光遺傳學技術是一種將光學和遺傳學技術相結合的新興技術。其主要原理是應用遺傳學方法將特異的視蛋白導入目標神經元, 再用相應波長或頻率的光刺激視蛋白, 使神經元興奮或抑制, 進而控制特定神經環路的活動, 最終起到調控實驗動物生理活動和行為的作用。在視網膜色素變性、老年性黃斑變性等視網膜變性性疾病中, 應用光遺傳學技術玻璃體腔或視網膜下注射視蛋白基因, 由外界給予相應的光照激活視蛋白, 模擬并代替視網膜光感受器功能, 可在一定程度上恢復患者視力。但其存在病毒轉染有潛在風險、目標細胞的準確選擇難以把握、治療后視力分辨率能否恢復正常尚不確定等局限性。隨著光敏感度更高、更易被激發的新型視蛋白和具有更高轉染效率的病毒載體不斷研發, 相信光遺傳學技術將會應用在更多眼科領域。
引用本文： 沈雨濛, 邢怡橋, 沈吟. 光遺傳學技術及其在視網膜變性性疾病治療中的應用. 中華眼底病雜志, 2016, 32(3): 338-342. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.03.030 復制
光遺傳學技術(Optogenetics)是一種將光學和遺傳學技術結合起來的新興技術[1]。通過遺傳學方法將特異的視蛋白導入目標神經元，再用相應波長或頻率的光刺激視蛋白，使神經元興奮或抑制，進而控制特定神經環路的活動，最終起到調控實驗動物生理活動和行為的作用[2]。與傳統的藥物刺激和電極電刺激技術相比，光遺傳學技術可通過遺傳學技術將視蛋白特異地轉染入某一選定的細胞，從而實現對某一類型細胞特異的刺激；對實驗動物的損傷小，產生的刺激是由視蛋白離子通道介導，其刺激將沿著神經通路本身的傳導方向傳遞，更接近生理性的神經系統興奮方式[3]；可通過表達不同的視蛋白而產生興奮或抑制兩種效果。光遺傳學技術的發現為神經生物學領域的研究提供了嶄新視角并得到了廣泛應用[4]。盡管已有一系列研究運用光遺傳學技術在動物模型上成功使其視力得到一定程度恢復，但其仍存在病毒轉染有潛在風險、目標細胞的準確選擇難以把握、治療后視力分辨率能否恢復正常尚不確定等局限性[5]。現就光遺傳學技術的基本原理及其在視網膜變性性疾病治療研究中的應用現狀作一綜述。
1 視蛋白
光遺傳學技術的核心部分為視蛋白，分為非動物視蛋白或微生物視蛋白(Ⅰ型視蛋白)和動物視蛋白(Ⅱ型視蛋白)兩種類型。Ⅰ型視蛋白主要存在于原核生物中，為原核生物的趨光活動提供能量和光合作用；Ⅱ型視蛋白主要存在于真核生物中，主要作用是參與視覺產生的活動和高級動物的晝夜節律[6]。兩種類型的視蛋白均具有7次跨膜蛋白螺旋結構，并均以視黃醛作為其發色團，與其結合為視紫紅質，介導對光反應的產生。在光照下視黃醛由11-順式視黃醛變構為全反式視黃醛，引起視紫紅質的分解，產生對光反應。
目前用于光遺傳學技術的Ⅰ型視蛋白結構簡單、反應快，可作為精確的分子光敏組分，導入非光敏細胞后，可從時間和空間上來介導非光敏細胞。其主要包括細菌視紫紅質(BR)、鹽視紫紅質(HR)、通道視紫紅質(ChR)3種蛋白。BR是首個被鑒定，也是迄今為止被研究得最多的視蛋白。BR分子由248個氨基酸殘基組成，蛋白分子在空間上折疊形成7次跨膜螺旋結構，N′端位于細胞膜外側，C′端位于細胞膜內側，螺旋結構基本垂直于細胞膜。每個BR蛋白在其細胞膜內側216位的氨基酸殘基上結合一個視黃醛生色團。BR的使用光譜范圍寬，可被400～700 nm的光激發，具有高空間分辨率(5000 lines/mm)和高感光靈敏度(30～80 mJ/cm2)[7]。它在低氧條件下高表達于鹽古細菌膜上，可把質子從細胞質轉運到細胞外，從而使細胞超極化。