引用本文： 周賢慧, 孟旭霞, 孫運波, 胡迭, 郭慶敏. 軸突導向因子netrin-1對早期糖尿病大鼠血視網膜屏障的影響. 中華眼底病雜志, 2015, 31(5): 472-476. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.05.015 復制
糖尿病視網膜病變(DR)早期視網膜血管通透性增高，血視網膜屏障(BRB)破壞，晚期出現病理性新生血管，導致視力嚴重下降[1]。因此，在DR早期，保護BRB，防止血管通透性損害是阻止DR進展的關鍵因素之一[2]。軸突導向因子netrin-1為可溶性神經導向因子[3]，能特異性識別環境中因子，向細胞內傳遞吸引或排斥信號以介導軸突的生長方向。近年研究發現，netrin-1不僅具有神經導向作用，對血管的生成同樣起誘導和調控作用[4, 5]。但netrin-1對DR血管通透性是否有影響，在DR新生血管形成前期是否也具有調控作用尚不清楚。為此，我們觀察了外源性netrin-1玻璃體腔注射后，糖尿病(DM)大鼠視網膜血管通透性變化，并對其變化發生的可能機制進行了分析探討。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體重約250 g，清潔級，山東魯抗醫藥公司提供，青島大學動物房飼養。隨機數字表法將其分為正常對照組、DM+平衡鹽溶液(BSS)組、DM+ netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組。每組均為20只大鼠。正常對照組外的60只大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導DM動物模型。72 h后測空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM造模成功，繼續高糖高脂飼養3個月，期間定期監測血糖，使血糖維持在成模要求的范圍直至實驗結束。
DM建模成功后3個月，DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠玻璃體腔分別注射10、100μg/ml的外源性netrin-1 5μl；DM+BSS組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS；正常對照組大鼠不做任何處理。玻璃體腔注射時斜行進針，注射結束后按壓穿刺口3 min。所有實驗眼未出現鞏膜口漏及高眼壓。
伊凡思藍(EB)測定視網膜血管通透性。DM 4個月時，各組隨機選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，按45 mg/kg劑量尾靜脈注入EB。循環120 min后，1%多聚甲醛以66 ml/min行心臟灌注2 min。灌注結束后摘除眼球，剝離視網膜，4℃過夜晾干后稱干重。每一個視網膜加甲酰胺0.3 ml，70℃孵育18 h，分別測定620、740 nm的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值差。差值×1000=凈A值。每一樣本測量3次，取平均值。計算EB經視網膜血管的滲漏量：[視網膜EB量(mg)/視網膜干重(g)]/[單位時間內血漿EB量(mg)/血漿體積(μl)×循環時間(h)]，結果以ng/mg表示。以平均積分A值(IA值)表示視網膜閉合蛋白(occludin)的表達量。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察視網膜微血管的病理改變；免疫組織化學染色檢測occludin的表達。DM 4個月時，每組隨機選取5只大鼠過量麻醉法處死。迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，作5μm厚度的連續切片。石蠟切片常規脫蠟和水化后，抗原修復，5%山羊血清封閉，一抗兔抗大鼠occludin多克隆抗體(1 ：200)，二抗生物素標記山羊抗兔IgG抗體，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，封片，光學顯微鏡下觀察。以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。Image pro plus 6.0軟件進行圖像分析。
熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網膜occldin mRNA表達。DM 4個月時，每組隨機選取5只大鼠過量麻醉處死。每50～100 mg視網膜加1 ml RNAiso plus，裂解視網膜組織；提取視網膜總RNA，DNase試劑盒去除RNA內殘留DNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白(actin)基因作為內參，occludin引物雙鏈嵌合熒光染色法(SYBR GreenⅠ)擴增相應基因。Occludin上游引物序列：5′-CCTGTC TATGCTCGTCATCG-3′；下游引物序列: 5′-TAGCC GTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin上游引物序列: 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；下游引物序列: 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度為60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環數，即Ct值。正常對照組大鼠視網膜occludin mRNA表達量設為1。
