引用本文： 孫靖, 楊偉, 張琰, 薄其玉, 張紅. 腺病毒介導的重組Tum5基因抑制視網膜新生血管的實驗研究. 中華眼底病雜志, 2015, 31(4): 371-376. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.04.015 復制
腫瘤抑素(Tumstatin)是近年發現的生物學活性最強的內源性血管抑制因子，但對其研究大多局限在腫瘤領域[1-3]，眼科僅有抑制視網膜新生血管和角膜新生血管方面的少量報道[4, 5]。全長Tumstatin通過抑制血管內皮細胞蛋白合成、促進血管內皮細胞凋亡，發揮抑制新生血管形成作用[6]。位于Tumstatin的第54～132位氨基酸序列的Tum5片段是Tumstatin抗血管生成的活性片段，與Tumstatin全長有等效的抗血管生成活性[7]。但由于Tumstatin全長尚存在其他作用，所帶來的負面影響也可能比Tum5多[8]。因此，本研究通過建立氧誘導視網膜病變(OIR)小鼠模型，將攜帶重組Tum5基因片段的腺病毒載體注射到OIR模型小鼠玻璃體腔中，僅從其抗血管生成活性方面觀察Tum5對視網膜新生血管的影響,為視網膜新生血管性疾病的治療提供新的思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J新生小鼠96只,7日齡，雌雄不限(乳鼠與哺乳母鼠共養)，清潔級，解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。恒河猴脈絡膜視網膜血管內皮細胞(RF/6A)及人胚腎細胞(293A細胞)由中國科學院上海分院提供。氧含量為(75±2)%氮氧混合氣(天津塞米氣體有限公司)；CY-12C數字測氧儀(浙江建德梅城電化分析儀器廠)；高分子量異硫氰酸熒光素葡聚糖(FITC-dextran，相對分子質量2×106；美國Sigma公司)；抗熒光淬滅封片劑(VECTASHIELD Mounting Medium)(美國Vcetor公司)；Tissue-Tek O.C.T.化合物(美國Sakura Finetek CA公司)；封閉用兔血清(北京中杉金橋公司)；兔抗血管內皮生長因子(VEGF)多克隆抗體、山羊抗兔IgG免疫熒光抗體(美國Abcam公司)；兔抗HA-Tag單克隆抗體(美國Sigma公司)；Olymplus熒光顯微鏡(BX51，日本Olymplus公司)；10 μl微量注射器(Hamilton,美國Sigma公司)；腺病毒包裝及純化由上海漢恒生物公司協助完成。重組Tum5質粒構建在天津醫科大學第二醫院完成。
將帶有HA-Tag及Gluc信號肽的原重組Tum5質粒載體(pCMV-Tum5-MCS)進行腺病毒包裝(5型腺病毒)。以BamH I、EcoR I為插入位點，將目的基因序列Tum5連接到pHBAd-MCMV-綠色熒光蛋白(GFP)腺病毒載體中，得到重組載體pHBAd-MCMV-Tum5-GFP，隨后測序鑒定重組質粒載體。將質粒載體進行腺病毒包裝，獲得P3空載體病毒(rAd-GFP)與重組Tum5基因病毒(rAd-Tum5)，通過感染RF/6A，斑點印跡法(Dot blot)檢測Tum5的表達情況。
采用隨機數字表法將96只小鼠分為正常組、OIR組、rAd-GFP空載體組(OIR rAd-GFP組)和重組Tum5基因組(OIR rAd-Tum5組)，每組均為24只。參照文獻[9, 10]的方法建立OIR模型。OIR組、OIR rAd-GFP組、 OIR rAd-Tum5組小鼠置于密閉玻璃倉中，氣體流量控制在1.5 L／min左右,玻璃倉中含氧體積分數為(75±2)%，CY-12C數字測氧儀監測出氣口處氧濃度,6～8次/d以保證玻璃倉內達到有效氧濃度；每日打開密閉容器1次，更換墊料、食水，替換母鼠。高氧環境下連續飼養5 d后，置于正常空氣環境中。正常組小鼠于正常空氣中飼養5 d，不做任何處理。12日齡時，OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組小鼠雙眼玻璃體分別注射病毒滴度為1×1011 pfu/ml的rAd-GFP、rAd-Tum5病毒1 μl。OIR組、正常組小鼠雙眼玻璃體腔分別注射等體積無菌生理鹽水。注射后4組小鼠均置于正常空氣中繼續飼養5 d，17日齡處死各組小鼠。