HR與BR一樣具有7次跨膜螺旋結構，但并不偶聯G蛋白受體。最大吸收波長為570 nm，是由微生物視蛋白基因編碼的一個光激活氯離子泵[8]。離子通道開閉原理與BR類似，但HR為氯離子泵。給予570 nm的黃光照射時，含HR的細胞會超極化。HR蛋白基因已成功在小鼠視網膜神經節細胞和離體的小鼠視錐細胞表達[9, 10]。ChR于1984年首次在單細胞植物綠藻中發現[11]。目前被廣泛研究的是ChR2，它由737個氨基酸殘基組成。與BR、HR相同，ChR2具有7次跨膜α螺旋結構，并通過席夫堿(亞胺或甲亞胺特性基團)與全反式視黃醛相連接。與其他7次跨膜蛋白質不同，ChR2不需要第二信使來開啟離子通道，而是通過自身的變構來開放離子通道。被激發后，全反式視黃醛變構為13-順式視黃醛，使ChR2上的非選擇性陽離子通道開放，引起細胞的去極化[12]。ChR2基因已成功從萊茵衣藻中克隆，并成功表達在爪蟾卵母細胞和人胚腎293細胞系中[13]。兼具反應快速和光敏感性高以及在持續光照時不易失敏的理想ChR2仍然在探索中[14]。
Ⅱ型視蛋白近年來也逐漸運用于光遺傳學技術中，目前研究較多的是視黑素(melanopsin)[15]。視黑素于1998年首次被發現，它是一種存在于哺乳動物視網膜中，與G蛋白耦聯的光敏色素。由OPN4基因編碼，在視網膜中主要存在于感光神經節細胞中，在瞳孔對光反射和調控晝夜節律中起重要作用[16]。僅0.11%~0.55%的視錐細胞中有視黑素的表達，而且大部分這類視錐細胞都位于視網膜周邊[17]。視黑素可被467 nm的藍光激發，通過與Gq亞型的G蛋白耦聯，可使下游的瞬時感受器電位通道開放，從而使鈣離子進入細胞，在幾十秒的短時間內使細胞興奮[18]。與ChR2比較，因視黑素本身即存在哺乳動物視網膜內，故可被自然光線激發，并且在長時間激發下不易失活[19]；而ChR2需要短波長強激光激發，易被漂白而失活[20]。更重要的是，視黑素作為光敏蛋白導入目標細胞后，可以在生理水平上發揮作用，視網膜原有的信號通路及調控因子均可對其進行調節[21]；而ChR2作為異種蛋白不具備這種特性。并且已有研究表明，將視黑素異位表達于非感光神經節細胞中時，視黑素將表現更高的光敏感性和更長的激活時間[22]。
2 在目標細胞中表達視蛋白
光遺傳學技術的第2個關鍵問題在于將微生物視蛋白基因轉入并表達。目前主流方法有轉染、病毒轉導、轉基因動物。
轉染即將外源性DNA插入目標細胞或細胞系的過程。主要分為化學轉染法和物理轉染法。化學轉染法包括二乙氨乙基-葡聚糖法、磷酸鈣和人工脂質體法；物理轉染法包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。轉染的優點在于它未向目標細胞中引入人類及動植物病原體、寄生動物病及毒素等生物制劑，所以相對而言較為安全；但其局限是在宿主細胞中的表達效率較低，并且在體動物中的轉染仍然存在技術上的困難[14]。
病毒轉導是光遺傳學技術中應用最普遍的基因轉入方法，具體方法是將含有視蛋白基因的重組病毒注入在體動物特定的組織以使視蛋白表達在目標細胞或組織內。該技術中主要應用的病毒有腺病毒、逆轉錄酶病毒、慢病毒和腺相關病毒(AAV)等[23]。目前主要應用于光遺傳學技術的是AAV。但AAV的局限性在于導入基因長度不能過長，基因的啟動子不能超過4 kb，并且啟動子需要非常精確、高效[24]；向活體動物體內注入外源性病毒，有可能會引起不可預計的免疫反應，影響實驗結果。
