引用本文： 盧亞楠, 張東昌, 原莉莉. 熱休克蛋白47和轉化生長因子-β2在增生性玻璃體視網膜疾病患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中的表達. 中華眼底病雜志, 2015, 31(5): 462-466. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.05.013 復制
上皮細胞間質轉化及細胞外基質沉積是增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、增生型糖尿病視網膜病變(PDR)等增生性玻璃體視網膜疾病的主要病理特征[1, 2]。轉化生長因子(TGF)-β2在纖維化進程中發揮重要作用，刺激以膠原蛋白為主的細胞外基質成分的產生和合成[3, 4]。熱休克蛋白(HSP)47是一種膠原特異性分子伴侶，作為TGF-β2的下游分子，輔助前膠原蛋白折疊、裝配并分泌至細胞外，造成大量膠原蛋白在細胞外基質沉積。TGF-β2的促纖維化作用和HSP47促進細胞外基質沉積可能是多種纖維化疾病的重要病理過程[5-8]。為探討HSP47、TGF-β2在增生性玻璃體視網膜疾病中的作用，我們觀察了PVR、PDR患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2的表達。現將結果報道如下。
1 對象和方法
1.1 對象、標本采集及主要實驗儀器、試劑
2014年6月至2015年3月在山西省眼科醫院臨床確診為PVR的48例48只眼及PDR的50例50只眼納入本研究。參照1983年國際視網膜學會的PVR分級標準[9]對PVR患眼進行分級。PVR 48只眼中，C級40只眼；D級8只眼。參照1985年糖尿病視網膜病變分期標準[10]對PDR患眼進行分期。PDR 50只眼中，Ⅴ期28只眼，Ⅵ期22只眼。同時納入特發性黃斑裂孔(IMH)患者20例20只眼作為對照。排除伴有新生血管性青光眼、視網膜動靜脈阻塞、脈絡膜脫離、高度近視、眼外傷、惡性腫瘤、活動期免疫系統疾病及感染性炎癥等可能影響細胞因子水平的其他眼部疾病。3組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
所有患者均行常規23G玻璃體切割手術。打開灌注前，采用玻璃體切割頭抽取玻璃體組織0.5 ml，置于微量離心管中，－80℃凍存。手術中采用眼內鑷小心剝除PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織，－80℃凍存。
酶標儀(SPECTRA-Ⅲ型，美國Spectra Energy公司)、光學顯微鏡(Nikon2E800，日本尼康公司)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)儀(美國BioRad公司)。人HSP-47 ELISA試劑盒、人TGF-β2 ELISA試劑盒、小鼠抗人HSP47單克隆抗體、小鼠抗人TGF-β2單克隆抗體、小鼠抗人Ⅰ型膠原蛋白IgG抗體、小鼠抗人Ⅲ型膠原蛋白抗體、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(美國Abcam公司)。
1.2 ELISA檢測及蘇木精-伊紅(HE)、免疫組織化學染色
采用ELISA檢測所有患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2的表達。標準孔加標準液50μl；待測樣品孔加入樣品稀釋液40μl，再加入待測樣品10μl做好標記。加入酶標試劑50μl，空白孔除外。先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，37℃避光顯色15 min。加終止液50μl，終止反應。空白孔調零，測量各孔的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。以標準物濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度。
采用HE染色觀察PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織的病理特征。作常規石蠟組織切片，切片厚3μm。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，蘇木精染色1 min，鹽酸酒精分化，水洗后伊紅染色5 s，光學顯微鏡下觀察。
采用免疫組織化學染色觀察PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。常規石蠟組織切片，切片厚3μm。行HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學染色。按照SABC免疫組織化學檢測試劑盒說明書操作，滴加同種來源的血清封閉液，室溫封閉30 min，吸取多余液體；滴加1 ：100稀釋的一抗，濕盒內4℃過夜，復溫后PBS洗3次；滴加二抗，37℃下放置30 min，PBS洗3次；室溫顯微鏡下控制DAB顯色時間。陰性對照用PBS代替一抗。以背景清晰、細胞內出現棕黃色顆粒為陽性表達。采用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件分析圖像，每張切片隨機選取5個200倍視野，測量棕黃色陽性顆粒的總面積和平均透光度，計算平均積分A值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件行統計學處理，計量資料以均數±標準差(
2 結果
PVR、PDR、IMH患眼玻璃體組織中HSP47表達分別為(212.35±23.32)、(231.30±26.79)、(171.06±28.91) pg/ml；TGF-β2表達分別為(1 919.96±318.55)、(1 939.39±177.57)、(1 194.61±234.20) pg/ml。與IMH患眼比較，PVR、PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達明顯增強，差異有統計學意義(F=12.952、34.532，P＜0.01)。PVR與PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達比較，差異無統計學意義(t=-1.849、-0.185，P＞0.05)(圖 1)。