17日齡時，每組選取8只小鼠做視網膜鋪片，觀察小鼠視網膜血管形態。參照文獻[10]的方法，通過小鼠球后靜脈竇注射50 mg/ml的高分子量FITC-dextran 50 μl，標記視網膜血管。注射后5 min頸脫臼法處死小鼠后摘除雙眼眼球，置于4%多聚甲醛(PFA)中室溫固定40 min，放入磷酸鹽緩沖液(PBS)4℃保存過夜，次日剝離視網膜并鋪片，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察照相。CellSens Standard圖像分析軟件(日本Olympus公司)分別測量各組視網膜無灌注區相對面積。
17日齡時，每組選取8只小鼠，頸脫臼法處死并摘除雙眼眼球，固定、石蠟包埋，作3 μm厚度的連續切片，相鄰2張切片間隔60 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色。高倍光學顯微鏡下觀察視網膜內界膜形態，每組隨機取50張切片照相，分別計數每張切片突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核數。
17日齡時，每組選取8只小鼠處死并摘除雙眼眼球，Tissue-Tek O.C.T.包埋，置于液氮上速凍，-80℃冰箱中保存備用。每組小鼠眼球以矢狀位作5 μm厚度的連續冰凍切片，每只眼球隨機取10張切片作為視網膜代表性切片，-20℃冰箱中保存備用。取出的冰凍切片室溫復溫30 min，4%PFA固定30 min。 1倍PBS洗片，0.03% 十二烷基硫酸鈉孵育10 min，3%封閉液[封閉兔血清用含0.02%迭氮鈉的聚二苯二甲酸丁二醇酶(PBT)稀釋成3%,PBT為1倍 PBS稀釋的0.25%Triton-X100]封閉2 h，抗VEGF一抗4℃孵育過夜，1倍PBS洗片，山羊抗兔熒光二抗室溫避光條件下孵育2 h，1倍PBS洗片后用含4′,6-二脒基苯基吲哚(DAPI)的抗熒光淬滅封片劑封片，室溫避光過夜。熒光顯微鏡下觀察VEGF的表達情況。
17日齡時，取每組小鼠眼球剝離視網膜，加入組織蛋白提抽試劑300 μl，冰上裂解20 min提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉。洗膜緩沖液(TBST)洗膜3次,10 min/次，以β-微管蛋白為內參抗體，抗HA-Tag單克隆一抗及抗VEGF多克隆一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜2次，Tris緩沖液洗膜1次，顯影定影。
采用SPSS 17.0統計學軟件行統計學分析處理。各組量化數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，以均數±標準差(
2 結果
酶切載體pCMV-Tum5-MCS與pHBAd-MCMV-GFP，重新連接獲得重組表達載體pHBAd-MCMV-Tum5-GFP(圖 1A)。質粒測序結果顯示，重組后的質粒載體與原質粒載體中的目的片段吻合。Dot blot檢測結果顯示，在rAd-Tum5感染的細胞中，Tum5的表達較空載體病毒感染的細胞明顯增多(圖 1B,1C)。隨后將rAd-GFP與rAd-Tum5病毒進行純化、濃縮，滴度分別達到2×1011 pfu/ml和1×1011 pfu/ml。
圖1
重組質粒的驗證結果。1A：Tum5重組基因片段和腺病毒表達載體的結構示意圖，起始密碼子-Gaussia分泌型熒光素酶-Tum5-HATag標簽-終止密碼子；1B,1C.Dot blot驗證結果，從左至右，隨一抗濃度增加，二抗濃度不變，rAd-Tum5感染的細胞組(1B)印記加深，而rAd-GFP感染的細胞組(1C)無明顯變化
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜血管呈放射狀從視盤發出，其分支形成分布均勻的血管網(圖 2A)，未見無血管灌注區及新生血管形成(圖 2B)。OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜大血管紆曲變形，分支明顯減少，視網膜中央區可見大片血管無灌注區(圖 2C,2D)，無灌注區與灌注區交界處視網膜新生血管形成(圖 2E,2F)。OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜血管無灌注區顯著減少(圖 2G)，無灌注區邊界紊亂的新生血管明顯減少，可見少量較規則的新生血管芽(圖 2H)，視網膜大血管紆曲程度有所改善。正常組、OIR組、OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組視網膜無灌注區相對面積平均值分別為0%、(22.75±5.29)%、(24.58±4.90)%、(7.91±1.74)%。4組間視網膜無灌注相對面積比較，差異有統計學意義(F=61.224，P<0.01)。組間視網膜無灌注區相對面積比較，OIR rAd-GFP組與OIR組差異無統計學意義(P=0.827)；OIR rAd-Tum5組與OIR組、OIR rAd-GFP組差異有統計學意義(P<0.01)(圖 3)。