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析處理。定量資料結果以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，大鼠腹腔注射STZ后4個月，DM+BSS組大鼠視網膜神經節細胞層水腫，內、外核層細胞數減少伴排列紊亂，視網膜微血管不規則擴張，結構異常。玻璃體注射netrin-1后視網膜神經節細胞水腫減輕，數量增多，視網膜微血管擴張程度減輕(圖 1)。
圖1
DM+BSS組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。1A.DM+BSS組；1B. DM+netrin-1高劑量組。DM+BSS組大鼠視網膜神經節細胞層水腫明顯，視網膜微血管紆曲擴張；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜神經節細胞層水腫減輕，微血管擴張減輕?HE×100
免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組大鼠視網膜棕黃色顆粒主要集中于視網膜血管壁周圍，其中神經纖維層、神經節細胞層、內叢狀層及內核層也有少量分布；DM+BSS組大鼠視網膜棕黃色顆粒顏色變淺，染色范圍縮小；DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜棕黃色顆粒較DM+BSS組深；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜棕黃色顆粒較DM+netrin-1低劑量組進一步加深(圖 2)。
圖2
各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。2A.正常對照組；2B. DM+BSS組；2C. DM+netrin-1低劑量組；2D. DM+netrin-1高劑量組。正常對照組大鼠視網膜occludin主要表達于血管周圍；DM+BSS組大鼠視網膜occludin表達明顯減少。玻璃體腔注射netirn-1后視網膜occludin表達增多，且DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜occludin的表達量較DM+netrin-1低劑量組高?DAB×40
正常對照組、DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜IA值分別為4.83±0.82、1.33±0.31、2.52±0.56、3.01±0.67。正常對照組視網膜IA值與DM+BSS組比較，差異有統計學意義(t=26.99, P=0.00)；DM+BSS組、DM+ netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組間大鼠視網膜IA值比較，差異有統計學意義(F=177.13, P=0.00)，且DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜occludin表達較低劑量組高。DM+BSS組大鼠視網膜IA值與DM+netrin-1低劑量組比較，差異有統計學意義(t=-13.98, P=0.00)；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜IA值與正常對照組比較，差異有統計學意義(t=12.87, P=0.00)。
RT-PCR檢測結果顯示，與正常對照組大鼠視網膜中occludin mRNA表達比較，其余各組大鼠視網膜中occludin mRNA表達減少，差異有統計學意義(P＜0.05)(表 1)。DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜occludin mRNA表達與DM+BSS組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜中occludin mRNA表達與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
表1
各組大鼠視網膜中occludin mRNA的表達量比較
視網膜通透性檢測結果顯示，正常對照組、DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜EB滲漏量分別為(12.27±2.51)、(34.46±5.11)、(29.22±3.82)、(21.45±3.91) ng/mg。DM+BSS組大鼠視網膜EB滲漏量較正常對照組高，差異有統計學意義(t=-35.39，P=0.00)；DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量、DM+netrin-1高劑量組間大鼠視網膜EB滲漏量比較，差異有統計意義(F=179.69, P=0.00)；DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜EB滲漏量與DM+netrin-1高劑量組比較，差異有統計學意義(t=12.73, P=0.00)。DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜EB滲漏量少，但仍較正常對照組高，差異有統計學意義(t=-16.28, P=0.00)。