轉基因動物目前在光遺傳學技術中廣泛使用。Arenkiel等[25]通過轉基因的方法使ChR-YFP在小鼠中表達。同樣應用于光遺傳學技術中的轉基因動物還有斑馬魚、果蠅和靈長類動物[26-28]。Weick等[29]在人胚胎干細胞誘導出的神經元中成功表達了ChR2基因。轉基因動物的優勢在于轉入基因的表達量會隨著動物的生長而增加，當動物達到一定年齡時，轉入的視蛋白表達含量將相當可觀。但其困難在于，如果將基因表達在如腦部這樣的深部組織，用來激發ChR2的藍光將無法達到腦部深處[30]。但是對于激發相對淺層的視網膜上表達蛋白在理論上不存在困難。
3 光遺傳學技術在視網膜變性性疾病治療中的應用
由于光感受器異常導致視力下降甚至失明的一類疾病在眼科尚無特效藥和有效的手術方法。最常見的是視網膜色素變性(RP)、類RP，其病因為視紫紅質基因突變[31]。這類疾病還包括視網膜色素上皮紊亂導致的Leber先天性黑矇、三磷酸腺苷結合轉運蛋白異常引起的Stargardt病、老年性黃斑變性等[32-35]。這類疾病的共同特征是，在疾病早期僅僅表現為部分光感受器細胞功能的損傷，而二級神經元雙極細胞和三級神經元神經節細胞均正常，患者僅表現為暗適應受損和(或)管狀視力等，并且大部分患者將在這一階段持續較長的時間。如果在這一階段能恢復光感受器細胞的功能，即可使患者的視力得到提升甚至恢復，并能阻止疾病的進一步發展，防止視網膜出現不可逆的神經元及神經膠質的重塑和異常神經突觸的生成[36]。視蛋白的發現和光遺傳學技術的發展為研究和治療這一系列由于光感受器細胞異常所致的視網膜疾病提供了新的方法和方向。
目前廣泛運用于光遺傳學技術的小鼠模型是rd模型小鼠[37]。Rd模型小鼠是一種Pde6b基因缺失，使其在出生后10 d起視網膜便開始出現視桿細胞凋亡，至3周時視桿細胞全部凋亡，隨后視錐細胞開始凋亡，直到視力完全喪失約1年時間[38]。Rd模型小鼠很好的模擬了RP等一系列以光感受器細胞受損為早期表現，發展較緩慢，最終以神經元和神經膠質細胞的異常增生和分布等視網膜不可逆的重塑、視力喪失為主要表現的疾病[37]。加之rd模型小鼠繁殖較快，已是科學研究中廣泛使用的實驗模型小鼠，是光遺傳學技術研究的良好模型。Lagali等[39]研究表明，在處于RP初期的rd1小鼠中用AAV將ChR2基因轉入后，可在去極化型(ON型)雙極細胞的樹突處成功表達，從而使小鼠的視力得到提升。Lin等[22]將視黑素用AAV導入rd1小鼠非感光神經節細胞中，發現視黑素可在非感光神經節細胞中正常表達，并且能使非感光神經節細胞具有感光功能，進而使小鼠的視力得到一定程度恢復；同時還發現將視黑素異位表達于非感光神經節細胞中時，視黑素會表現更高的光敏感性和更長的激活時間。而當rd1小鼠處于RP晚期時，光感受器細胞和雙極細胞大量損傷，殘存的神經節細胞功能異常。目前尚無研究表明可在處于此期的模型中成功轉入視蛋白并使視功能得到恢復。提示當患者處于疾病早期時，視網膜僅存在光感受器細胞的損傷，其他下級的神經元結構及功能尚正常，及時采取光遺傳學技術將外源視蛋白基因導入病變的光感受器細胞或者下一級的神經元細胞，便可通過外界給予光照來激活導入的視蛋白，代替光感受器細胞的作用，使光信號的傳導得以完成，從而使患者恢復視覺。
4 光遺傳學技術在眼科臨床應用的局限性和展望
盡管目前臨床前期研究尚未發現應用光遺傳學技術對視網膜進行病毒轉染時對實驗動物有嚴重影響；但通過長期觀察發現，當在小鼠大腦皮質中高水平轉入ChR2后可見異常的細胞形態和細胞連接[40]。在靈長類實驗動物進行的病毒轉染仍然缺乏成功的報道，并且病毒轉染仍可能存在著未被發現的其他不利影響。這些都阻礙著病毒轉染在臨床中廣泛應用。