圖1
PVR、PDR、IMH患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達比較
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中存在類圓形或多角形的上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞，散在色素顆粒(圖 2)；IMH患眼內界膜組織為沒有細胞成分的均一基質組織(圖 3)。
圖2
患眼視網膜前增生膜HE染色像。2A. PVR；2B. PDR。可見類圓形或多角形的上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞，散在色素顆粒?HE?標尺：500μm??圖 3?IMH患眼內界膜HE染色像。未見細胞成分?HE?標尺：500μm
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達在細胞漿及細胞外基質中(圖 4，5)。IMH患眼內界膜組織中HSP47及Ⅲ型膠原蛋白表達呈陰性，TGF-β2表達呈弱陽性，Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性(圖 6)。
圖4
PVR患眼視網膜前增生膜免疫組織化學染色像。4A. HSP47；4B. TGF-β2；4C.Ⅰ型膠原蛋白；4D.Ⅲ型膠原蛋白。均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達在細胞漿及細胞外基質中?DAB?標尺：500μm??圖 5?PDR患眼視網膜前增生膜免疫組織化學染色像。5A. HSP47；5B. TGF-β2；5C.Ⅰ型膠原蛋白；5D.Ⅲ型膠原蛋白。均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2主要表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白主要表達在細胞漿及細胞外基質中?DAB?標尺：500μm??圖 6?IMH患眼內界膜免疫組織化學染色像。6A. HSP47；6B. TGF-β2；6C.Ⅰ型膠原蛋白；6D.Ⅲ型膠原蛋白。HSP47、Ⅲ型膠原蛋白表達均呈陰性，TGF-β2表達呈弱陽性，Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性?DAB?標尺：500μm
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達較IMH患眼內界膜組織中各因子表達明顯提高，差異有統計學意義(F=13.469、18.752、12.875、20.358，P＜0.01)(圖 7)。PVR(r=0.475、0.556、0.468)、PDR(r=0.484、0.589、0.512)患眼視網膜前增生膜組織中HSP47陽性表達與TGF-β2和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈正相關(P＜0.05)。
圖7
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜與IMH患眼內界膜組織中各因子表達的平均積分A值比較
3 討論
本研究結果顯示，與IMH患眼比較，PVR、PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達明顯增強，視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2均呈強陽性表達。通過HE染色觀察發現，PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中存在散在色素顆粒的類圓形或多角形上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞；同時經免疫組織化學染色確認HSP47、TGF-β2在細胞漿及細胞間質中呈陽性表達。我們據此推測，這類細胞可能是遷移至視網膜表面的色素上皮細胞(RPE)及RPE轉分化的成纖維細胞。提示HSP47、TGF-β2可能主要通過RPE細胞在增生性玻璃體視網膜疾病中發揮作用。
目前有關HSP47、TGF-β2在PVR、PDR病理過程中相互作用的具體機制尚未明確。TGF-β2在纖維化進程中發揮重要作用，刺激以膠原蛋白為主的細胞外基質成分的產生和合成。HSP47是TGF-β2作用的下游分子，TGF-β2可能通過促進HSP47的表達進而導致Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達增強[7]。Itoh等[11]研究發現，TGF-β2通過多種信號通路發揮作用，在體外培養的人RPE細胞株中，TGF-β2活化視紫紅質(Rho)A/ Rho激酶途徑，活性RhoA/ Rho激酶介導TGF-β2誘導的啟動子活性，促進mRNA表達和Ⅰ型膠原蛋白的合成[11]。而HSP47是膠原特異性分子伴侶，可能作為膠原合成的調節因子發揮作用。本研究結果顯示，PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47陽性表達與TGF-β2和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈正相關。說明HSP47、TGF-β2可能通過促進膠原蛋白合成以及細胞外基質過度沉積，從而在增生性玻璃體視網膜疾病中發揮重要作用。