圖2
各組小鼠視網膜血管鋪片熒光顯微鏡像。2A.正常組，視網膜血管呈放射狀從視盤發出，其分支形成分布均勻的血管網標尺：500 μm；2B.2A圖中紅色虛線高倍鏡，未見無血管灌注區及新生血管形成標尺：100 μm。2C、2D.OIR組、OIR rAd-GFP組，可見明顯無血管灌注區(紅色實線區域)及大血管紆曲變形(藍箭) 標尺：500 μm；2E、2F分別為2C、2D圖中紅色虛線高倍鏡，可見明顯排列紊亂的新生血管芽(紅箭)及大血管紆曲(藍箭) 標尺：100 μm；2G.OIR rAd-Tum5組，無血管灌注區明顯減少；2H.2G圖中紅色虛線高倍鏡，紊亂新生血管芽明顯減少(紅箭)，血管紆曲有所改善(藍箭) 標尺：100 μm
圖3
各組小鼠視網膜無灌注區相對面積定量比較。 *P<0.05，#P>0.05
光學顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜內界膜平整，未見突破內界膜的視網膜前細胞核(圖 4A)； OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜內界膜形態不規則，可見多個突破內界膜的視網膜前細胞核，并且內界膜下細胞增生明顯，排列紊亂(圖 4B,4C)；OIR rAd-Tum5 組小鼠內界膜形態較規整,突破內界膜的視網膜前細胞核明顯減少(圖 4D)。正常組、OIR組、OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組每張切片突破內界膜的視網膜前細胞核平均數量分別為(0.62±0.76)、(27.00±4.97)、(25.62±3.75)、(6.35± 1.57)個。 4組間突破內界膜的視網膜前細胞核數比較，差異有統計學意義(F=635.738，P<0.01)。組間突破內界膜的視網膜前細胞核數比較，OIR rAd-GFP組與OIR組差異無統計學意義(P=0.261)；OIR rAd-Tum5組與OIR組、OIR rAd-GFP組差異有統計學意義(P<0.01)(圖 5)。
圖4
各組小鼠視網膜組織病理像。4A.正常組，未見突破內界膜的視網膜前細胞核；4B、4C.OIR組、OIR rAd-GFP組，視網膜內界膜形態不規則，可見多個突破內界膜的視網膜前細胞核(黑箭)；4D.OIR rAd-Tum5組，突破內界膜的視網膜前細胞核明顯減少(黑箭) HE 標尺:20 μm
圖5
各組小鼠突破內界膜的視網膜前細胞核數定量比較。 *P<0.05，#P>0.05
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜神經節細胞層(GCL)、內核層(INL)及外核層(ONL)均可見微弱綠色熒光，VEGF表達呈陰性或弱陽性(圖 6A)；OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜GCL、INL及ONL可見明顯的綠色熒光，視網膜各層VEGF表達上調，GCL最為明顯(圖 6B、6C)；OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜GCL、INL、ONL綠色熒光減弱,視網膜各層VEGF表達下調(圖 6D)。
圖6
各組小鼠視網膜免疫熒光染色像。6A.正常組，GCL、INL、ONL均可見微弱綠色熒光(紅箭)；6B、6C.OIR組、OIR rAd-GFP組，GCL、INL、ONL可見明顯的綠色熒光，尤其在GCL更為突出(紅箭)；6D.OIR rAd-Tum5組，GCL、INL及ONL綠色熒光呈減弱(紅箭) 免疫熒光和DAPI 標尺:50 μm
Western blot 檢測結果發現，4組小鼠視網膜蛋白電泳在相對分子質量55×103處均可見蛋白條帶,OIR組及OIR rAd-GFP組蛋白條帶較正常組及OIR rAd-Tum5組明顯。4組小鼠視網膜均有VEGF 蛋白表達，OIR組及OIR rAd-GFP組的VEGF表達水平較正常組有增高趨勢，OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜VEGF表達水平較OIR組及OIR rAd-GFP組呈下降趨勢。OIR rAd-Tum5組在相對分子質量14×103處可見蛋白條帶，而正常組、OIR組、OIR rAd-GFP 組均為陰性(圖 7)。
