引用本文： 毛菲菲, 孫揮宇, 李丹, 王勝男, 柳月紅, 許雪靜, 劉彬彬, 董瑜. 獲得性免疫缺陷綜合征患者前房水巨細胞病毒聚合酶鏈反應檢測. 中華眼底病雜志, 2015, 31(6): 564-566. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.06.013 復制
巨細胞病毒性視網膜炎(CMVR)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者最常見的眼部并發癥，目前常由臨床醫生根據患者眼底特征做出臨床診斷。但CMVR患者眼部表現復雜多樣，且與急性視網膜壞死、弓形體病視網膜炎、結核性視網膜脈絡膜病變及視網膜血管炎表現相似，僅靠眼底檢查難以鑒別，容易誤診；依賴于對治療后反應判斷的診斷方式，又極有可能延誤患者早期正確治療，造成不可逆的視力損傷及不必要的藥物不良反應。探尋一種簡單可靠的檢測方式以盡早明確診斷CMVR有著重要的臨床意義。國外已有研究表明，眼內液巨細胞病毒(CMV)聚合酶鏈反應(PCR)檢測具有較高的敏感性和特異性[1]。為進一步驗證該檢測方法的可行性，我們采用PCR檢測了AIDS患者前房水中CMV DNA的含量，現將結果報道如下。
1 對象和方法
2014年4月至2015年4月在首都醫科大學附屬北京地壇醫院確診為AIDS并行前房穿刺的25例患者納入本研究。其中，男性21例，女性4例。年齡24~59歲，平均年齡(39.2±9.3)歲。CD4+T淋巴細胞1~523個/μl，中位數40個/μl。其中，＜50個/μl 16例，占64.0%；50~200個/μl 7例，占28.0%；＞200個/μl 2例，占8.0%。發現人類免疫缺陷病毒(HIV)時間15 d~9年，中位數10個月。所有患者均符合AIDS的診斷標準[2]。
所有患者均行散瞳間接檢眼鏡及眼底彩色照相檢查。眼底后極部大量黃白色視網膜病灶，伴有視網膜出血，呈奶油番茄醬樣；中周部視網膜白色或黃白色片狀或簇狀滲出病灶，活動邊緣呈顆粒狀，伴或不伴視網膜出血；或出現霜枝樣視網膜血管炎等特殊類型病變，伴或不伴CMV抗原血癥和(或)CMV特異性IgM抗體陽性為CMVR的診斷標準[3]。根據眼底病變及治療情況將患者分為3組。CMVR未治療組：眼底存在CMVR病變，未經任何全身抗CMV治療；共10例。CMVR治療組：眼底存在CMVR病變(圖 1)，已經膦甲酸鈉或更昔洛韋抗CMV全身治療(圖 2)；共7例。對照組：眼底未見視網膜病變或僅表現為視網膜微血管病變，并由經驗豐富的眼科醫師排除CMVR；共8例，其中4例合并全身其他部位CMV感染。
圖1
CMVR治療組患者左眼彩色眼底像。視盤下方及黃斑顳側可見大量黃白色視網膜病灶，伴有視網膜出血，呈奶油番茄醬樣?圖 2圖 1同眼治療后彩色眼底像。原病灶瘢痕局限，血管部分閉塞
所有患者均予氧氟沙星滴眼液點眼2~3 d后，在手術室內手術顯微鏡下完成前房穿刺，抽取房水100 μl，-20℃保存待測。選取人CMV株-AD169基因組中編碼即刻早期轉錄調節蛋白的IE1基因一高度保守的非編碼區為擴增靶區域，設計特異性引物及熒光探針。擴增片段長度為86堿基對(bp)。采用實時熒光定量PCR技術，定量檢測房水樣本中CMV DNA的含量。以CMVR未治療組、CMVR治療組患者中檢測出的陽性比例為PCR敏感性；對照組患者中檢測出的陰性比例為PCR特異性。
2 結果