Busskamp等[10]成功將HR表達在小鼠的視錐細胞中。然而選擇光感受器細胞作為病毒轉染目標細胞的最主要缺點是RP晚期視錐細胞只存在于黃斑處，即使將視蛋白轉入視錐細胞也僅僅能彌補黃斑處的視力，結果與處于中期RP所表現的管狀視力十分相似[41]。而且在其他的視網膜營養障礙性疾病中，光感受器細胞往往已受到損害，無法導入視蛋白。
于是研究者們將目標細胞轉向光感受器細胞的下一級神經元細胞雙極細胞。由于雙極細胞分為ON型和超極化型(OFF型)兩類，所以不可能僅將一種單一的視蛋白轉入所有雙極細胞，同時產生這兩種對光反應；而需要特異性的將具有去極化作用的視蛋白導入ON型雙極細胞，將具有超極化作用的視蛋白導入OFF型雙極細胞。Lagali等[39]成功將ChR2特異地表達在rd1小鼠的ON型雙極細胞上。Doroudchi等[42]成功將ChR2表達在rd6和rd10小鼠模型的ON型雙極細胞上。由于ChR2需要較高的光照強度，Kleinlogel等[43]通過改造ChR2得到了對光照更加敏感的突變體CatCh，成功解決了這一問題。然而，如果選擇雙極細胞作為目標細胞，仍然會受到光感受器細胞損傷所導致的其在解剖位置上的重塑、生理功能的紊亂和病理性連接的大量產生等影響。
研究者試圖繞過受損的視網膜內層，直接將視蛋白轉入神經節細胞，但結果并不令人滿意。Thyagarajan等[44]將ChR2轉入rd1小鼠神經節細胞，雖然ChR2在40%的神經節細胞中表達，但轉入ChR2的小鼠視覺功能與未轉入小鼠相比并未提高。原因可能是未將生理情況下ON型和OFF型雙極細胞傳入的光信號區分開，而目前特異性地將視蛋白轉入ON型或OFF型的神經節細胞這一技術尚未成熟。視黑素的發現較好的解決了這一問題，將視黑素導入神經節細胞，可使神經節細胞獲得感光能力，使小鼠的視力得到恢復[45]。目前關于視黑素在光遺傳學技術中的研究僅限于小鼠，尚無在更高級動物中的實驗。也尚無對轉染后動物視覺的分辨率是否能恢復到正常水平進行研究。
光遺傳學技術的發展顯示了交叉學科研究的潛力與生命科學新研究方法的重要性，為眼科領域的研究打開了新的大門，為許多目前無法治愈的眼部疾病提供了新的思路，擁有巨大的應用前景。并且，光遺傳學技術還在不斷優化，光敏感度更高、更易被激發的新型視蛋白和具有更高轉染效率的病毒載體正不斷被研發。光遺傳學技術在時間和空間上的優越性使得該項技術在多種動物模型中廣泛應用，相信光遺傳學技術將會應用在更多眼科領域，并取得更多成果造福人類。
光遺傳學技術(Optogenetics)是一種將光學和遺傳學技術結合起來的新興技術[1]。通過遺傳學方法將特異的視蛋白導入目標神經元，再用相應波長或頻率的光刺激視蛋白，使神經元興奮或抑制，進而控制特定神經環路的活動，最終起到調控實驗動物生理活動和行為的作用[2]。與傳統的藥物刺激和電極電刺激技術相比，光遺傳學技術可通過遺傳學技術將視蛋白特異地轉染入某一選定的細胞，從而實現對某一類型細胞特異的刺激；對實驗動物的損傷小，產生的刺激是由視蛋白離子通道介導，其刺激將沿著神經通路本身的傳導方向傳遞，更接近生理性的神經系統興奮方式[3]；可通過表達不同的視蛋白而產生興奮或抑制兩種效果。光遺傳學技術的發現為神經生物學領域的研究提供了嶄新視角并得到了廣泛應用[4]。盡管已有一系列研究運用光遺傳學技術在動物模型上成功使其視力得到一定程度恢復，但其仍存在病毒轉染有潛在風險、目標細胞的準確選擇難以把握、治療后視力分辨率能否恢復正常尚不確定等局限性[5]。現就光遺傳學技術的基本原理及其在視網膜變性性疾病治療研究中的應用現狀作一綜述。
1 視蛋白
