引用本文： 馮程程, 鄧愛軍, 孫艷, 劉菲. 骨髓間充質干細胞對視網膜脫離兔神經營養因子表達的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(2): 184-186. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.016 復制
視網膜脫離(RD)手術后解剖復位率已較既往明顯提高[1]。但手術后患者視功能的恢復仍不理想。研究發現，RD后光感受器細胞的不可逆損傷是導致視功能損失的主要原因[2]。骨髓間充質干細胞(BMSC)為一類應用廣泛的成體干細胞，在損傷修復或免疫調節中起著重要作用[3, 4]。神經營養因子堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)可參與視網膜損傷組織的修復、細胞誘導分化和神經保護作用[5, 6]，通過BMSC適當的刺激可增強其參與損傷組織的修復能力[7]。為進一步探討BMSC對RD后光感受器細胞不可逆損傷的修復作用，我們對RD兔模型視網膜下腔移植BMSC細胞懸液，觀察移植后RD兔視網膜組織中bFGF、BDNF、CNTF的表達變化。現將結果報道如下。
1 材料和方法
3月齡健康雌性白色家兔1只頸椎脫臼處死，無菌條件下取出雙側股骨。無菌手術剪剪開骨干，用培養基反復沖洗股骨的骨髓腔，將沖洗出的骨髓腔內容物離心，去上清液，加入含15%胎牛血清的Dubecoo改良Eagle培養基/F12培養液重懸細胞，吹打混勻、計數，以細胞密度1×106個/ml接種于25 cm2的培養瓶中為原代細胞，37℃、5%二氧化碳、飽和濕度下常規培養。細胞接種72 h后首次換液，去除非貼壁細胞。以后每48小時換液1次，細胞融合至80%～90%時進行傳代培養，其后隔天換液，至細胞融合至90%后，再次傳代，直至第3代。經鑒定第3代BMSC為95.6%用于后續實驗。
6月齡健康無眼疾成年雌性白色家兔60只，體重2500～3000 g。12 h光/暗循環飼養。采用隨機數字表法隨機將實驗動物分為正常對照組(A組)，RD+磷酸鹽緩沖液(PBS)注射組(B組)，RD+BMSC注射組(C組)，各組均為20只兔。選取右眼為實驗眼。B組、 C組兔肌肉注射0.15 ml/kg劑量的速眠新麻醉，10 μl微量注射器角膜緣后2 mm處垂直于眼球壁進針，眼科手術顯微鏡下在赤道部視網膜造孔建立 RD模型。建模后，B組兔視網膜下腔注入0.01 mmol/dl 的PBS溶液10 μl；C組兔視網膜下腔注入CM-Dil標記的BMSC PBS懸液10 μl，細胞濃度5×104/ml。注入后可見后極部視網膜灰白色隆起，直到赤道部。手術后給予氯霉素滴眼液滴眼，4次/d，連續3 d。A組兔不做任何處理。
手術后1、2、4周處死各組兔，摘除右眼。沿角膜緣剪除角膜組織，剔除晶狀體及玻璃體，垂直向后成十字形剪開眼球壁，解剖顯微鏡下小心分離視網膜與鞏膜，清掃視網膜表面色素組織后放入去RNA酶的凍存管中，-150℃冰箱中保存備用。
實時定量(RT)聚合酶鏈反應(PCR)檢測不同時間點各組兔視網膜組織中人bFGF、BDNF、CNTF mRNA的表達量。視網膜勻漿，按照酚-異硫氰酸胍(Trizol)RNA提取試劑盒抽提RNA，紫外分光光度計測量RNA純度及濃度。按逆轉錄試劑盒說明在20 μl體系中合成cDNA。bFGF、BDNF、CNTF引物序列由北京Invitrogen公司合成。