，P<0.05)(圖 1,2)。
圖1
圖 1 光照前后RPE細胞HtrA1 mRNA表達情況。P<0.05 ??圖 2 光照前后RPE細胞HtrA1蛋白表達情況。 2A.正常對照組、光損傷模型組細胞中HtrA1蛋白表達電泳圖；2B.正常對照組、光損傷模型組HtrA1蛋白表達統計圖。P<0.05??圖 3各組細胞生長情況??圖 4 Transwell小室檢測各組細胞遷徙能力。P<0.05
CCK-8增生分析法結果顯示，隨著培養時間增加，HtrA1 siRNA組細胞較陰性對照組、空白對照組細胞生長曲線降低，48 h時差異有統計學意義(t=6.37、4.52，P<0.05)(圖 3)。
Transwell實驗結果顯示，HtrA1 siRNA組細胞細胞遷徙數量與陰性對照組、空白對照組細胞比較，細胞遷徙數量明顯下降，差異有統計學意義(t=9.56、12.13，P<0.05)(圖 4)；陰性對照組、空白對照組間細胞遷徙數量比較，差異無統計學意義(t=2.31，P>0.05)。
流式細胞儀檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡率分別為(3.2±1.3)％、(15.2±2.4)％、(17.3±1.9)％。HtrA1 siRNA組 細胞凋亡率較陰性對照組、空白對照組明顯減少，差異有統計學意義(t=23.37、29.08，P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(t=7.32，P>0.05)(圖 5)。HtrA1 siRNA組G0/G1期細胞數較陰性對照組和空白對照組明顯增加，差異有統計學差異(t=6.24、4.93，P<0.05)(圖 6)。
圖5
Annexin V-FITC / PI雙染法流式檢測各組細胞凋亡情況。5A.各組細胞凋亡情況；5B.各組凋亡細胞統計圖。P<0.05
圖6
各組細胞G0/G1期細胞比例。P<0.05
RT-PCR檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組細胞HtrA1(t=17.36、11.32)、VEGF-A(t=7.29、4.05) mRNA表達較陰性對照組和空白對照組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞HtrA1、VEGF-A mRNA表達比較，差異無統計學意義(t=3.41、1.89，P>0.05)(圖 7)。
圖7
各組細胞HtrA1及VEGF-A的mRNA表達情況。P<0.05
Western blot檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組 細胞HtrA1(t=12.02、15.28)、VEGF-A(t=4.98、6.24)蛋白表達較陰性對照組和空白對照組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞HtrA1、VEGF-A蛋白表達比較，差異無統計學意義(t=2.65、2.07，P>0.05)(圖 8)。
圖8
各組細胞HtrA1及VEGF-A蛋白表達情況。8A.陰性對照組、空白對照組及HtrA1 siRNA組HtrA1及VEGF-A蛋白表達電泳圖；8B. 各組HtrA1蛋白及VEGF-A表達統計圖。P<0.05
3 討論
RPE細胞結構和功能的改變是AMD和CNV發生發展的重要因素，可見光及紫外線尤其是光譜中的藍光可對RPE細胞產生光化學損傷[4, 5]。本研究為觀察RPE細胞結構和功能的變化，排除動物模型的種屬差異、多種體內因子影響，參考之前使用的藍光照射培養的ARPE-19細胞方法建立RPE細胞光損傷模型。
HtrA1是一種分泌蛋白，在胎盤、骨骼組織、血管以及眼等多種正常組織均有表達[8]。在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌等多種惡性腫瘤中呈低表達狀態，被認為是一種腫瘤抑制基因；在骨關節炎、類風濕性關節炎、AMD等中表達則增高[2, 9]。有研究結果顯示，萎縮型和滲出型AMD的玻璃膜疣中HtrA1表達均增高[2]。Pei等[10]研究發現沉默HtrAl后，RPE細胞的增生、遷徙能力下降。本研究通過siRNA干擾技術沉默光損傷模型細胞中HtrAl的表達，通過CCK-8、transwell小室法及流式細胞儀觀察干擾后RPE細胞的增生、遷徙、凋亡以及細胞周期的變化。結果顯示，HtrAl siRNA組細胞增生、遷徙能力及凋亡率均較對照組明顯下降，停留在G0/G1期的細胞數明顯增加。本研究結果與Pei等[10]研究結果相似。但Supanji等[11]研究發現RPE細胞在雙氧水氧化應激狀態下，HtrA1表達增高，對細胞衰老有促進作用，對細胞凋亡并未見促進作用。引起細胞衰老死亡的趨勢相同，但是卻以衰老變化為主，原因是所采用的的模型類型差別引起。