光遺傳學技術的核心部分為視蛋白，分為非動物視蛋白或微生物視蛋白(Ⅰ型視蛋白)和動物視蛋白(Ⅱ型視蛋白)兩種類型。Ⅰ型視蛋白主要存在于原核生物中，為原核生物的趨光活動提供能量和光合作用；Ⅱ型視蛋白主要存在于真核生物中，主要作用是參與視覺產生的活動和高級動物的晝夜節律[6]。兩種類型的視蛋白均具有7次跨膜蛋白螺旋結構，并均以視黃醛作為其發色團，與其結合為視紫紅質，介導對光反應的產生。在光照下視黃醛由11-順式視黃醛變構為全反式視黃醛，引起視紫紅質的分解，產生對光反應。
目前用于光遺傳學技術的Ⅰ型視蛋白結構簡單、反應快，可作為精確的分子光敏組分，導入非光敏細胞后，可從時間和空間上來介導非光敏細胞。其主要包括細菌視紫紅質(BR)、鹽視紫紅質(HR)、通道視紫紅質(ChR)3種蛋白。BR是首個被鑒定，也是迄今為止被研究得最多的視蛋白。BR分子由248個氨基酸殘基組成，蛋白分子在空間上折疊形成7次跨膜螺旋結構，N′端位于細胞膜外側，C′端位于細胞膜內側，螺旋結構基本垂直于細胞膜。每個BR蛋白在其細胞膜內側216位的氨基酸殘基上結合一個視黃醛生色團。BR的使用光譜范圍寬，可被400～700 nm的光激發，具有高空間分辨率(5000 lines/mm)和高感光靈敏度(30～80 mJ/cm2)[7]。它在低氧條件下高表達于鹽古細菌膜上，可把質子從細胞質轉運到細胞外，從而使細胞超極化。HR與BR一樣具有7次跨膜螺旋結構，但并不偶聯G蛋白受體。最大吸收波長為570 nm，是由微生物視蛋白基因編碼的一個光激活氯離子泵[8]。離子通道開閉原理與BR類似，但HR為氯離子泵。給予570 nm的黃光照射時，含HR的細胞會超極化。HR蛋白基因已成功在小鼠視網膜神經節細胞和離體的小鼠視錐細胞表達[9, 10]。ChR于1984年首次在單細胞植物綠藻中發現[11]。目前被廣泛研究的是ChR2，它由737個氨基酸殘基組成。與BR、HR相同，ChR2具有7次跨膜α螺旋結構，并通過席夫堿(亞胺或甲亞胺特性基團)與全反式視黃醛相連接。與其他7次跨膜蛋白質不同，ChR2不需要第二信使來開啟離子通道，而是通過自身的變構來開放離子通道。被激發后，全反式視黃醛變構為13-順式視黃醛，使ChR2上的非選擇性陽離子通道開放，引起細胞的去極化[12]。ChR2基因已成功從萊茵衣藻中克隆，并成功表達在爪蟾卵母細胞和人胚腎293細胞系中[13]。兼具反應快速和光敏感性高以及在持續光照時不易失敏的理想ChR2仍然在探索中[14]。
Ⅱ型視蛋白近年來也逐漸運用于光遺傳學技術中，目前研究較多的是視黑素(melanopsin)[15]。視黑素于1998年首次被發現，它是一種存在于哺乳動物視網膜中，與G蛋白耦聯的光敏色素。由OPN4基因編碼，在視網膜中主要存在于感光神經節細胞中，在瞳孔對光反射和調控晝夜節律中起重要作用[16]。僅0.11%~0.55%的視錐細胞中有視黑素的表達，而且大部分這類視錐細胞都位于視網膜周邊[17]。視黑素可被467 nm的藍光激發，通過與Gq亞型的G蛋白耦聯，可使下游的瞬時感受器電位通道開放，從而使鈣離子進入細胞，在幾十秒的短時間內使細胞興奮[18]。與ChR2比較，因視黑素本身即存在哺乳動物視網膜內，故可被自然光線激發，并且在長時間激發下不易失活[19]；而ChR2需要短波長強激光激發，易被漂白而失活[20]。更重要的是，視黑素作為光敏蛋白導入目標細胞后，可以在生理水平上發揮作用，視網膜原有的信號通路及調控因子均可對其進行調節[21]；而ChR2作為異種蛋白不具備這種特性。并且已有研究表明，將視黑素異位表達于非感光神經節細胞中時，視黑素將表現更高的光敏感性和更長的激活時間[22]。
2 在目標細胞中表達視蛋白
光遺傳學技術的第2個關鍵問題在于將微生物視蛋白基因轉入并表達。目前主流方法有轉染、病毒轉導、轉基因動物。