CMVR未治療組10例患者中，無癥狀1例，在體檢時發現；眼前黑影2例；視物模糊7例。出現癥狀時間10 d~2個月。眼底檢查發現，無癥狀的1例患者右眼見小于1/2個視盤直徑(DD)的白色病灶，邊界模糊，伴少量衛星灶；右眼玻璃體明顯混濁，雙眼視盤邊界不清、視網膜血管呈霜枝樣改變，右眼各象限及左眼上方可見大片狀黃白色病灶及出血1例；雙眼大量黃色病灶伴出血2例；單眼黃色病灶伴出血6例。PCR檢測結果顯示，CMV DNA陽性9例，陰性1例；敏感性為90.0%。9例CMV DNA陽性患者CMV DNA含量為3.72×103~4.81×105 copies/ml，平均CMV DNA含量為(1.55±1.63)×105 copies/ml。其中，4例患者于治療1個月后再次復測CMV DNA，1例患者CMV DNA含量由1.93×105 copies/ml減少至1.33×104 copies/ml，其余3例均轉為陰性。CMV DNA陰性的1例患者，右眼顳下方可見小于1/2 DD的白色病灶，發現病灶后給予膦甲酸鈉治療20 d后自行停藥；停藥1個月后再次復發，病灶在原位較前明顯擴大，CMV DNA轉為陽性。
CMVR治療組7例患者中，無癥狀2例，在體檢時發現；眼前黑影1例；視物模糊4例。出現癥狀時間2個月~3年。眼底檢查發現，表現為瘢痕樣陳舊性CMVR 3例；病灶局限但存在出血及黃色滲出1例；大量黃色病灶伴出血3例。PCR檢測結果顯示，CMV DNA陽性3例，陰性4例；敏感性為42.9%。3例CMV DNA陽性患者平均CMV DNA含量為(4.92±4.78)×103 copies/ml。眼底表現為瘢痕樣陳舊性CMVR的3例患者CMV DNA均為陰性。其中，2例患者治療已超過1年余，并已停藥；1例患者治療10個月，仍在治療中。眼底表現為病灶局限但存在出血及黃色滲出的1例患者，CMV DNA為陰性，已治療52 d。眼底表現為大量黃色病灶伴出血的3例患者，CMV DNA為陽性；CMV DNA含量分別為1.17×103、1.03×104、3.28×103 copies/ml。CMV DNA含量為3.28×103 copies/ml的患者治療20 d后復診，CMV DNA含量減至7.67×102 copies/ml，未完全轉陰。
對照組8例患者中，眼底無異常表現5例，表現為以棉絨斑或淺層視網膜出血的HIV視網膜病變3例。眼底無異常表現的5例患者中，合并肺部或食管的CMV感染4例。PCR檢測結果顯示，所有患者CMV DNA均為陰性，特異性超過99.9%。
25例患者中，除1例患者結膜下出血外，其余患者均未發生與前房穿刺相關的并發癥。
3 討論
PCR是一項較為常規且有效的檢測手段，具有快速和標本需要量小等優點。我們利用PCR檢測了3組患者房水中CMV DNA的含量。結果顯示，CMVR未治療組10例患者中，9例患者CMV DNA陽性，敏感性高達90.0%。說明對于未經治療的AIDS患者，CMV PCR敏感性較高。另1例患者CMV DNA陰性，其眼底病灶小于1 DD。我們分析認為，這或許是因為病例數太少，有存在假陰性結果的可能。除此之外，也可能是因為CMVR病灶較小，不足以釋放出可以被PCR檢測到的DNA至眼內。對于這類患者，臨床應密切隨訪觀察其變化。CMVR治療組7例患者中，3例患者CMV DNA陽性，敏感性為42.9%；眼底表現為瘢痕樣陳舊性病灶的3例患者，CMV DNA均為陰性。提示瘢痕病灶中可能無法檢測到CMV。我們還發現，治療20 d的患者仍可檢測到CMV，而治療52 d的患者無法檢測到CMV。說明治療一定時間后眼內的CMV DNA會逐漸轉陰。