有研究發現HtrAl產物可以參與調節細胞外基質的降解，通過阻斷轉化生長因子-β信號通路從而作用于形成玻璃膜疣的細胞外基質組成成分Bruch膜進而參與CNV的形成[12]。近年研究發現，上調小鼠RPE層HtrAl的表達可引起脈絡膜血管出現AMD中相似的異常變化；在過表達HtrAl的轉基因小鼠中，CNV風險增高[3, 13]。Ng等[14]發現AMD患者房水以及應激炎癥狀態下胎兒RPE細胞中HtrA1及VEGF同時增高。VEGF-A在CNV的形成中發揮重要作用，前期有研究也證實VEGF-A在藍光RPE細胞損傷模型中表達增高[15]。本研究結果顯示光損傷模型組細胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達均較正常對照組明顯增高。siRNA干擾技術沉默HtrA1后，HtrAl siRNA組HtrA1、VEGF-A mRNA和蛋白表達均較陰性對照組和空白對照組明顯下降。提示在藍光損傷模型中干預HtrA1表達后VEGF表達也同時下降，二者可能存在一定關聯，有待進一步研究。
絲氨酸蛋白酶HtrAl基因與老年性黃斑變性(AMD)具有顯著相關性；AMD患眼的玻璃膜疣、視網膜色素上皮(RPE)以及脈絡膜新生血管(CNV)的HtrA1表達均增高[1, 2]。Kumar等[3]在HtrA1過表達的小鼠RPE層觀察到細胞外基質的降解以及新生血管形成。可見光及紫外線尤其是光譜中的藍光可對RPE細胞產生光化學損傷，從而參與到AMD病理過程中[4, 5]。血管內皮生長因子(VEGF)在CNV形成過程中發揮著重要的作用。Kernt等[6]研究發現，光損傷后RPE分泌VEGF上升。但HtrA1在藍光光照RPE細胞中發揮的作用以及與VEGF之間是否存在關聯尚不明確。為此，我們通過體外培養人RPE細胞建立光損傷模型，應用小干擾RNA(siRNA)技術特異性干擾光損傷模型人RPE細胞中HtrA1的表達，觀察HtrA1沉默對RPE細胞的影響以及VEGF-A的表達情況。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人RPE細胞株ARPE-19(美國ATCC公司)，針對HtrA1的siRNA(美國Santa Cruz公司)，脂質體RNAimax (美國Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒、定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒以及逆轉錄試劑盒(德國QIAGEN公司)，細胞計數試劑盒(CCK-8，日本Dojindo公司)，transwell小室(美國Coming公司)，膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)流式凋亡檢測以及細胞周期檢測試劑盒(美國R&D公司)，鼠抗人HtrA1抗體(美國R&D公司)，兔抗人VEGF-A抗體(美國Bioworld公司)，辣根過氧化物酶標記二抗(武漢博士德生物公司)，15 W藍色節能燈(荷蘭Philips公司)，MS6610數字式照度儀(深圳華誼儀表有限公司)，細胞培養箱(美國Thermo公司)。
采用含10％胎牛血清，100 U/L青鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)/F12培養基，在37℃、5％CO2培養箱中培養ARPE-19細胞。取第8～12代生長狀態良好的傳代細胞用于實驗。將細胞分為正常對照組、光損傷模型組。參照蔡善君等[7]方法及前期預實驗建立細胞光損傷模型。波長400 nm的15 W藍色燈自制成光照器，細胞平面光照強度控制在(2000±500) Lux，溫度變化在36.5～37.5℃，持續照射6 h。光損傷模型組建模后再分為HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組。
應用脂質體RNAimax將HtrA1 siRNA轉染至HtrA1 siRNA組細胞。將各組細胞接種于六孔板，調整細胞密度1×103個/孔，當細胞密度達到50％時換成OPTI-MEM培養基,加入預先配制HtrA1 siRNA/ 脂質體RNAimax復合物，使siRNA終濃度為100 nmol/L，轉染4 h后換液，改用DMEM/F12培養基繼續培養20 h后結束培養；陰性對照組細胞轉染非特異的陰性siRNA；空白對照組為單純光損傷細胞。
采用CCK-8增生分析法檢測干擾HtrA1表達對HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞增生的影響。各組細胞消化并接種于96孔板，調整細胞密度1×103個/孔加入含10％胎牛血清DMEM/F12培養基200 μl，各組細胞分別培養12、24、48 h后加入CCK-8液20 μl孵育4 h。酶標儀上以490 nm波長測定吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，以細胞A值平均值為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。