bFGF，上游引物：TTCTT CCTGCGTATCCACCC，下游引物：CAGTCTTCCA TCTTCCTTCATAGC；BDNF，上游引物：TTAGC GAGTGGGTCACAGCGG，下游引物：CGAGTTCCA GTGCCTTTTGTCTATG；CNTF，上游引物：GAAC AAGAACATCAACCTGGACTC，下游引物：TGGTA AGCGAAGGCAGCAAC；β-肌動蛋白(β-actin)，上游引物：AGATCGTGCGGGACATCAAG,下游引物：CAG GAAGGAGGGCTGGAAGA。ABI7500型熒光定量PCR儀進行RT-PCR反應，20 μl PCR體系中含2倍mix10 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl。 擴增條件95℃ 30 s變性，95℃ 5 s，60℃，40 s，共45個循環。反應結束后，根據測得的樣品Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達值。以A組中3種因子mRNA的表達量為1，與B組、C組不同時間點3種因子的相對表達量進行比較。
根據相對定量方法，運用分析軟件獲得樣品的Ct值和相應的拷貝數。采用SPSS 17.0統計軟件對結果進行統計分析。所有計量數據采用均數±標準差(
2 結果
RT-PCR檢測結果顯示，1、2、4周時，C組兔視網膜組織中bFGF、 BDNF、CNTF mRNA相對表達量均高于A組、B組，差異有統計學意義(P＜0.001)；1周時，B組兔視網膜組織中bFGF、CNTF mRNA相對表達量高于A組，BDNF mRNA 相對表達量與C組基本相當；2周時，視網膜組織中bFGF、BDNF mRNA相對表達量低于A組，CNTF mRNA相對表達量高于A組；4周時，視網膜組織中bFGF、BDNF、CNTF mRNA相對表達量均低于A組(圖 1~3)。
圖1
各組不同時間點視網膜組織bFGF mRNA相對表達量
圖2
各組不同時間點視網膜組織BDNF mRNA相對表達量
圖3
各組不同時間點視網膜組織CNTF mRNA相對表達量
3 討論
研究表明BMSC在損傷修復或免疫調節中起著重要作用[3, 4]。神經營養因子作為維持神經細胞生存的基本營養物質，是保障神經元分化生長以及與其他細胞建立功能依賴的因子，也是神經元功能發育成熟的調控因子，具有神經營養活性[8]。神經營養因子bFGF、BDNF、CNTF可參與視網膜病變損傷組織的修復，細胞的誘導分化和神經的保護等而受到廣泛關注[5, 6]。這些細胞因子通過BMSC適當的刺激可以增強其參與損傷組織的修復能力[7]。本研究結果發現，C組兔視網膜組織的神經營養因子分泌量明顯高于A組和B組。其結果表明移植入體內的BMSC能夠增加神經營養因子的釋放，對受損組織起到的促進修復的作用。
本研究結果顯示，B組兔視網膜組織中bFGF、CNTF mRNA相對表達量1周時均較A組升高，其后逐漸減少至低于A組，兩組間BDNF mRNA的相對表達量基本相當。我們推測可能的原因是，早期視網膜因受損傷的刺激，自身的神經細胞分泌神經營養因子，延緩損傷的視細胞凋亡，改善視網膜功能；隨損傷時間延長，在未進行相應干預情況下，凋亡的細胞越來越多，其分泌的神經營養因子逐漸減少，直至低于正常時的分泌量。B組在損傷視網膜分泌的神經營養因子基礎上，同時還存在移植的BMSC在視網膜組織內存活后分泌的部分神經營養因子，因而呈現C組兔視網膜組織的神經營養因子分泌量明顯高于A組、B組，并在各個相同的時間點時各神經營養因子的相對表達量均高于B組。