圖7
各種Western blot檢測結果
3 討論
Tum5是Tumstatin的抗血管生成活性片段，在體內外對血管內皮細胞有明顯的抑制增生和促進凋亡的作用，其作用強度是內皮抑素的10倍以上[11, 12]。本研究采用OIR模型，通過以腺病毒為載體的基因治療技術首次探索Tum5對視網膜新生血管的影響。結果顯示，腺病毒介導的Tum5重組基因可以顯著抑制OIR小鼠視網膜新生血管，減少視網膜無灌注區及突破內界膜的視網膜前細胞核數量，同時下調OIR小鼠視網膜中VEGF表達。提示Tum5可以抑制視網膜新生血管，其作用可能與下調VEGF在視網膜中的表達有關。
新生血管形成是體內常見的病理生理過程，參與機體多種疾病的發生發展過程及損傷的修復，同時受體內外多種促進與抑制因子的調節，其過程十分復雜。眼部的新生血管大部分為病理性增生，形成新生血管性眼病，主要包括視網膜新生血管、脈絡膜新生血管、虹膜新生血管及角膜新生血管等。OIR模型由Smith等[9]創建于1994年，至今依然作為典型的視網膜新生血管疾病模型而廣為使用[13-15]。該模型可以通過FITC-dextran灌注視網膜血管顯色，直接觀察到缺氧狀態下視網膜新生血管叢及視網膜血管無灌注區。此外，還可以通過視網膜切片觀察并計數突破內界膜突入玻璃體腔的視網膜前細胞核數量，評估缺氧狀態下視網膜的新生血管數量。本研究通過以上兩種方法觀察到OIR組小鼠視網膜產生了明顯的無血管灌注區、新生血管芽，以及較多突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核，與正常組均存在顯著的差異，說明OIR模型構建成功。
腺病毒具有裝載外源基因片段容量大、感染能力強、感染范圍廣、安全性高等優點，作為基因治療的載體已被廣泛應用于臨床與基礎研究中[14-16]。通過以病毒為載體將目的基因導入眼內治療眼部疾病，可以有效的增加基因表達的持續時間，達到較持久的治療效果，減少多次眼內藥物注射對眼的損害。目前已有將病毒作為基因載體導入眼內治療眼部疾病的臨床應用[17]。利用腺病毒作為基因載體可以將重組的外源性基因有效感染至OIR模型鼠的視網膜中[15]，也有研究表明，慢病毒介導的Tum5基因可以較持久的表達[18]。本研究以5型腺病毒作為重組Tum5基因的載體，通過玻璃體腔注射的方式將其導入C57BL/6J小鼠眼球中，觀察其對OIR新生血管的抑制作用，這也是Tum5基因治療首次用于眼科領域的研究。本研究FITC-dextran灌注視網膜血管顯色的結果表明，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠視網膜血管無灌注區相對面積無顯著差異，且均存在明顯的新生血管叢，而OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜無灌注區相對面積顯著減小，新生血管叢的數量也顯著減少。這與腫瘤領域報道的Tum5可以抑制新生血管結果一致[7]，進一步說明Tum5能夠抑制視網膜新生血管，同時減小視網膜無血管灌注區面積。 此外，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核數量無明顯差異，內界膜下內皮細胞結構較紊亂，而OIR rAd-Tum5 組的細胞核數量明顯減少，內界膜也相對平整。表明Tum5在減小OIR模型視網膜無灌注區面積的同時，還能減少穿過視網膜內界膜的細胞數量及其對視網膜結構的破壞。
VEGF是視網膜新生血管形成的重要誘導因子，缺氧可導致視網膜多種細胞分泌VEGF[19]。在OIR小鼠模型中VEGF呈高水平表達，其與新生血管的形成密切相關[20]。本研究結果顯示，正常組小鼠視網膜VEGF呈微弱陽性表達，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠視網膜VEGF表達水平均明顯上調。然而OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜VEGF呈弱陽性表達，其表達較OIR組與OIR rAd-GFP組明顯下調，提示Tum5可以下調低氧誘導的視網膜VEGF表達。與文獻報道Tum5下調VEGF表達的結果相一致[11]。但本研究結果更進一步顯示，Tum5可以下調低氧誘導的視網膜VEGF表達。這可能是其抑制視網膜新生血管的分子機制之一，但Tum5下調VEGF的具體機制目前尚不清楚，還需進一步研究。