3 討論
BRB是血眼屏障的重要組成部分，由內屏障及外屏障構成，是維持視網膜內環境穩態的重要結構。DM時，視網膜屏障功能破壞，血管通透性增加，其中內屏障功能受損是導致視網膜血管通透性增加的主要原因[6]。Occludin是構成視網膜血管內皮細胞緊密連接的跨膜蛋白，存在于血視網膜內屏障的緊密連接處，是觀察視網膜屏障功能和血管通透性的重要指標[7, 8]。
Netrin-1是最早發現的神經誘導因子，能特異性的識別環境中的吸引或排斥信號，介導軸突生長[3]。新近研究發現，netrin-1在血管生長發育中也起到重要作用[9, 10]，能夠促進內皮細胞增生、遷移和黏附，引導新生血管形成[4]，而且由netrin-1介導生成的血管具有完整的內皮細胞結構[11]。然而，Lu等[12]通過敲除netrin-1基因及加入外源性netrin-1，發現細胞出現回縮現象，提示外源性netrin-1可能抑制內皮細胞遷移，進而抑制血管生成。Bouvrée等[13]在雞胚實驗中印證了這一觀點。那么，netrin-1對血管生成是促進作用還是抑制作用？Yang等[14]的相關實驗發現，netrin-l對血管生成起雙重調控作用，其作用的性質取決于外源性netrin-1濃度，即低濃度促進血管生成，高濃度抑制血管生成。
本研究結果顯示，大鼠玻璃體腔注射netrin-1后，視網膜緊密連接蛋白occludin表達量較DM+BSS組升高，并且DM+netrin-1高劑量組較DM+netrin-1低劑量組效果更顯著，但高劑量netrin-1仍不能使視網膜中occludin的表達恢復正常水平。另外，玻璃體腔注射netrin-1后，視網膜血管通透性降低，且通透性變化趨勢與netrin-1濃度變化有關，即100 mg/ml的DM+netrin-1高劑量組視網膜EB滲漏量較10 mg/ml的DM+netrin-1低劑量組少。由此，我們認為，netrin-1對BRB具有保護作用，推測該作用可能是通過保護緊密連接蛋白occludin，抑制其降低來實現的；并且外源性netrin-1濃度越高，對視網膜血管的保護作用可能越顯著。
Zhang等[15]研究發現，DM大鼠3個月時，視網膜中netrin-1表達較對照組明顯升高，認為netrin-1在DR進展中起重要作用。而本研究中在DM 3個月時，向玻璃體腔注射外源性netrin-1后，抑制DR進展，我們推測可能是當netrin-1濃度升高后存在一個負反饋，具體機制目前不清楚，有待進一步實驗印證。
本實驗預實驗階段，對DM 1周, 1、2、3個月的大鼠進行netrin-1玻璃體腔注射，結果發現除netrin-1組與對照組不同外，其余差異均無統計學意義，因此本研究選擇DM 3個月時行玻璃體腔注射。結果中未觀察到netrin-1對血管通透性的雙重作用，這可能與我們注射netrin-1的濃度較高及濃度梯度較少有關。但是關于netrin-1如何保護糖尿病視網膜血管中occludin，抑制BRB的破壞的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。
糖尿病視網膜病變(DR)早期視網膜血管通透性增高，血視網膜屏障(BRB)破壞，晚期出現病理性新生血管，導致視力嚴重下降[1]。因此，在DR早期，保護BRB，防止血管通透性損害是阻止DR進展的關鍵因素之一[2]。軸突導向因子netrin-1為可溶性神經導向因子[3]，能特異性識別環境中因子，向細胞內傳遞吸引或排斥信號以介導軸突的生長方向。近年研究發現，netrin-1不僅具有神經導向作用，對血管的生成同樣起誘導和調控作用[4, 5]。但netrin-1對DR血管通透性是否有影響，在DR新生血管形成前期是否也具有調控作用尚不清楚。為此，我們觀察了外源性netrin-1玻璃體腔注射后，糖尿病(DM)大鼠視網膜血管通透性變化，并對其變化發生的可能機制進行了分析探討。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只，體重約250 g，清潔級，山東魯抗醫藥公司提供，青島大學動物房飼養。隨機數字表法將其分為正常對照組、DM+平衡鹽溶液(BSS)組、DM+ netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組。每組均為20只大鼠。正常對照組外的60只大鼠按60 mg/kg劑量左下腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導DM動物模型。72 h后測空腹血糖≥16.5 mmol/L為DM造模成功，繼續高糖高脂飼養3個月，期間定期監測血糖，使血糖維持在成模要求的范圍直至實驗結束。
DM建模成功后3個月，DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠玻璃體腔分別注射10、100μg/ml的外源性netrin-1 5μl；DM+BSS組大鼠玻璃體腔注射等體積BSS；正常對照組大鼠不做任何處理。玻璃體腔注射時斜行進針，注射結束后按壓穿刺口3 min。所有實驗眼未出現鞏膜口漏及高眼壓。