本研究結果證實了BMSC在RD兔眼中能夠促進有利于視網膜功能恢復的神經營養因子的釋放。但是由于實驗條件所限，未能對模型進行眼底照相、光相干斷層掃描檢查加以驗證。此外，該神經營養因子的來源、BMSC促進RD恢復機制，以及植入的BMSC在眼內是否能夠分化為視網膜細胞尚需進行深入的研究。
視網膜脫離(RD)手術后解剖復位率已較既往明顯提高[1]。但手術后患者視功能的恢復仍不理想。研究發現，RD后光感受器細胞的不可逆損傷是導致視功能損失的主要原因[2]。骨髓間充質干細胞(BMSC)為一類應用廣泛的成體干細胞，在損傷修復或免疫調節中起著重要作用[3, 4]。神經營養因子堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)可參與視網膜損傷組織的修復、細胞誘導分化和神經保護作用[5, 6]，通過BMSC適當的刺激可增強其參與損傷組織的修復能力[7]。為進一步探討BMSC對RD后光感受器細胞不可逆損傷的修復作用，我們對RD兔模型視網膜下腔移植BMSC細胞懸液，觀察移植后RD兔視網膜組織中bFGF、BDNF、CNTF的表達變化。現將結果報道如下。
1 材料和方法
3月齡健康雌性白色家兔1只頸椎脫臼處死，無菌條件下取出雙側股骨。無菌手術剪剪開骨干，用培養基反復沖洗股骨的骨髓腔，將沖洗出的骨髓腔內容物離心，去上清液，加入含15%胎牛血清的Dubecoo改良Eagle培養基/F12培養液重懸細胞，吹打混勻、計數，以細胞密度1×106個/ml接種于25 cm2的培養瓶中為原代細胞，37℃、5%二氧化碳、飽和濕度下常規培養。細胞接種72 h后首次換液，去除非貼壁細胞。以后每48小時換液1次，細胞融合至80%～90%時進行傳代培養，其后隔天換液，至細胞融合至90%后，再次傳代，直至第3代。經鑒定第3代BMSC為95.6%用于后續實驗。
6月齡健康無眼疾成年雌性白色家兔60只，體重2500～3000 g。12 h光/暗循環飼養。采用隨機數字表法隨機將實驗動物分為正常對照組(A組)，RD+磷酸鹽緩沖液(PBS)注射組(B組)，RD+BMSC注射組(C組)，各組均為20只兔。選取右眼為實驗眼。B組、 C組兔肌肉注射0.15 ml/kg劑量的速眠新麻醉，10 μl微量注射器角膜緣后2 mm處垂直于眼球壁進針，眼科手術顯微鏡下在赤道部視網膜造孔建立 RD模型。建模后，B組兔視網膜下腔注入0.01 mmol/dl 的PBS溶液10 μl；C組兔視網膜下腔注入CM-Dil標記的BMSC PBS懸液10 μl，細胞濃度5×104/ml。注入后可見后極部視網膜灰白色隆起，直到赤道部。手術后給予氯霉素滴眼液滴眼，4次/d，連續3 d。A組兔不做任何處理。
手術后1、2、4周處死各組兔，摘除右眼。沿角膜緣剪除角膜組織，剔除晶狀體及玻璃體，垂直向后成十字形剪開眼球壁，解剖顯微鏡下小心分離視網膜與鞏膜，清掃視網膜表面色素組織后放入去RNA酶的凍存管中，-150℃冰箱中保存備用。
實時定量(RT)聚合酶鏈反應(PCR)檢測不同時間點各組兔視網膜組織中人bFGF、BDNF、CNTF mRNA的表達量。視網膜勻漿，按照酚-異硫氰酸胍(Trizol)RNA提取試劑盒抽提RNA，紫外分光光度計測量RNA純度及濃度。按逆轉錄試劑盒說明在20 μl體系中合成cDNA。bFGF、BDNF、CNTF引物序列由北京Invitrogen公司合成。bFGF，上游引物：TTCTT CCTGCGTATCCACCC，下游引物：CAGTCTTCCA TCTTCCTTCATAGC；BDNF，上游引物：TTAGC GAGTGGGTCACAGCGG，下游引物：CGAGTTCCA GTGCCTTTTGTCTATG；CNTF，上游引物：GAAC AAGAACATCAACCTGGACTC，下游引物：TGGTA AGCGAAGGCAGCAAC；β-肌動蛋白(β-actin)，上游引物：AGATCGTGCGGGACATCAAG,下游引物：CAG GAAGGAGGGCTGGAAGA。