TGF-β2的生理功能廣泛，且在高濃度時抑制細胞增生，可能在增生性玻璃體視網膜疾病中并不發揮主要作用，而且靶向抑制TGF-β2可能會帶來一些副作用；而作為其下游分子的HSP47，作用更為單純，可能更適合作為治療的靶點。盡管本研究結果表明HSP47、TGF-β2在PVR、PDR患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中的表達明顯增強，其可能通過促進膠原蛋白合成參與PVR與PDR的病理過程。但針對這一病理作用的具體機制探討得不夠深入，有待今后體外及動物實驗研究來進一步分析HSP47、TGF-β2在增生性玻璃體視網膜疾病中的具體作用機制。
上皮細胞間質轉化及細胞外基質沉積是增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、增生型糖尿病視網膜病變(PDR)等增生性玻璃體視網膜疾病的主要病理特征[1, 2]。轉化生長因子(TGF)-β2在纖維化進程中發揮重要作用，刺激以膠原蛋白為主的細胞外基質成分的產生和合成[3, 4]。熱休克蛋白(HSP)47是一種膠原特異性分子伴侶，作為TGF-β2的下游分子，輔助前膠原蛋白折疊、裝配并分泌至細胞外，造成大量膠原蛋白在細胞外基質沉積。TGF-β2的促纖維化作用和HSP47促進細胞外基質沉積可能是多種纖維化疾病的重要病理過程[5-8]。為探討HSP47、TGF-β2在增生性玻璃體視網膜疾病中的作用，我們觀察了PVR、PDR患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2的表達。現將結果報道如下。
1 對象和方法
1.1 對象、標本采集及主要實驗儀器、試劑
2014年6月至2015年3月在山西省眼科醫院臨床確診為PVR的48例48只眼及PDR的50例50只眼納入本研究。參照1983年國際視網膜學會的PVR分級標準[9]對PVR患眼進行分級。PVR 48只眼中，C級40只眼；D級8只眼。參照1985年糖尿病視網膜病變分期標準[10]對PDR患眼進行分期。PDR 50只眼中，Ⅴ期28只眼，Ⅵ期22只眼。同時納入特發性黃斑裂孔(IMH)患者20例20只眼作為對照。排除伴有新生血管性青光眼、視網膜動靜脈阻塞、脈絡膜脫離、高度近視、眼外傷、惡性腫瘤、活動期免疫系統疾病及感染性炎癥等可能影響細胞因子水平的其他眼部疾病。3組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
所有患者均行常規23G玻璃體切割手術。打開灌注前，采用玻璃體切割頭抽取玻璃體組織0.5 ml，置于微量離心管中，－80℃凍存。手術中采用眼內鑷小心剝除PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織，－80℃凍存。
酶標儀(SPECTRA-Ⅲ型，美國Spectra Energy公司)、光學顯微鏡(Nikon2E800，日本尼康公司)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)儀(美國BioRad公司)。人HSP-47 ELISA試劑盒、人TGF-β2 ELISA試劑盒、小鼠抗人HSP47單克隆抗體、小鼠抗人TGF-β2單克隆抗體、小鼠抗人Ⅰ型膠原蛋白IgG抗體、小鼠抗人Ⅲ型膠原蛋白抗體、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(美國Abcam公司)。
1.2 ELISA檢測及蘇木精-伊紅(HE)、免疫組織化學染色
采用ELISA檢測所有患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2的表達。標準孔加標準液50μl；待測樣品孔加入樣品稀釋液40μl，再加入待測樣品10μl做好標記。加入酶標試劑50μl，空白孔除外。先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，37℃避光顯色15 min。加終止液50μl，終止反應。空白孔調零，測量各孔的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值。以標準物濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度。
采用HE染色觀察PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織的病理特征。作常規石蠟組織切片，切片厚3μm。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，蘇木精染色1 min，鹽酸酒精分化，水洗后伊紅染色5 s，光學顯微鏡下觀察。
采用免疫組織化學染色觀察PVR、PDR患眼視網膜前增生膜以及IMH患眼內界膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。常規石蠟組織切片，切片厚3μm。行HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白免疫組織化學染色。按照SABC免疫組織化學檢測試劑盒說明書操作，滴加同種來源的血清封閉液，室溫封閉30 min，吸取多余液體；滴加1 ：100稀釋的一抗，濕盒內4℃過夜，復溫后PBS洗3次；滴加二抗，37℃下放置30 min，PBS洗3次；室溫顯微鏡下控制DAB顯色時間。陰性對照用PBS代替一抗。以背景清晰、細胞內出現棕黃色顆粒為陽性表達。采用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件分析圖像，每張切片隨機選取5個200倍視野，測量棕黃色陽性顆粒的總面積和平均透光度，計算平均積分A值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件行統計學處理，計量資料以均數±標準差(
2 結果
