引用本文： 江銘, 蔡善君, 謝兵, 聶小梅, 鄭志涌, 陳興旺. 家族性玻璃體淀粉樣變性甲狀腺激素結合蛋白基因突變及表達研究. 中華眼底病雜志, 2015, 31(3): 248-251. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.03.009 復制
家族性玻璃體淀粉樣變性(FTA)與甲狀腺激素結合蛋白(TTR)基因突變密切相關，目前已知和淀粉樣蛋白形成相關的TTR基因突變約有113個[1]。國內對FTA的研究更多集中在基因突變位點的檢測[2]，而針對患者及其未發病家系成員血細胞、血清中mRNA和蛋白表達的研究還不多見。為此，我們對來自同一家系的FTA患者及尚未發病的家庭成員進行了TTR基因測序，在發現其存在基因突變的基礎上，再對mRNA和蛋白表達進行了檢測，以期深入探討TTR基因突變與玻璃體淀粉樣變性的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2012年12月至2013年10月在遵義醫學院附屬醫院眼科診治且來自同一家系的FTA患者7例(發病組)以及家系中未發病成員19名(未發病組)納入本研究(圖 1)。發病組中，男性5例，女性2例；平均年齡(46.7±7.7)歲。未發病組中，男性7名，女性2名；平均年齡(26.1±10.3)歲。選取與該家系來自同一地區的正常健康者9名作為對照組。其中，男性5名，女性4名；平均年齡(30.7±12.9)歲。
圖1
家族性玻璃體淀粉樣變性家系圖。所有受檢者均行全身體格、常規心電圖、胸部X線片、視力、裂隙燈顯微鏡、眼壓、間接檢眼鏡及眼部B型超聲檢查。未發病組及對照組受檢者各項檢查均正常。患者全身體格、常規心電圖及胸部X線片檢查正常；眼部檢查僅發現玻璃體呈灰白色絨狀混濁、稠厚，夾雜有高密度白色斑點；玻璃體標本剛果紅染色呈現特征性紅色。參照文獻[3]確立本組患者的納入標準：(1)?所有患者來自同一家系；(2)?手術中切取的玻璃體標本經剛果紅染色均呈特征性紅色；(3)?玻璃體灰白色致密混濁，其間可夾雜有高密度白色混濁斑點，混濁物可與晶狀體后囊及視網膜粘連緊密；(4)?隨著病程增加玻璃體混濁加重；(5)?可伴或不伴大腦、腎臟、心臟、消化系統及多神經病變的全身淀粉樣變性，皮膚、喉等眼部以外其他部位淀粉樣變性。排除葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷等導致玻璃體混濁者。
本研究遵循赫爾辛基宣言，取得所有受檢者的知情同意后采集其外周靜脈全血2 ml。離心收集細胞核沉淀，按照全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術公司)說明書操作，提取DNA溶于四溴乙烷中，檢測其濃度。采用逆轉錄(RT)聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本Takara公司)擴增TTR基因外顯子1~4，引物設計與合成均由北京英駿公司完成。外顯子1：上游引物5′-GAACGAATGTTCCGATGCT CTA-3′，下游引物5′-ACCCTTGCCCTAGTAATA AAAGC-3′，擴增片段長度為383堿基對(bp)；外顯子2：上游引物5′-CTTGTTTCGCTCCAGATTTCTA-3′，下游引物5′-TGCTCAGGTTCCTGGTCACT-3′，擴增片段長度為419 bp；外顯子3：上游引物5′-CTCA CTTAGTTGAGGGGAAATG-3′，下游引物5′-AGG GAACCTTTGGTCATTCATC-3′，擴增片段長度為400 bp；外顯子4：上游引物5′-TTAGCTTGCCAGCA TATTTGAG-3′，下游引物5′-AGAAATGCCCACA GTAAAGAAGT-3′，擴增片段長度為708 bp。PCR擴增完畢，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，純化后使用3730XL型DNA測序儀進行測序。采用熒光標記法進行正向測序，DNAMAN Windows 5.2.2.0漢化版軟件和Chromas測序圖分析軟件對結果進行分析。并將其與Genebank、正常人類TTR基因完全序列的4個外顯子進行完全比對[4]。