ABI7500型熒光定量PCR儀進行RT-PCR反應，20 μl PCR體系中含2倍mix10 μl，cDNA 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl。 擴增條件95℃ 30 s變性，95℃ 5 s，60℃，40 s，共45個循環。反應結束后，根據測得的樣品Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達值。以A組中3種因子mRNA的表達量為1，與B組、C組不同時間點3種因子的相對表達量進行比較。
根據相對定量方法，運用分析軟件獲得樣品的Ct值和相應的拷貝數。采用SPSS 17.0統計軟件對結果進行統計分析。所有計量數據采用均數±標準差(
2 結果
RT-PCR檢測結果顯示，1、2、4周時，C組兔視網膜組織中bFGF、 BDNF、CNTF mRNA相對表達量均高于A組、B組，差異有統計學意義(P＜0.001)；1周時，B組兔視網膜組織中bFGF、CNTF mRNA相對表達量高于A組，BDNF mRNA 相對表達量與C組基本相當；2周時，視網膜組織中bFGF、BDNF mRNA相對表達量低于A組，CNTF mRNA相對表達量高于A組；4周時，視網膜組織中bFGF、BDNF、CNTF mRNA相對表達量均低于A組(圖 1~3)。
圖1
各組不同時間點視網膜組織bFGF mRNA相對表達量
圖2
各組不同時間點視網膜組織BDNF mRNA相對表達量
圖3
各組不同時間點視網膜組織CNTF mRNA相對表達量
3 討論
研究表明BMSC在損傷修復或免疫調節中起著重要作用[3, 4]。神經營養因子作為維持神經細胞生存的基本營養物質，是保障神經元分化生長以及與其他細胞建立功能依賴的因子，也是神經元功能發育成熟的調控因子，具有神經營養活性[8]。神經營養因子bFGF、BDNF、CNTF可參與視網膜病變損傷組織的修復，細胞的誘導分化和神經的保護等而受到廣泛關注[5, 6]。這些細胞因子通過BMSC適當的刺激可以增強其參與損傷組織的修復能力[7]。本研究結果發現，C組兔視網膜組織的神經營養因子分泌量明顯高于A組和B組。其結果表明移植入體內的BMSC能夠增加神經營養因子的釋放，對受損組織起到的促進修復的作用。
本研究結果顯示，B組兔視網膜組織中bFGF、CNTF mRNA相對表達量1周時均較A組升高，其后逐漸減少至低于A組，兩組間BDNF mRNA的相對表達量基本相當。我們推測可能的原因是，早期視網膜因受損傷的刺激，自身的神經細胞分泌神經營養因子，延緩損傷的視細胞凋亡，改善視網膜功能；隨損傷時間延長，在未進行相應干預情況下，凋亡的細胞越來越多，其分泌的神經營養因子逐漸減少，直至低于正常時的分泌量。B組在損傷視網膜分泌的神經營養因子基礎上，同時還存在移植的BMSC在視網膜組織內存活后分泌的部分神經營養因子，因而呈現C組兔視網膜組織的神經營養因子分泌量明顯高于A組、B組，并在各個相同的時間點時各神經營養因子的相對表達量均高于B組。
本研究結果證實了BMSC在RD兔眼中能夠促進有利于視網膜功能恢復的神經營養因子的釋放。但是由于實驗條件所限，未能對模型進行眼底照相、光相干斷層掃描檢查加以驗證。此外，該神經營養因子的來源、BMSC促進RD恢復機制，以及植入的BMSC在眼內是否能夠分化為視網膜細胞尚需進行深入的研究。
