腺病毒介導Tum5重組基因對高糖刺激下恒河猴視網膜血管內皮細胞增生、遷移及管腔形成的影響_《中華眼底病雜志》

作者：

楊偉 , 張琰 , 孫靖 , 韓倩 , 賈育蓉 ,  張紅

300384 天津醫科大學眼科醫院天津醫科大學眼科研究所天津醫科大學眼視光學院;

關鍵詞：

內皮細胞/病理學細胞增殖/藥物作用細胞遷移抑制/藥物作用基因轉移技術轉染動物實驗

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.05.014

視頻：

導出 下載 收藏 掃碼 引用

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的觀察腺病毒介導Tum5重組基因對高糖刺激下恒河猴視網膜血管內皮細胞(RF/6A細胞)增生、遷移及管腔形成的影響。方法構建空載體病毒rAd-綠色熒光蛋白(GFP)和攜帶Tum5基因的重組腺病毒表達載體(rAd-Tum5)。分別感染RF/6A細胞, 流式細胞儀檢測感染效率。細胞感染48 h后, 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Tum5重組基因體外表達。將RF/6A細胞分為正常對照組、高糖刺激對照組(HG組), 空載體對照組(HG+rAd-GFP組), Tum5基因組(HG+rAd-Tum5組)。采用細胞計數試劑盒(CCK-8)、侵襲小室(Transwell)實驗及基質膠(Matrigel)實驗分析Tum5重組基因對高糖刺激下RF/6A細胞增生、遷移及管腔形成的影響。結果流式細胞儀檢測結果顯示, rAd-GFP、rAd-Tum5感染細胞的效率分別為55.13%、50.31%。Western blot檢測結果顯示, HG+rAd-Tum5組在相對分子質量14×10³左右處可見Tum5蛋白表達條帶；正常對照組、HG組、HG+rAd-GFP組均未見Tum5蛋白表達條帶。CCK-8、Transwell實驗及Matrigel實驗結果顯示, 正常組、HG組、HG+rAd-GFP組、HG+rAd-Tum5組4組間細胞增生數量、遷移數量及成形管腔數量比較, 差異均有統計學意義(F=44.484、772.666、137.696, P＜0.05)。組間細胞增生數量、遷移數量及成形管腔數量兩兩比較結果顯示, HG組較正常對照組增加, 差異有統計學意義(P＜0.05)；HG組與HG+rAd-Tum5組之間無明顯差異(P＞0.05)；HG+rAd-Tum5組較HG組、HG+rAd-GFP組明顯減少, 差異有統計學意義(P＜0.05)。結論腺病毒介導Tum5重組基因可抑制高糖刺激下RF/6A細胞的增生、遷移及管腔形成。

引用本文： 楊偉, 張琰, 孫靖, 韓倩, 賈育蓉, 張紅. 腺病毒介導Tum5重組基因對高糖刺激下恒河猴視網膜血管內皮細胞增生、遷移及管腔形成的影響. 中華眼底病雜志, 2015, 31(5): 467-471. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.05.014 復制

腫瘤抑素(Tumstatin)是來源于人基膜的內源性血管抑制因子^{[1, 2]}。全長腫瘤抑素通過抑制血管內皮細胞蛋白合成、促進血管內皮細胞凋亡，發揮抑制新生血管形成的作用^[3]。但由于全長腫瘤抑素包含了自身免疫病Goodpasture綜合征的致病抗原Ⅳ型膠原蛋白3鏈NC1結構域，有誘發此病的風險^[4]。而位于腫瘤抑素第54～132位序列的Tum5片段是腫瘤抑素抗血管生成的活性片段，與全長腫瘤抑素有著等效的抗血管生成活性，且不包含潛在致病性抗原^[5]。基因治療可以將外源性具有較強治療作用的基因片段導入眼內，使其在眼內表達治療基因產物，以達到持久而高效地治療眼內疾病的目的。腺病毒載體擁有裝載外源基因片段容量大、感染能力強、表達效率高、安全性高等優點，作為基因載體已被廣泛的應用于基礎及臨床研究^[6-10]。本研究以腺病毒為載體，將重組的Tum5基因感染至高糖狀態下的恒河猴視網膜血管內皮細胞(RF/6A細胞)，觀察Tum5肽對高糖狀態下RF/6A細胞增生、移行及管腔形成的影響。現將結果報道如下。