伊凡思藍(EB)測定視網膜血管通透性。DM 4個月時，各組隨機選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，按45 mg/kg劑量尾靜脈注入EB。循環120 min后，1%多聚甲醛以66 ml/min行心臟灌注2 min。灌注結束后摘除眼球，剝離視網膜，4℃過夜晾干后稱干重。每一個視網膜加甲酰胺0.3 ml，70℃孵育18 h，分別測定620、740 nm的吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值差。差值×1000=凈A值。每一樣本測量3次，取平均值。計算EB經視網膜血管的滲漏量：[視網膜EB量(mg)/視網膜干重(g)]/[單位時間內血漿EB量(mg)/血漿體積(μl)×循環時間(h)]，結果以ng/mg表示。以平均積分A值(IA值)表示視網膜閉合蛋白(occludin)的表達量。蘇木精-伊紅(HE)染色觀察視網膜微血管的病理改變；免疫組織化學染色檢測occludin的表達。DM 4個月時，每組隨機選取5只大鼠過量麻醉法處死。迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，作5μm厚度的連續切片。石蠟切片常規脫蠟和水化后，抗原修復，5%山羊血清封閉，一抗兔抗大鼠occludin多克隆抗體(1 ：200)，二抗生物素標記山羊抗兔IgG抗體，3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，封片，光學顯微鏡下觀察。以血管內皮細胞膜呈棕黃色為陽性表達。Image pro plus 6.0軟件進行圖像分析。
熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網膜occldin mRNA表達。DM 4個月時，每組隨機選取5只大鼠過量麻醉處死。每50～100 mg視網膜加1 ml RNAiso plus，裂解視網膜組織；提取視網膜總RNA，DNase試劑盒去除RNA內殘留DNA，逆轉錄成cDNA，以β-肌動蛋白(actin)基因作為內參，occludin引物雙鏈嵌合熒光染色法(SYBR GreenⅠ)擴增相應基因。Occludin上游引物序列：5′-CCTGTC TATGCTCGTCATCG-3′；下游引物序列: 5′-TAGCC GTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin上游引物序列: 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；下游引物序列: 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火溫度為60℃，40個循環后形成擴增曲線，記錄熒光值到達閾值時所經歷的循環數，即Ct值。正常對照組大鼠視網膜occludin mRNA表達量設為1。
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析處理。定量資料結果以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，大鼠腹腔注射STZ后4個月，DM+BSS組大鼠視網膜神經節細胞層水腫，內、外核層細胞數減少伴排列紊亂，視網膜微血管不規則擴張，結構異常。玻璃體注射netrin-1后視網膜神經節細胞水腫減輕，數量增多，視網膜微血管擴張程度減輕(圖 1)。
圖1
DM+BSS組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像。1A.DM+BSS組；1B. DM+netrin-1高劑量組。DM+BSS組大鼠視網膜神經節細胞層水腫明顯，視網膜微血管紆曲擴張；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜神經節細胞層水腫減輕，微血管擴張減輕?HE×100
免疫組織化學染色結果顯示，正常對照組大鼠視網膜棕黃色顆粒主要集中于視網膜血管壁周圍，其中神經纖維層、神經節細胞層、內叢狀層及內核層也有少量分布；DM+BSS組大鼠視網膜棕黃色顆粒顏色變淺，染色范圍縮小；DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜棕黃色顆粒較DM+BSS組深；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜棕黃色顆粒較DM+netrin-1低劑量組進一步加深(圖 2)。
圖2
各組大鼠視網膜免疫組織化學染色像。2A.正常對照組；2B. DM+BSS組；2C. DM+netrin-1低劑量組；2D. DM+netrin-1高劑量組。正常對照組大鼠視網膜occludin主要表達于血管周圍；DM+BSS組大鼠視網膜occludin表達明顯減少。玻璃體腔注射netirn-1后視網膜occludin表達增多，且DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜occludin的表達量較DM+netrin-1低劑量組高?DAB×40