腺病毒介導的重組Tum5基因過表達能夠抑制視網膜新生血管形成，可能與其下調低氧誘導的視網膜VEGF表達有關，雖然其具體機制尚需進一步研究，但是腺病毒介導的重組Tum5基因為治療視網膜新生血管性疾病提供了新的思路。
腫瘤抑素(Tumstatin)是近年發現的生物學活性最強的內源性血管抑制因子，但對其研究大多局限在腫瘤領域[1-3]，眼科僅有抑制視網膜新生血管和角膜新生血管方面的少量報道[4, 5]。全長Tumstatin通過抑制血管內皮細胞蛋白合成、促進血管內皮細胞凋亡，發揮抑制新生血管形成作用[6]。位于Tumstatin的第54～132位氨基酸序列的Tum5片段是Tumstatin抗血管生成的活性片段，與Tumstatin全長有等效的抗血管生成活性[7]。但由于Tumstatin全長尚存在其他作用，所帶來的負面影響也可能比Tum5多[8]。因此，本研究通過建立氧誘導視網膜病變(OIR)小鼠模型，將攜帶重組Tum5基因片段的腺病毒載體注射到OIR模型小鼠玻璃體腔中，僅從其抗血管生成活性方面觀察Tum5對視網膜新生血管的影響,為視網膜新生血管性疾病的治療提供新的思路。現將結果報道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J新生小鼠96只,7日齡，雌雄不限(乳鼠與哺乳母鼠共養)，清潔級，解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供。恒河猴脈絡膜視網膜血管內皮細胞(RF/6A)及人胚腎細胞(293A細胞)由中國科學院上海分院提供。氧含量為(75±2)%氮氧混合氣(天津塞米氣體有限公司)；CY-12C數字測氧儀(浙江建德梅城電化分析儀器廠)；高分子量異硫氰酸熒光素葡聚糖(FITC-dextran，相對分子質量2×106；美國Sigma公司)；抗熒光淬滅封片劑(VECTASHIELD Mounting Medium)(美國Vcetor公司)；Tissue-Tek O.C.T.化合物(美國Sakura Finetek CA公司)；封閉用兔血清(北京中杉金橋公司)；兔抗血管內皮生長因子(VEGF)多克隆抗體、山羊抗兔IgG免疫熒光抗體(美國Abcam公司)；兔抗HA-Tag單克隆抗體(美國Sigma公司)；Olymplus熒光顯微鏡(BX51，日本Olymplus公司)；10 μl微量注射器(Hamilton,美國Sigma公司)；腺病毒包裝及純化由上海漢恒生物公司協助完成。重組Tum5質粒構建在天津醫科大學第二醫院完成。
將帶有HA-Tag及Gluc信號肽的原重組Tum5質粒載體(pCMV-Tum5-MCS)進行腺病毒包裝(5型腺病毒)。以BamH I、EcoR I為插入位點，將目的基因序列Tum5連接到pHBAd-MCMV-綠色熒光蛋白(GFP)腺病毒載體中，得到重組載體pHBAd-MCMV-Tum5-GFP，隨后測序鑒定重組質粒載體。將質粒載體進行腺病毒包裝，獲得P3空載體病毒(rAd-GFP)與重組Tum5基因病毒(rAd-Tum5)，通過感染RF/6A，斑點印跡法(Dot blot)檢測Tum5的表達情況。
采用隨機數字表法將96只小鼠分為正常組、OIR組、rAd-GFP空載體組(OIR rAd-GFP組)和重組Tum5基因組(OIR rAd-Tum5組)，每組均為24只。參照文獻[9, 10]的方法建立OIR模型。OIR組、OIR rAd-GFP組、 OIR rAd-Tum5組小鼠置于密閉玻璃倉中，氣體流量控制在1.5 L／min左右,玻璃倉中含氧體積分數為(75±2)%，CY-12C數字測氧儀監測出氣口處氧濃度,6～8次/d以保證玻璃倉內達到有效氧濃度；每日打開密閉容器1次，更換墊料、食水，替換母鼠。高氧環境下連續飼養5 d后，置于正常空氣環境中。正常組小鼠于正常空氣中飼養5 d，不做任何處理。12日齡時，OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組小鼠雙眼玻璃體分別注射病毒滴度為1×1011 pfu/ml的rAd-GFP、rAd-Tum5病毒1 μl。OIR組、正常組小鼠雙眼玻璃體腔分別注射等體積無菌生理鹽水。注射后4組小鼠均置于正常空氣中繼續飼養5 d，17日齡處死各組小鼠。