轉染即將外源性DNA插入目標細胞或細胞系的過程。主要分為化學轉染法和物理轉染法。化學轉染法包括二乙氨乙基-葡聚糖法、磷酸鈣和人工脂質體法；物理轉染法包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。轉染的優點在于它未向目標細胞中引入人類及動植物病原體、寄生動物病及毒素等生物制劑，所以相對而言較為安全；但其局限是在宿主細胞中的表達效率較低，并且在體動物中的轉染仍然存在技術上的困難[14]。
病毒轉導是光遺傳學技術中應用最普遍的基因轉入方法，具體方法是將含有視蛋白基因的重組病毒注入在體動物特定的組織以使視蛋白表達在目標細胞或組織內。該技術中主要應用的病毒有腺病毒、逆轉錄酶病毒、慢病毒和腺相關病毒(AAV)等[23]。目前主要應用于光遺傳學技術的是AAV。但AAV的局限性在于導入基因長度不能過長，基因的啟動子不能超過4 kb，并且啟動子需要非常精確、高效[24]；向活體動物體內注入外源性病毒，有可能會引起不可預計的免疫反應，影響實驗結果。
轉基因動物目前在光遺傳學技術中廣泛使用。Arenkiel等[25]通過轉基因的方法使ChR-YFP在小鼠中表達。同樣應用于光遺傳學技術中的轉基因動物還有斑馬魚、果蠅和靈長類動物[26-28]。Weick等[29]在人胚胎干細胞誘導出的神經元中成功表達了ChR2基因。轉基因動物的優勢在于轉入基因的表達量會隨著動物的生長而增加，當動物達到一定年齡時，轉入的視蛋白表達含量將相當可觀。但其困難在于，如果將基因表達在如腦部這樣的深部組織，用來激發ChR2的藍光將無法達到腦部深處[30]。但是對于激發相對淺層的視網膜上表達蛋白在理論上不存在困難。
3 光遺傳學技術在視網膜變性性疾病治療中的應用
由于光感受器異常導致視力下降甚至失明的一類疾病在眼科尚無特效藥和有效的手術方法。最常見的是視網膜色素變性(RP)、類RP，其病因為視紫紅質基因突變[31]。這類疾病還包括視網膜色素上皮紊亂導致的Leber先天性黑矇、三磷酸腺苷結合轉運蛋白異常引起的Stargardt病、老年性黃斑變性等[32-35]。這類疾病的共同特征是，在疾病早期僅僅表現為部分光感受器細胞功能的損傷，而二級神經元雙極細胞和三級神經元神經節細胞均正常，患者僅表現為暗適應受損和(或)管狀視力等，并且大部分患者將在這一階段持續較長的時間。如果在這一階段能恢復光感受器細胞的功能，即可使患者的視力得到提升甚至恢復，并能阻止疾病的進一步發展，防止視網膜出現不可逆的神經元及神經膠質的重塑和異常神經突觸的生成[36]。視蛋白的發現和光遺傳學技術的發展為研究和治療這一系列由于光感受器細胞異常所致的視網膜疾病提供了新的方法和方向。
目前廣泛運用于光遺傳學技術的小鼠模型是rd模型小鼠[37]。Rd模型小鼠是一種Pde6b基因缺失，使其在出生后10 d起視網膜便開始出現視桿細胞凋亡，至3周時視桿細胞全部凋亡，隨后視錐細胞開始凋亡，直到視力完全喪失約1年時間[38]。Rd模型小鼠很好的模擬了RP等一系列以光感受器細胞受損為早期表現，發展較緩慢，最終以神經元和神經膠質細胞的異常增生和分布等視網膜不可逆的重塑、視力喪失為主要表現的疾病[37]。加之rd模型小鼠繁殖較快，已是科學研究中廣泛使用的實驗模型小鼠，是光遺傳學技術研究的良好模型。Lagali等[39]研究表明，在處于RP初期的rd1小鼠中用AAV將ChR2基因轉入后，可在去極化型(ON型)雙極細胞的樹突處成功表達，從而使小鼠的視力得到提升。