正常對照組、DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜IA值分別為4.83±0.82、1.33±0.31、2.52±0.56、3.01±0.67。正常對照組視網膜IA值與DM+BSS組比較，差異有統計學意義(t=26.99, P=0.00)；DM+BSS組、DM+ netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組間大鼠視網膜IA值比較，差異有統計學意義(F=177.13, P=0.00)，且DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜occludin表達較低劑量組高。DM+BSS組大鼠視網膜IA值與DM+netrin-1低劑量組比較，差異有統計學意義(t=-13.98, P=0.00)；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜IA值與正常對照組比較，差異有統計學意義(t=12.87, P=0.00)。
RT-PCR檢測結果顯示，與正常對照組大鼠視網膜中occludin mRNA表達比較，其余各組大鼠視網膜中occludin mRNA表達減少，差異有統計學意義(P＜0.05)(表 1)。DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜occludin mRNA表達與DM+BSS組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜中occludin mRNA表達與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
表1
各組大鼠視網膜中occludin mRNA的表達量比較
視網膜通透性檢測結果顯示，正常對照組、DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量組、DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜EB滲漏量分別為(12.27±2.51)、(34.46±5.11)、(29.22±3.82)、(21.45±3.91) ng/mg。DM+BSS組大鼠視網膜EB滲漏量較正常對照組高，差異有統計學意義(t=-35.39，P=0.00)；DM+BSS組、DM+netrin-1低劑量、DM+netrin-1高劑量組間大鼠視網膜EB滲漏量比較，差異有統計意義(F=179.69, P=0.00)；DM+netrin-1低劑量組大鼠視網膜EB滲漏量與DM+netrin-1高劑量組比較，差異有統計學意義(t=12.73, P=0.00)。DM+netrin-1高劑量組大鼠視網膜EB滲漏量少，但仍較正常對照組高，差異有統計學意義(t=-16.28, P=0.00)。
3 討論
BRB是血眼屏障的重要組成部分，由內屏障及外屏障構成，是維持視網膜內環境穩態的重要結構。DM時，視網膜屏障功能破壞，血管通透性增加，其中內屏障功能受損是導致視網膜血管通透性增加的主要原因[6]。Occludin是構成視網膜血管內皮細胞緊密連接的跨膜蛋白，存在于血視網膜內屏障的緊密連接處，是觀察視網膜屏障功能和血管通透性的重要指標[7, 8]。
Netrin-1是最早發現的神經誘導因子，能特異性的識別環境中的吸引或排斥信號，介導軸突生長[3]。新近研究發現，netrin-1在血管生長發育中也起到重要作用[9, 10]，能夠促進內皮細胞增生、遷移和黏附，引導新生血管形成[4]，而且由netrin-1介導生成的血管具有完整的內皮細胞結構[11]。然而，Lu等[12]通過敲除netrin-1基因及加入外源性netrin-1，發現細胞出現回縮現象，提示外源性netrin-1可能抑制內皮細胞遷移，進而抑制血管生成。Bouvrée等[13]在雞胚實驗中印證了這一觀點。那么，netrin-1對血管生成是促進作用還是抑制作用？Yang等[14]的相關實驗發現，netrin-l對血管生成起雙重調控作用，其作用的性質取決于外源性netrin-1濃度，即低濃度促進血管生成，高濃度抑制血管生成。
本研究結果顯示，大鼠玻璃體腔注射netrin-1后，視網膜緊密連接蛋白occludin表達量較DM+BSS組升高，并且DM+netrin-1高劑量組較DM+netrin-1低劑量組效果更顯著，但高劑量netrin-1仍不能使視網膜中occludin的表達恢復正常水平。另外，玻璃體腔注射netrin-1后，視網膜血管通透性降低，且通透性變化趨勢與netrin-1濃度變化有關，即100 mg/ml的DM+netrin-1高劑量組視網膜EB滲漏量較10 mg/ml的DM+netrin-1低劑量組少。由此，我們認為，netrin-1對BRB具有保護作用，推測該作用可能是通過保護緊密連接蛋白occludin，抑制其降低來實現的；并且外源性netrin-1濃度越高，對視網膜血管的保護作用可能越顯著。
Zhang等[15]研究發現，DM大鼠3個月時，視網膜中netrin-1表達較對照組明顯升高，認為netrin-1在DR進展中起重要作用。而本研究中在DM 3個月時，向玻璃體腔注射外源性netrin-1后，抑制DR進展，我們推測可能是當netrin-1濃度升高后存在一個負反饋，具體機制目前不清楚，有待進一步實驗印證。
本實驗預實驗階段，對DM 1周, 1、2、3個月的大鼠進行netrin-1玻璃體腔注射，結果發現除netrin-1組與對照組不同外，其余差異均無統計學意義，因此本研究選擇DM 3個月時行玻璃體腔注射。結果中未觀察到netrin-1對血管通透性的雙重作用，這可能與我們注射netrin-1的濃度較高及濃度梯度較少有關。但是關于netrin-1如何保護糖尿病視網膜血管中occludin，抑制BRB的破壞的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。