17日齡時，每組選取8只小鼠做視網膜鋪片，觀察小鼠視網膜血管形態。參照文獻[10]的方法，通過小鼠球后靜脈竇注射50 mg/ml的高分子量FITC-dextran 50 μl，標記視網膜血管。注射后5 min頸脫臼法處死小鼠后摘除雙眼眼球，置于4%多聚甲醛(PFA)中室溫固定40 min，放入磷酸鹽緩沖液(PBS)4℃保存過夜，次日剝離視網膜并鋪片，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察照相。CellSens Standard圖像分析軟件(日本Olympus公司)分別測量各組視網膜無灌注區相對面積。
17日齡時，每組選取8只小鼠，頸脫臼法處死并摘除雙眼眼球，固定、石蠟包埋，作3 μm厚度的連續切片，相鄰2張切片間隔60 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色。高倍光學顯微鏡下觀察視網膜內界膜形態，每組隨機取50張切片照相，分別計數每張切片突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核數。
17日齡時，每組選取8只小鼠處死并摘除雙眼眼球，Tissue-Tek O.C.T.包埋，置于液氮上速凍，-80℃冰箱中保存備用。每組小鼠眼球以矢狀位作5 μm厚度的連續冰凍切片，每只眼球隨機取10張切片作為視網膜代表性切片，-20℃冰箱中保存備用。取出的冰凍切片室溫復溫30 min，4%PFA固定30 min。 1倍PBS洗片，0.03% 十二烷基硫酸鈉孵育10 min，3%封閉液[封閉兔血清用含0.02%迭氮鈉的聚二苯二甲酸丁二醇酶(PBT)稀釋成3%,PBT為1倍 PBS稀釋的0.25%Triton-X100]封閉2 h，抗VEGF一抗4℃孵育過夜，1倍PBS洗片，山羊抗兔熒光二抗室溫避光條件下孵育2 h，1倍PBS洗片后用含4′,6-二脒基苯基吲哚(DAPI)的抗熒光淬滅封片劑封片，室溫避光過夜。熒光顯微鏡下觀察VEGF的表達情況。
17日齡時，取每組小鼠眼球剝離視網膜，加入組織蛋白提抽試劑300 μl，冰上裂解20 min提取總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉。洗膜緩沖液(TBST)洗膜3次,10 min/次，以β-微管蛋白為內參抗體，抗HA-Tag單克隆一抗及抗VEGF多克隆一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜2次，Tris緩沖液洗膜1次，顯影定影。
采用SPSS 17.0統計學軟件行統計學分析處理。各組量化數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，以均數±標準差(
2 結果
酶切載體pCMV-Tum5-MCS與pHBAd-MCMV-GFP，重新連接獲得重組表達載體pHBAd-MCMV-Tum5-GFP(圖 1A)。質粒測序結果顯示，重組后的質粒載體與原質粒載體中的目的片段吻合。Dot blot檢測結果顯示，在rAd-Tum5感染的細胞中，Tum5的表達較空載體病毒感染的細胞明顯增多(圖 1B,1C)。隨后將rAd-GFP與rAd-Tum5病毒進行純化、濃縮，滴度分別達到2×1011 pfu/ml和1×1011 pfu/ml。
圖1
重組質粒的驗證結果。1A：Tum5重組基因片段和腺病毒表達載體的結構示意圖，起始密碼子-Gaussia分泌型熒光素酶-Tum5-HATag標簽-終止密碼子；1B,1C.Dot blot驗證結果，從左至右，隨一抗濃度增加，二抗濃度不變，rAd-Tum5感染的細胞組(1B)印記加深，而rAd-GFP感染的細胞組(1C)無明顯變化
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜血管呈放射狀從視盤發出，其分支形成分布均勻的血管網(圖 2A)，未見無血管灌注區及新生血管形成(圖 2B)。OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜大血管紆曲變形，分支明顯減少，視網膜中央區可見大片血管無灌注區(圖 2C,2D)，無灌注區與灌注區交界處視網膜新生血管形成(圖 2E,2F)。OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜血管無灌注區顯著減少(圖 2G)，無灌注區邊界紊亂的新生血管明顯減少，可見少量較規則的新生血管芽(圖 2H)，視網膜大血管紆曲程度有所改善。正常組、OIR組、OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組視網膜無灌注區相對面積平均值分別為0%、(22.75±5.29)%、(24.58±4.90)%、(7.91±1.74)%。4組間視網膜無灌注相對面積比較，差異有統計學意義(F=61.224，P<0.01)。組間視網膜無灌注區相對面積比較，OIR rAd-GFP組與OIR組差異無統計學意義(P=0.827)；OIR rAd-Tum5組與OIR組、OIR rAd-GFP組差異有統計學意義(P<0.01)(圖 3)。