2例自行停藥后復發的患者均可以檢測到CMV DNA。提示CMV的治療需要延續一定時間，且停藥前需要經過眼內PCR檢測以判斷CMV DNA是否為陰性。對照組8例患者CMV DNA均為陰性。說明PCR檢查的特異性超過99.9%。提示即便CMV DNA為陰性，也不能完全排除CMV的感染。但由于PCR有較高的特異性，如檢測出CMV DNA為陽性便有著非常重要的意義。有學者指出因PCR具有高度的敏感性，所以其局限性是可能出現假陽性[4]。但本組患者中，無1例假陽性結果出現。我們分析這可能與標本正確保存及操作，避免污染有關；但也可能是因為本研究樣本量較小，尚不足以全面反映PCR檢測的特異性。
經治療后患者CMV DNA含量明顯減少或消失，提示適當治療可控制CMV復制，減少眼內CMV含量。Fenner等[5]提出，PCR可用于監測指導長期抗病毒治療。需要比較治療前后前房水CMV病毒載量的變化情況來評估治療效果以進一步指導臨床治療。對于未經治療的CMVR患者，因PCR具有較高的特異性和敏感性，所以可以作為診斷的可靠方法。對于治療后的患者，PCR可以指導臨床用藥。
Pathanapitoon等[6]用結膜刮片方法來診斷CMVR，結果發現其敏感性僅為12%。表明結膜刮片不適合用于診斷CMVR。玻璃體腔的病毒濃度高于前房水[1]，但玻璃體腔取標本創傷及感染風險較大。而前房穿刺和玻璃體腔穿刺有相同的敏感性[7, 8]。盡管其也有一定的創傷性，但本組患者除1例結膜下出血外沒有出現任何其他并發癥，說明其安全性較高。
本研究結果表明，前房水PCR檢測CMV DNA具有較高的敏感性、特異性且安全可靠，可以作為CMVR病原學診斷依據。對于眼底表現不典型、特別是未經治療的AIDS患者能夠起到明確診斷，指導治療的作用。同時還可以用于CMVR治療效果的評估。但受樣本量限制，關于前房水CMV PCR檢測的確切敏感性、特異性以及穿刺后感染率等安全性還需更大樣本量的研究來探討。
巨細胞病毒性視網膜炎(CMVR)是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者最常見的眼部并發癥，目前常由臨床醫生根據患者眼底特征做出臨床診斷。但CMVR患者眼部表現復雜多樣，且與急性視網膜壞死、弓形體病視網膜炎、結核性視網膜脈絡膜病變及視網膜血管炎表現相似，僅靠眼底檢查難以鑒別，容易誤診；依賴于對治療后反應判斷的診斷方式，又極有可能延誤患者早期正確治療，造成不可逆的視力損傷及不必要的藥物不良反應。探尋一種簡單可靠的檢測方式以盡早明確診斷CMVR有著重要的臨床意義。國外已有研究表明，眼內液巨細胞病毒(CMV)聚合酶鏈反應(PCR)檢測具有較高的敏感性和特異性[1]。為進一步驗證該檢測方法的可行性，我們采用PCR檢測了AIDS患者前房水中CMV DNA的含量，現將結果報道如下。
1 對象和方法
2014年4月至2015年4月在首都醫科大學附屬北京地壇醫院確診為AIDS并行前房穿刺的25例患者納入本研究。其中，男性21例，女性4例。年齡24~59歲，平均年齡(39.2±9.3)歲。CD4+T淋巴細胞1~523個/μl，中位數40個/μl。其中，＜50個/μl 16例，占64.0%；50~200個/μl 7例，占28.0%；＞200個/μl 2例，占8.0%。發現人類免疫缺陷病毒(HIV)時間15 d~9年，中位數10個月。所有患者均符合AIDS的診斷標準[2]。