1 材料和方法

RF/6A細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。用含10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素、鏈霉素混合液和1‰谷氨酰胺的RPMI 1640培養基，常規培養細胞。FBS(德國PAN公司)，RPMI 1640培養液(美國HyClone公司)，RNA提取試劑盒(GeneJET RNA Purification Kit，美國Thermo公司)、定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)，50%葡萄糖注射液(中國大冢制藥有限公司)，細胞計數試劑盒(CCK-8，日本Dojindo公司)，細胞裂解液、蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(中國康為世紀公司)，血球凝集素(HA-tag)單克隆抗體(美國Sigma公司)，羊抗兔二抗、β-微管蛋白(β-tubulin)抗體(美國Abcom公司)，基質膠(Matrigel，美國BD公司)，侵襲小室(Transwell)細胞培養板(美國Corning公司)。重組Tum5質粒構建在天津醫科大學第二醫院完成。腺病毒包裝和純化由上海漢恒科技生物公司協助完成。

構建攜帶綠色熒光蛋白的對照空載體病毒(rAd-GFP)和攜帶Tum5基因的重組腺病毒表達載體(rAd-Tum5)。將帶有HA-Tag及分泌型熒光素酶(Gluc)信號肽的原重組Tum5質粒載體(pCMV-Tum5-MCS)進行腺病毒載體構建和包裝(5型腺病毒)。以BamHⅠ、EcoRⅠ為插入位點，從原質粒中酶切含有HA-tag和Gluc信號肽的Tum5基因序列并連接到腺病毒載體中，得到重組Tum5腺病毒過表達載體質粒(pHBAd-MCMV-Tum5-GFP)。將其與腺病毒Admax大骨架(pHBAd-BHG)共同轉染人胚腎細胞(293A細胞)進行病毒擴增，以獲得第3代rAd-GFP和rAd-Tum5。

應用rAd-GFP、rAd-Tum5分別感染RF/6A細胞。常規培養RF/6A細胞，消化離心去上清，用RPMI 1640培養液重懸，調整細胞密度至4×10⁵個/ml。rAd-GFP、rAd-Tum5各設3個復孔，終體積2 ml，接種至6孔板。培養24 h后按1×10¹⁰個/ml加入腺病毒20μl，2 h后換液。于感染36 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，并通過流式細胞儀檢測感染效率。

細胞分成正常對照組、高糖刺激對照組(HG組)、空載體對照組(HG+rAd-GFP組)、Tum5基因組(HG+rAd-Tum5組)，接種于6孔板。rAd-GFP、rAd-Tum5分別感染HG+rAd-GFP組、HG +rAd-Tum5組細胞，正常對照組與HG組不處理。24 h后HG組、HG +rAd-GFP組、HG +rAd-Tum5組換用含葡萄糖33 mmol/L、1% FBS的RPMI 1640培養基培養細胞，正常組用含1% FBS的RPMI 1640培養基培養細胞。

采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Tum5重組基因體外表達。24 h后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各組取30μg蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉。以β-tubulin為內參抗體，抗HA-Tag一抗4℃孵育過夜，洗膜緩沖液(TBST)洗膜，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，顯影定影。

采用CCK-8分析Tum5重組基因對高糖刺激下RF/6A細胞增生的抑制作用。細胞轉染24 h后消化細胞并接種于96孔板，8000個/孔，各組按上述條件繼續培養。48 h后每孔加入CCK-8液10μl，分別在37℃孵箱孵育1、2、3 h后，酶標儀檢測450 nm的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。根據標準曲線計算各組細胞數量。

采用Transwell實驗分析Tum5重組基因對高糖刺激下RF/6A細胞遷移的影響。細胞接種于6孔板培養24 h后分別進行病毒感染，24 h后換用高糖培養液刺激細胞。培養24 h后將刺激細胞以1×10⁵個/孔消化接種于Transwell上層小室中，均用含1% FBS的RPMI 1640培養基培養。HG組、HG+rAd-GFP組、HG+rAd-Tum5組下層放入高糖刺激液，正常對照組下層放入1% FBS培養基，繼續培養24 h后結晶紫染色，計數，拍照。