Transwell小室法檢測HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞遷徙。含10％胎牛血清的DMEM/F12培養基600 μl置入下室，200 μl含1×105個各組培養的細胞加入上室，放入37℃、5％CO2培養箱培養24 h，棉簽擦去基底膜上室細胞，甲醛固定，吉姆薩染色，計數、拍照。
流式細胞儀檢測HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組凋亡以及細胞周期。收集細胞，80％乙醇4℃過夜，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加入核糖核酸酶 5 μl(10 mg/ml)，37℃放置1 h，加入PI(100 μg/ml) 染色液室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。Annexin V-FITC/PI雙標記法流式細胞儀分析細胞凋亡，具體方法按試劑盒說明書進行，采用Cellquest軟件分析。
RT-PCR檢測各組細胞中HtrA1、VEGF-A mRNA表達。RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，上海生工生物技術服務有限公司合成。分別擴增HtrA1、VEGF-A和內參照β-肌動蛋白(actin)。HtrA1上游引物：5-AGTAAACCTGGACGGTGAA GTGATTG-3,下游引物：5-TTGGCTTTGCTGGAC GTGAGTG-3,合成產物192堿基對(bp)；VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-3′，合成產物226 bp；β-actin上游引物：5′-GTCCACCGCA AATGCTTCTA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTT CACCGTTC -3′，合成產物190 bp。PCR反應條件：HtrA1 94℃預變性5 min，94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，共35個循環。其他的擴增反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重復40個循環。PCR產物行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統行A掃描并用所測指標A/β-actin A值作為mRNA表達的相對強度。
蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組細胞HtrA1、VEGF-A蛋白表達。各組細胞光照24 h后提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉。以β-actin作為內參抗體，抗HtrA1及VEGF-A一抗4℃孵育過夜(分別按1 ∶200、 1 ∶5000稀釋)，洗膜緩沖液(TBST)洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，顯影定影。
各獨立實驗均重復3次。采用SPSS 13.0統計軟件行統計學分析處理。數據以均數±標準差(
2 結果
光損傷模型組細胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達均較正常對照組細胞明顯升高，差異有統計學意義(t=17.62、15.09，P<0.05)(圖 1,2)。
圖1
圖 1 光照前后RPE細胞HtrA1 mRNA表達情況。P<0.05 ??圖 2 光照前后RPE細胞HtrA1蛋白表達情況。 2A.正常對照組、光損傷模型組細胞中HtrA1蛋白表達電泳圖；2B.正常對照組、光損傷模型組HtrA1蛋白表達統計圖。P<0.05??圖 3各組細胞生長情況??圖 4 Transwell小室檢測各組細胞遷徙能力。P<0.05
CCK-8增生分析法結果顯示，隨著培養時間增加，HtrA1 siRNA組細胞較陰性對照組、空白對照組細胞生長曲線降低，48 h時差異有統計學意義(t=6.37、4.52，P<0.05)(圖 3)。
Transwell實驗結果顯示，HtrA1 siRNA組細胞細胞遷徙數量與陰性對照組、空白對照組細胞比較，細胞遷徙數量明顯下降，差異有統計學意義(t=9.56、12.13，P<0.05)(圖 4)；陰性對照組、空白對照組間細胞遷徙數量比較，差異無統計學意義(t=2.31，P>0.05)。