所有患者均行散瞳間接檢眼鏡及眼底彩色照相檢查。眼底后極部大量黃白色視網膜病灶，伴有視網膜出血，呈奶油番茄醬樣；中周部視網膜白色或黃白色片狀或簇狀滲出病灶，活動邊緣呈顆粒狀，伴或不伴視網膜出血；或出現霜枝樣視網膜血管炎等特殊類型病變，伴或不伴CMV抗原血癥和(或)CMV特異性IgM抗體陽性為CMVR的診斷標準[3]。根據眼底病變及治療情況將患者分為3組。CMVR未治療組：眼底存在CMVR病變，未經任何全身抗CMV治療；共10例。CMVR治療組：眼底存在CMVR病變(圖 1)，已經膦甲酸鈉或更昔洛韋抗CMV全身治療(圖 2)；共7例。對照組：眼底未見視網膜病變或僅表現為視網膜微血管病變，并由經驗豐富的眼科醫師排除CMVR；共8例，其中4例合并全身其他部位CMV感染。
圖1
CMVR治療組患者左眼彩色眼底像。視盤下方及黃斑顳側可見大量黃白色視網膜病灶，伴有視網膜出血，呈奶油番茄醬樣?圖 2圖 1同眼治療后彩色眼底像。原病灶瘢痕局限，血管部分閉塞
所有患者均予氧氟沙星滴眼液點眼2~3 d后，在手術室內手術顯微鏡下完成前房穿刺，抽取房水100 μl，-20℃保存待測。選取人CMV株-AD169基因組中編碼即刻早期轉錄調節蛋白的IE1基因一高度保守的非編碼區為擴增靶區域，設計特異性引物及熒光探針。擴增片段長度為86堿基對(bp)。采用實時熒光定量PCR技術，定量檢測房水樣本中CMV DNA的含量。以CMVR未治療組、CMVR治療組患者中檢測出的陽性比例為PCR敏感性；對照組患者中檢測出的陰性比例為PCR特異性。
2 結果
CMVR未治療組10例患者中，無癥狀1例，在體檢時發現；眼前黑影2例；視物模糊7例。出現癥狀時間10 d~2個月。眼底檢查發現，無癥狀的1例患者右眼見小于1/2個視盤直徑(DD)的白色病灶，邊界模糊，伴少量衛星灶；右眼玻璃體明顯混濁，雙眼視盤邊界不清、視網膜血管呈霜枝樣改變，右眼各象限及左眼上方可見大片狀黃白色病灶及出血1例；雙眼大量黃色病灶伴出血2例；單眼黃色病灶伴出血6例。PCR檢測結果顯示，CMV DNA陽性9例，陰性1例；敏感性為90.0%。9例CMV DNA陽性患者CMV DNA含量為3.72×103~4.81×105 copies/ml，平均CMV DNA含量為(1.55±1.63)×105 copies/ml。其中，4例患者于治療1個月后再次復測CMV DNA，1例患者CMV DNA含量由1.93×105 copies/ml減少至1.33×104 copies/ml，其余3例均轉為陰性。CMV DNA陰性的1例患者，右眼顳下方可見小于1/2 DD的白色病灶，發現病灶后給予膦甲酸鈉治療20 d后自行停藥；停藥1個月后再次復發，病灶在原位較前明顯擴大，CMV DNA轉為陽性。
CMVR治療組7例患者中，無癥狀2例，在體檢時發現；眼前黑影1例；視物模糊4例。出現癥狀時間2個月~3年。眼底檢查發現，表現為瘢痕樣陳舊性CMVR 3例；病灶局限但存在出血及黃色滲出1例；大量黃色病灶伴出血3例。PCR檢測結果顯示，CMV DNA陽性3例，陰性4例；敏感性為42.9%。3例CMV DNA陽性患者平均CMV DNA含量為(4.92±4.78)×103 copies/ml。眼底表現為瘢痕樣陳舊性CMVR的3例患者CMV DNA均為陰性。其中，2例患者治療已超過1年余，并已停藥；1例患者治療10個月，仍在治療中。眼底表現為病灶局限但存在出血及黃色滲出的1例患者，CMV DNA為陰性，已治療52 d。眼底表現為大量黃色病灶伴出血的3例患者，CMV DNA為陽性；CMV DNA含量分別為1.17×103、1.03×104、3.28×103 copies/ml。CMV DNA含量為3.28×103 copies/ml的患者治療20 d后復診，CMV DNA含量減至7.67×102 copies/ml，未完全轉陰。