采用Metrigel實驗分析Tum5對高糖刺激下RF/6A細胞管腔形成的影響。細胞接種，感染病毒，并用高糖培養基刺激。刺激24 h后以5×10⁴個/孔將細胞接種于鋪有Metrigel的24孔板中，6~8 h后觀察管腔形成情況，并拍照。

采用SPSS 17.0統計軟件行統計學分析，計量數據以均數±標準差(x±s)表示。各組量化數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，各組間均數經Levene檢驗方差齊。組間差異比較采用單因素方差分析及事后Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

將pHBAd-MCMV-GFP、pHBAd-MCMV-Tum5-GFP分別與pHBAd-BHG腺病毒骨架質粒共同轉染293A細胞進行擴增，最終獲得第3代rAd-GFP與rAd-Tum5(圖 1)。

圖1 重組Tum5腺病毒表達載體。1A. Tum5的氨基酸序列(紅色)及其在全長腫瘤抑素中的位置(黑色)；1B. rAd-Tum5的結構示意圖qq

圖選項

1.	Maeshima Y, Manfredi M, Reimer C, et al. Identification of the anti-angiogenic site within vascular basement membrane-derived tumstatin[J]. J Biol Chem, 2001, 276(18):15240-15248.
2.	Maeshima Y. Extracellular matrix-derived peptide binds to alpha vbeta 3 integrin and inhibits angiogenesis[J]. J Biol Chem, 2001, 276(34):31959-31968.
3.	Maeshima Y, Sudhakar A, Lively JC, et al. Tumstatin, an endothelial cell-specific inhibitor of protein synthesis[J]. Science, 2002, 295(5552):140-143.
4.	Maeshima Y. Distinct antitumor properties of a typeⅣcollagen domain derived from basement membrane[J]. J Biol Chem, 2000, 275(28):21340-21348.
5.	Esipov R, Beyrakhova K, Likhvantseva V, et al. Antiangiogenic and antivascular effects of a recombinant tumstatin-derived peptide in a corneal neovascularization model[J]. Biochimie, 2012, 94(6):1368-1375.
6.	Ameri H, Liu H, Liu R, et al. TWEAK/Fn14 pathway is a novel mediator of retinal neovascularization[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014, 55(2):801-813.
7.	Li Z, He T, Du K, et al. Inhibition of oxygen-induced ischemic retinal neovascularization with adenoviral 15-lipoxygenase-1 gene transfer via up-regulation of PPAR-γand down-regulation of VEGFR-2 expression. PLoS One, 2014, 9(1):85824. http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0085824.
8.	Mcclements ME, Maclaren RE. Gene therapy for retinal disease[J]. Translational Research, 2013, 161(4):241-254.
9.	Ginn SL, Alexander IE, Edelstein ML, et al. Gene therapy clinical trials worldwide to 2012-an update[J]. J Gene Med, 2013, 15(2):65-77.
10.	Maclaren RE, Groppe M, Barnard AR, et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial[J]. Lancet, 2014, 383(9923):1129-1137.
11.	Tannous BA, Kim DE, Fernandez JL, et al. Codon-optimized gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo[J]. Mol Ther, 2005, 11(3):435-443.
12.	Wurdinger T, Badr C, Pike L, et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes[J]. Nat Methods, 2008, 5(2):171-173.
13.	You YJ, Xue XC, Li M, et al. Inhibition effect of pcDNA-tum-5 on the growth of S180 tumor[J]. Cytotechnology, 2008, 56(2):97-104.
14.	Zhang X, Xu WR, Qian H, et al. Mesenchymal stem cells modified to express lentivirus TNF-alpha Tumstatin(45-132) inhibit the growth of prostate cancer[J]. J Cell Mol Med, 2011, 15(2):433-444.

《中華眼底病雜志》

腺病毒介導Tum5重組基因對高糖刺激下恒河猴視網膜血管內皮細胞增生、遷移及管腔形成的影響

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料和方法

2 結果

3 討論

1 材料和方法

2 結果

3 討論

上一篇

下一篇

Format

Content

摘要全文圖表視頻參考文獻施引文獻補充材料