圖2
各組小鼠視網膜血管鋪片熒光顯微鏡像。2A.正常組，視網膜血管呈放射狀從視盤發出，其分支形成分布均勻的血管網標尺：500 μm；2B.2A圖中紅色虛線高倍鏡，未見無血管灌注區及新生血管形成標尺：100 μm。2C、2D.OIR組、OIR rAd-GFP組，可見明顯無血管灌注區(紅色實線區域)及大血管紆曲變形(藍箭) 標尺：500 μm；2E、2F分別為2C、2D圖中紅色虛線高倍鏡，可見明顯排列紊亂的新生血管芽(紅箭)及大血管紆曲(藍箭) 標尺：100 μm；2G.OIR rAd-Tum5組，無血管灌注區明顯減少；2H.2G圖中紅色虛線高倍鏡，紊亂新生血管芽明顯減少(紅箭)，血管紆曲有所改善(藍箭) 標尺：100 μm
圖3
各組小鼠視網膜無灌注區相對面積定量比較。 *P<0.05，#P>0.05
光學顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜內界膜平整，未見突破內界膜的視網膜前細胞核(圖 4A)； OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜內界膜形態不規則，可見多個突破內界膜的視網膜前細胞核，并且內界膜下細胞增生明顯，排列紊亂(圖 4B,4C)；OIR rAd-Tum5 組小鼠內界膜形態較規整,突破內界膜的視網膜前細胞核明顯減少(圖 4D)。正常組、OIR組、OIR rAd-GFP組、OIR rAd-Tum5組每張切片突破內界膜的視網膜前細胞核平均數量分別為(0.62±0.76)、(27.00±4.97)、(25.62±3.75)、(6.35± 1.57)個。 4組間突破內界膜的視網膜前細胞核數比較，差異有統計學意義(F=635.738，P<0.01)。組間突破內界膜的視網膜前細胞核數比較，OIR rAd-GFP組與OIR組差異無統計學意義(P=0.261)；OIR rAd-Tum5組與OIR組、OIR rAd-GFP組差異有統計學意義(P<0.01)(圖 5)。
圖4
各組小鼠視網膜組織病理像。4A.正常組，未見突破內界膜的視網膜前細胞核；4B、4C.OIR組、OIR rAd-GFP組，視網膜內界膜形態不規則，可見多個突破內界膜的視網膜前細胞核(黑箭)；4D.OIR rAd-Tum5組，突破內界膜的視網膜前細胞核明顯減少(黑箭) HE 標尺:20 μm
圖5
各組小鼠突破內界膜的視網膜前細胞核數定量比較。 *P<0.05，#P>0.05
熒光顯微鏡觀察發現，正常組小鼠視網膜神經節細胞層(GCL)、內核層(INL)及外核層(ONL)均可見微弱綠色熒光，VEGF表達呈陰性或弱陽性(圖 6A)；OIR組、OIR rAd-GFP組小鼠視網膜GCL、INL及ONL可見明顯的綠色熒光，視網膜各層VEGF表達上調，GCL最為明顯(圖 6B、6C)；OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜GCL、INL、ONL綠色熒光減弱,視網膜各層VEGF表達下調(圖 6D)。
圖6
各組小鼠視網膜免疫熒光染色像。6A.正常組，GCL、INL、ONL均可見微弱綠色熒光(紅箭)；6B、6C.OIR組、OIR rAd-GFP組，GCL、INL、ONL可見明顯的綠色熒光，尤其在GCL更為突出(紅箭)；6D.OIR rAd-Tum5組，GCL、INL及ONL綠色熒光呈減弱(紅箭) 免疫熒光和DAPI 標尺:50 μm
Western blot 檢測結果發現，4組小鼠視網膜蛋白電泳在相對分子質量55×103處均可見蛋白條帶,OIR組及OIR rAd-GFP組蛋白條帶較正常組及OIR rAd-Tum5組明顯。4組小鼠視網膜均有VEGF 蛋白表達，OIR組及OIR rAd-GFP組的VEGF表達水平較正常組有增高趨勢，OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜VEGF表達水平較OIR組及OIR rAd-GFP組呈下降趨勢。OIR rAd-Tum5組在相對分子質量14×103處可見蛋白條帶，而正常組、OIR組、OIR rAd-GFP 組均為陰性(圖 7)。