對照組8例患者中，眼底無異常表現5例，表現為以棉絨斑或淺層視網膜出血的HIV視網膜病變3例。眼底無異常表現的5例患者中，合并肺部或食管的CMV感染4例。PCR檢測結果顯示，所有患者CMV DNA均為陰性，特異性超過99.9%。
25例患者中，除1例患者結膜下出血外，其余患者均未發生與前房穿刺相關的并發癥。
3 討論
PCR是一項較為常規且有效的檢測手段，具有快速和標本需要量小等優點。我們利用PCR檢測了3組患者房水中CMV DNA的含量。結果顯示，CMVR未治療組10例患者中，9例患者CMV DNA陽性，敏感性高達90.0%。說明對于未經治療的AIDS患者，CMV PCR敏感性較高。另1例患者CMV DNA陰性，其眼底病灶小于1 DD。我們分析認為，這或許是因為病例數太少，有存在假陰性結果的可能。除此之外，也可能是因為CMVR病灶較小，不足以釋放出可以被PCR檢測到的DNA至眼內。對于這類患者，臨床應密切隨訪觀察其變化。CMVR治療組7例患者中，3例患者CMV DNA陽性，敏感性為42.9%；眼底表現為瘢痕樣陳舊性病灶的3例患者，CMV DNA均為陰性。提示瘢痕病灶中可能無法檢測到CMV。我們還發現，治療20 d的患者仍可檢測到CMV，而治療52 d的患者無法檢測到CMV。說明治療一定時間后眼內的CMV DNA會逐漸轉陰。2例自行停藥后復發的患者均可以檢測到CMV DNA。提示CMV的治療需要延續一定時間，且停藥前需要經過眼內PCR檢測以判斷CMV DNA是否為陰性。對照組8例患者CMV DNA均為陰性。說明PCR檢查的特異性超過99.9%。提示即便CMV DNA為陰性，也不能完全排除CMV的感染。但由于PCR有較高的特異性，如檢測出CMV DNA為陽性便有著非常重要的意義。有學者指出因PCR具有高度的敏感性，所以其局限性是可能出現假陽性[4]。但本組患者中，無1例假陽性結果出現。我們分析這可能與標本正確保存及操作，避免污染有關；但也可能是因為本研究樣本量較小，尚不足以全面反映PCR檢測的特異性。
經治療后患者CMV DNA含量明顯減少或消失，提示適當治療可控制CMV復制，減少眼內CMV含量。Fenner等[5]提出，PCR可用于監測指導長期抗病毒治療。需要比較治療前后前房水CMV病毒載量的變化情況來評估治療效果以進一步指導臨床治療。對于未經治療的CMVR患者，因PCR具有較高的特異性和敏感性，所以可以作為診斷的可靠方法。對于治療后的患者，PCR可以指導臨床用藥。
Pathanapitoon等[6]用結膜刮片方法來診斷CMVR，結果發現其敏感性僅為12%。表明結膜刮片不適合用于診斷CMVR。玻璃體腔的病毒濃度高于前房水[1]，但玻璃體腔取標本創傷及感染風險較大。而前房穿刺和玻璃體腔穿刺有相同的敏感性[7, 8]。盡管其也有一定的創傷性，但本組患者除1例結膜下出血外沒有出現任何其他并發癥，說明其安全性較高。
本研究結果表明，前房水PCR檢測CMV DNA具有較高的敏感性、特異性且安全可靠，可以作為CMVR病原學診斷依據。對于眼底表現不典型、特別是未經治療的AIDS患者能夠起到明確診斷，指導治療的作用。同時還可以用于CMVR治療效果的評估。但受樣本量限制，關于前房水CMV PCR檢測的確切敏感性、特異性以及穿刺后感染率等安全性還需更大樣本量的研究來探討。