流式細胞儀檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組細胞凋亡率分別為(3.2±1.3)％、(15.2±2.4)％、(17.3±1.9)％。HtrA1 siRNA組 細胞凋亡率較陰性對照組、空白對照組明顯減少，差異有統計學意義(t=23.37、29.08，P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞凋亡率比較，差異無統計學意義(t=7.32，P>0.05)(圖 5)。HtrA1 siRNA組G0/G1期細胞數較陰性對照組和空白對照組明顯增加，差異有統計學差異(t=6.24、4.93，P<0.05)(圖 6)。
圖5
Annexin V-FITC / PI雙染法流式檢測各組細胞凋亡情況。5A.各組細胞凋亡情況；5B.各組凋亡細胞統計圖。P<0.05
圖6
各組細胞G0/G1期細胞比例。P<0.05
RT-PCR檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組細胞HtrA1(t=17.36、11.32)、VEGF-A(t=7.29、4.05) mRNA表達較陰性對照組和空白對照組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞HtrA1、VEGF-A mRNA表達比較，差異無統計學意義(t=3.41、1.89，P>0.05)(圖 7)。
圖7
各組細胞HtrA1及VEGF-A的mRNA表達情況。P<0.05
Western blot檢測結果顯示，HtrA1 siRNA組 細胞HtrA1(t=12.02、15.28)、VEGF-A(t=4.98、6.24)蛋白表達較陰性對照組和空白對照組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)；陰性對照組、空白對照組間細胞HtrA1、VEGF-A蛋白表達比較，差異無統計學意義(t=2.65、2.07，P>0.05)(圖 8)。
圖8
各組細胞HtrA1及VEGF-A蛋白表達情況。8A.陰性對照組、空白對照組及HtrA1 siRNA組HtrA1及VEGF-A蛋白表達電泳圖；8B. 各組HtrA1蛋白及VEGF-A表達統計圖。P<0.05
3 討論
RPE細胞結構和功能的改變是AMD和CNV發生發展的重要因素，可見光及紫外線尤其是光譜中的藍光可對RPE細胞產生光化學損傷[4, 5]。本研究為觀察RPE細胞結構和功能的變化，排除動物模型的種屬差異、多種體內因子影響，參考之前使用的藍光照射培養的ARPE-19細胞方法建立RPE細胞光損傷模型。
HtrA1是一種分泌蛋白，在胎盤、骨骼組織、血管以及眼等多種正常組織均有表達[8]。在卵巢癌、黑色素瘤、肺癌等多種惡性腫瘤中呈低表達狀態，被認為是一種腫瘤抑制基因；在骨關節炎、類風濕性關節炎、AMD等中表達則增高[2, 9]。有研究結果顯示，萎縮型和滲出型AMD的玻璃膜疣中HtrA1表達均增高[2]。Pei等[10]研究發現沉默HtrAl后，RPE細胞的增生、遷徙能力下降。本研究通過siRNA干擾技術沉默光損傷模型細胞中HtrAl的表達，通過CCK-8、transwell小室法及流式細胞儀觀察干擾后RPE細胞的增生、遷徙、凋亡以及細胞周期的變化。結果顯示，HtrAl siRNA組細胞增生、遷徙能力及凋亡率均較對照組明顯下降，停留在G0/G1期的細胞數明顯增加。本研究結果與Pei等[10]研究結果相似。但Supanji等[11]研究發現RPE細胞在雙氧水氧化應激狀態下，HtrA1表達增高，對細胞衰老有促進作用，對細胞凋亡并未見促進作用。引起細胞衰老死亡的趨勢相同，但是卻以衰老變化為主，原因是所采用的的模型類型差別引起。
有研究發現HtrAl產物可以參與調節細胞外基質的降解，通過阻斷轉化生長因子-β信號通路從而作用于形成玻璃膜疣的細胞外基質組成成分Bruch膜進而參與CNV的形成[12]。近年研究發現，上調小鼠RPE層HtrAl的表達可引起脈絡膜血管出現AMD中相似的異常變化；在過表達HtrAl的轉基因小鼠中，CNV風險增高[3, 13]。Ng等[14]發現AMD患者房水以及應激炎癥狀態下胎兒RPE細胞中HtrA1及VEGF同時增高。VEGF-A在CNV的形成中發揮重要作用，前期有研究也證實VEGF-A在藍光RPE細胞損傷模型中表達增高[15]。本研究結果顯示光損傷模型組細胞中HtrA1 mRNA、蛋白表達均較正常對照組明顯增高。siRNA干擾技術沉默HtrA1后，HtrAl siRNA組HtrA1、VEGF-A mRNA和蛋白表達均較陰性對照組和空白對照組明顯下降。提示在藍光損傷模型中干預HtrA1表達后VEGF表達也同時下降，二者可能存在一定關聯，有待進一步研究。