Lin等[22]將視黑素用AAV導入rd1小鼠非感光神經節細胞中，發現視黑素可在非感光神經節細胞中正常表達，并且能使非感光神經節細胞具有感光功能，進而使小鼠的視力得到一定程度恢復；同時還發現將視黑素異位表達于非感光神經節細胞中時，視黑素會表現更高的光敏感性和更長的激活時間。而當rd1小鼠處于RP晚期時，光感受器細胞和雙極細胞大量損傷，殘存的神經節細胞功能異常。目前尚無研究表明可在處于此期的模型中成功轉入視蛋白并使視功能得到恢復。提示當患者處于疾病早期時，視網膜僅存在光感受器細胞的損傷，其他下級的神經元結構及功能尚正常，及時采取光遺傳學技術將外源視蛋白基因導入病變的光感受器細胞或者下一級的神經元細胞，便可通過外界給予光照來激活導入的視蛋白，代替光感受器細胞的作用，使光信號的傳導得以完成，從而使患者恢復視覺。
4 光遺傳學技術在眼科臨床應用的局限性和展望
盡管目前臨床前期研究尚未發現應用光遺傳學技術對視網膜進行病毒轉染時對實驗動物有嚴重影響；但通過長期觀察發現，當在小鼠大腦皮質中高水平轉入ChR2后可見異常的細胞形態和細胞連接[40]。在靈長類實驗動物進行的病毒轉染仍然缺乏成功的報道，并且病毒轉染仍可能存在著未被發現的其他不利影響。這些都阻礙著病毒轉染在臨床中廣泛應用。
Busskamp等[10]成功將HR表達在小鼠的視錐細胞中。然而選擇光感受器細胞作為病毒轉染目標細胞的最主要缺點是RP晚期視錐細胞只存在于黃斑處，即使將視蛋白轉入視錐細胞也僅僅能彌補黃斑處的視力，結果與處于中期RP所表現的管狀視力十分相似[41]。而且在其他的視網膜營養障礙性疾病中，光感受器細胞往往已受到損害，無法導入視蛋白。
于是研究者們將目標細胞轉向光感受器細胞的下一級神經元細胞雙極細胞。由于雙極細胞分為ON型和超極化型(OFF型)兩類，所以不可能僅將一種單一的視蛋白轉入所有雙極細胞，同時產生這兩種對光反應；而需要特異性的將具有去極化作用的視蛋白導入ON型雙極細胞，將具有超極化作用的視蛋白導入OFF型雙極細胞。Lagali等[39]成功將ChR2特異地表達在rd1小鼠的ON型雙極細胞上。Doroudchi等[42]成功將ChR2表達在rd6和rd10小鼠模型的ON型雙極細胞上。由于ChR2需要較高的光照強度，Kleinlogel等[43]通過改造ChR2得到了對光照更加敏感的突變體CatCh，成功解決了這一問題。然而，如果選擇雙極細胞作為目標細胞，仍然會受到光感受器細胞損傷所導致的其在解剖位置上的重塑、生理功能的紊亂和病理性連接的大量產生等影響。
研究者試圖繞過受損的視網膜內層，直接將視蛋白轉入神經節細胞，但結果并不令人滿意。Thyagarajan等[44]將ChR2轉入rd1小鼠神經節細胞，雖然ChR2在40%的神經節細胞中表達，但轉入ChR2的小鼠視覺功能與未轉入小鼠相比并未提高。原因可能是未將生理情況下ON型和OFF型雙極細胞傳入的光信號區分開，而目前特異性地將視蛋白轉入ON型或OFF型的神經節細胞這一技術尚未成熟。視黑素的發現較好的解決了這一問題，將視黑素導入神經節細胞，可使神經節細胞獲得感光能力，使小鼠的視力得到恢復[45]。目前關于視黑素在光遺傳學技術中的研究僅限于小鼠，尚無在更高級動物中的實驗。也尚無對轉染后動物視覺的分辨率是否能恢復到正常水平進行研究。
光遺傳學技術的發展顯示了交叉學科研究的潛力與生命科學新研究方法的重要性，為眼科領域的研究打開了新的大門，為許多目前無法治愈的眼部疾病提供了新的思路，擁有巨大的應用前景。并且，光遺傳學技術還在不斷優化，光敏感度更高、更易被激發的新型視蛋白和具有更高轉染效率的病毒載體正不斷被研發。光遺傳學技術在時間和空間上的優越性使得該項技術在多種動物模型中廣泛應用，相信光遺傳學技術將會應用在更多眼科領域，并取得更多成果造福人類。