PVR、PDR、IMH患眼玻璃體組織中HSP47表達分別為(212.35±23.32)、(231.30±26.79)、(171.06±28.91) pg/ml；TGF-β2表達分別為(1 919.96±318.55)、(1 939.39±177.57)、(1 194.61±234.20) pg/ml。與IMH患眼比較，PVR、PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達明顯增強，差異有統計學意義(F=12.952、34.532，P＜0.01)。PVR與PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達比較，差異無統計學意義(t=-1.849、-0.185，P＞0.05)(圖 1)。
圖1
PVR、PDR、IMH患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達比較
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中存在類圓形或多角形的上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞，散在色素顆粒(圖 2)；IMH患眼內界膜組織為沒有細胞成分的均一基質組織(圖 3)。
圖2
患眼視網膜前增生膜HE染色像。2A. PVR；2B. PDR。可見類圓形或多角形的上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞，散在色素顆粒?HE?標尺：500μm??圖 3?IMH患眼內界膜HE染色像。未見細胞成分?HE?標尺：500μm
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達在細胞漿及細胞外基質中(圖 4，5)。IMH患眼內界膜組織中HSP47及Ⅲ型膠原蛋白表達呈陰性，TGF-β2表達呈弱陽性，Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性(圖 6)。
圖4
PVR患眼視網膜前增生膜免疫組織化學染色像。4A. HSP47；4B. TGF-β2；4C.Ⅰ型膠原蛋白；4D.Ⅲ型膠原蛋白。均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達在細胞漿及細胞外基質中?DAB?標尺：500μm??圖 5?PDR患眼視網膜前增生膜免疫組織化學染色像。5A. HSP47；5B. TGF-β2；5C.Ⅰ型膠原蛋白；5D.Ⅲ型膠原蛋白。均呈強陽性表達，HSP47、TGF-β2主要表達在細胞漿及細胞間質中，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白主要表達在細胞漿及細胞外基質中?DAB?標尺：500μm??圖 6?IMH患眼內界膜免疫組織化學染色像。6A. HSP47；6B. TGF-β2；6C.Ⅰ型膠原蛋白；6D.Ⅲ型膠原蛋白。HSP47、Ⅲ型膠原蛋白表達均呈陰性，TGF-β2表達呈弱陽性，Ⅰ型膠原蛋白表達呈陽性?DAB?標尺：500μm
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達較IMH患眼內界膜組織中各因子表達明顯提高，差異有統計學意義(F=13.469、18.752、12.875、20.358，P＜0.01)(圖 7)。PVR(r=0.475、0.556、0.468)、PDR(r=0.484、0.589、0.512)患眼視網膜前增生膜組織中HSP47陽性表達與TGF-β2和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈正相關(P＜0.05)。
圖7
PVR、PDR患眼視網膜前增生膜與IMH患眼內界膜組織中各因子表達的平均積分A值比較
3 討論
本研究結果顯示，與IMH患眼比較，PVR、PDR患眼玻璃體組織中HSP47、TGF-β2表達明顯增強，視網膜前增生膜組織中HSP47、TGF-β2均呈強陽性表達。通過HE染色觀察發現，PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中存在散在色素顆粒的類圓形或多角形上皮樣細胞及長梭形且胞體較大的成纖維樣細胞；同時經免疫組織化學染色確認HSP47、TGF-β2在細胞漿及細胞間質中呈陽性表達。我們據此推測，這類細胞可能是遷移至視網膜表面的色素上皮細胞(RPE)及RPE轉分化的成纖維細胞。提示HSP47、TGF-β2可能主要通過RPE細胞在增生性玻璃體視網膜疾病中發揮作用。
目前有關HSP47、TGF-β2在PVR、PDR病理過程中相互作用的具體機制尚未明確。TGF-β2在纖維化進程中發揮重要作用，刺激以膠原蛋白為主的細胞外基質成分的產生和合成。HSP47是TGF-β2作用的下游分子，TGF-β2可能通過促進HSP47的表達進而導致Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達增強[7]。Itoh等[11]研究發現，TGF-β2通過多種信號通路發揮作用，在體外培養的人RPE細胞株中，TGF-β2活化視紫紅質(Rho)A/ Rho激酶途徑，活性RhoA/ Rho激酶介導TGF-β2誘導的啟動子活性，促進mRNA表達和Ⅰ型膠原蛋白的合成[11]。而HSP47是膠原特異性分子伴侶，可能作為膠原合成的調節因子發揮作用。本研究結果顯示，PVR、PDR患眼視網膜前增生膜組織中HSP47陽性表達與TGF-β2和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白陽性表達呈正相關。說明HSP47、TGF-β2可能通過促進膠原蛋白合成以及細胞外基質過度沉積，從而在增生性玻璃體視網膜疾病中發揮重要作用。
TGF-β2的生理功能廣泛，且在高濃度時抑制細胞增生，可能在增生性玻璃體視網膜疾病中并不發揮主要作用，而且靶向抑制TGF-β2可能會帶來一些副作用；而作為其下游分子的HSP47，作用更為單純，可能更適合作為治療的靶點。盡管本研究結果表明HSP47、TGF-β2在PVR、PDR患眼玻璃體及視網膜前增生膜組織中的表達明顯增強，其可能通過促進膠原蛋白合成參與PVR與PDR的病理過程。但針對這一病理作用的具體機制探討得不夠深入，有待今后體外及動物實驗研究來進一步分析HSP47、TGF-β2在增生性玻璃體視網膜疾病中的具體作用機制。