圖7
各種Western blot檢測結果
3 討論
Tum5是Tumstatin的抗血管生成活性片段，在體內外對血管內皮細胞有明顯的抑制增生和促進凋亡的作用，其作用強度是內皮抑素的10倍以上[11, 12]。本研究采用OIR模型，通過以腺病毒為載體的基因治療技術首次探索Tum5對視網膜新生血管的影響。結果顯示，腺病毒介導的Tum5重組基因可以顯著抑制OIR小鼠視網膜新生血管，減少視網膜無灌注區及突破內界膜的視網膜前細胞核數量，同時下調OIR小鼠視網膜中VEGF表達。提示Tum5可以抑制視網膜新生血管，其作用可能與下調VEGF在視網膜中的表達有關。
新生血管形成是體內常見的病理生理過程，參與機體多種疾病的發生發展過程及損傷的修復，同時受體內外多種促進與抑制因子的調節，其過程十分復雜。眼部的新生血管大部分為病理性增生，形成新生血管性眼病，主要包括視網膜新生血管、脈絡膜新生血管、虹膜新生血管及角膜新生血管等。OIR模型由Smith等[9]創建于1994年，至今依然作為典型的視網膜新生血管疾病模型而廣為使用[13-15]。該模型可以通過FITC-dextran灌注視網膜血管顯色，直接觀察到缺氧狀態下視網膜新生血管叢及視網膜血管無灌注區。此外，還可以通過視網膜切片觀察并計數突破內界膜突入玻璃體腔的視網膜前細胞核數量，評估缺氧狀態下視網膜的新生血管數量。本研究通過以上兩種方法觀察到OIR組小鼠視網膜產生了明顯的無血管灌注區、新生血管芽，以及較多突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核，與正常組均存在顯著的差異，說明OIR模型構建成功。
腺病毒具有裝載外源基因片段容量大、感染能力強、感染范圍廣、安全性高等優點，作為基因治療的載體已被廣泛應用于臨床與基礎研究中[14-16]。通過以病毒為載體將目的基因導入眼內治療眼部疾病，可以有效的增加基因表達的持續時間，達到較持久的治療效果，減少多次眼內藥物注射對眼的損害。目前已有將病毒作為基因載體導入眼內治療眼部疾病的臨床應用[17]。利用腺病毒作為基因載體可以將重組的外源性基因有效感染至OIR模型鼠的視網膜中[15]，也有研究表明，慢病毒介導的Tum5基因可以較持久的表達[18]。本研究以5型腺病毒作為重組Tum5基因的載體，通過玻璃體腔注射的方式將其導入C57BL/6J小鼠眼球中，觀察其對OIR新生血管的抑制作用，這也是Tum5基因治療首次用于眼科領域的研究。本研究FITC-dextran灌注視網膜血管顯色的結果表明，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠視網膜血管無灌注區相對面積無顯著差異，且均存在明顯的新生血管叢，而OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜無灌注區相對面積顯著減小，新生血管叢的數量也顯著減少。這與腫瘤領域報道的Tum5可以抑制新生血管結果一致[7]，進一步說明Tum5能夠抑制視網膜新生血管，同時減小視網膜無血管灌注區面積。 此外，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠突破視網膜內界膜的視網膜前細胞核數量無明顯差異，內界膜下內皮細胞結構較紊亂，而OIR rAd-Tum5 組的細胞核數量明顯減少，內界膜也相對平整。表明Tum5在減小OIR模型視網膜無灌注區面積的同時，還能減少穿過視網膜內界膜的細胞數量及其對視網膜結構的破壞。
VEGF是視網膜新生血管形成的重要誘導因子，缺氧可導致視網膜多種細胞分泌VEGF[19]。在OIR小鼠模型中VEGF呈高水平表達，其與新生血管的形成密切相關[20]。本研究結果顯示，正常組小鼠視網膜VEGF呈微弱陽性表達，OIR組與OIR rAd-GFP組小鼠視網膜VEGF表達水平均明顯上調。然而OIR rAd-Tum5組小鼠視網膜VEGF呈弱陽性表達，其表達較OIR組與OIR rAd-GFP組明顯下調，提示Tum5可以下調低氧誘導的視網膜VEGF表達。與文獻報道Tum5下調VEGF表達的結果相一致[11]。但本研究結果更進一步顯示，Tum5可以下調低氧誘導的視網膜VEGF表達。這可能是其抑制視網膜新生血管的分子機制之一，但Tum5下調VEGF的具體機制目前尚不清楚，還需進一步研究。
腺病毒介導的重組Tum5基因過表達能夠抑制視網膜新生血管形成，可能與其下調低氧誘導的視網膜VEGF表達有關，雖然其具體機制尚需進一步研究，但是腺病毒介導的重組Tum5基因為治療視網膜新生血管性疾病提供了新的思路。