按照Trizol提取總RNA試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取外周血中總RNA。取5μg總RNA，按照RT試劑盒說明書進行加樣操作，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參。TTR：上游引物5′-CCATCCCTCGTCCTTCAGGTCCA-3，下游引物5′-CTGTCCGAGGCAGTCCTGCC-3′。GAPDH：上游引物5′-AGCGTCAAAGGTGGAGGGAGTGG-3′，下游引物5′-TCAAGGGCATCCTGGGCTACAC-3′。反應條件為95℃3 min，95℃10 s，55℃30 s，共40個循環，最后72℃5 min。每個待測基因設3個復孔。采用SYBR Seclect Master Mix系統對cDNA行實時熒光定量PCR，檢測TTR mRNA的表達。數據經Sequence Detection Software 1.3系統處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計算各組間的倍數關系。
采用蛋白免疫印跡法檢測3組受檢者血清中TTR蛋白表達。取外周血離心后取血漿，制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，每孔加樣40μg進行電泳。300 mA濕轉80 min，將聚偏氟乙烯膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h后分別加入抗人TTR(1∶1000)單克隆抗體至抗體稀釋液中，4℃過夜，用洗膜緩沖液(TBST)洗滌3次，每次5 min；放入二抗辣根酶標記山羊抗兔(1∶5000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。采用增強化學發光法檢測目的條帶，Image-Pro Plus 10.0圖像分析軟件對目的條帶進行分析。
采用SPSS 17.0統計軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差(
2 結果
測序分析結果顯示，發病組及未發病組所有受檢者TTR外顯子1~4的測試長度均與Genebank和參考序一致。外顯子1、2、4的測序結果與正常序列一致。發病組7例、未發病組3名受檢者TTR外顯子3的107位堿基出現雜合突變，由G變為C，出現套峰(圖 2)；即第83氨基酸的密碼子發生堿基突變，由GGC突變成CGC，甘氨酸突變為精氨酸(Gly83Arg)，其氨基酸的極性由中性轉變為堿性。其他受檢者未發現該位點基因突變(圖 3)。
圖2
發病組、未發病組受檢者TTR外顯子3測序圖。107位堿基處出現雜合突變，呈套峰(黑箭)第83氨基酸的密碼子由GGC突變成CGC，即Gly83Arg
圖3
對照組TTR外顯子3測序圖。107位堿基處未見突變(黑箭)
發病組、未發病組及對照組受檢者血細胞中TTR mRNA表達比較，差異有統計學意義(F=24.564，P=0.000)。組間兩兩比較結果顯示，發病組患者TTR mRNA表達均較未發病組、對照組低，差異有統計學意義(P=0.032、0.001)；未發病組受檢者血細胞中TTR mRNA表達較對照組低，差異有統計學意義(P=0.001)(圖 4)。
圖4
3組受檢者血細胞中TTR mRNA表達比較。*與對照組比較，P＜0.05；#與未發病組比較，P＜0.05
發病組、未發病組及對照組受檢者血清中TTR蛋白表達比較，差異有統計學意義(F=7.670，P=0.005)。組間兩兩比較結果顯示，發病組患者血清中TTR蛋白表達均較未發病組、對照組低，差異有統計學意義(P=0.035、0.038)；未發病組與對照組受檢者血清中TTR蛋白表達比較，差異無統計學意義(P=0.491)(圖 5)。
圖5
3組受檢者血清中TTR蛋白表達比較。*與對照組比較，P＜0.05；#與未發病組比較，P＜0.05
3 討論
本組患者玻璃體呈灰白色絨狀混濁、稠厚，夾雜有高密度的白色斑點；玻璃體標本剛果紅染色均呈陽性。其臨床表現及實驗檢查結果均符合FTA的診斷[3]。
FTA是不可溶性纖維異常沉積在多個組織器官，引起組織、器官結構的損傷和功能的紊亂，與TTR基因突變密切相關[5]。致病性的突變主要導致神經性病變、心肌淀粉樣變性以及視網膜病變[6]。目前已知可出現眼部病變的TTR基因突變有Cys10Arg、Val30Met、Val30Gly、Phe33Ile Ala36Pro、Trp41Leu、Glu54Gly、Leu58Arg、Lys70Asn、Val71Ala、Tyr78Phe、Ile84Ser Ile84Asn、Tyr114Cys、Val30Met+Arg104His等[7, 8]。最新研究發現，中國人群中TTR Ala36Pro突變同樣可致玻璃體淀粉樣變性[9]。為排除單核苷酸多態性和環境導致的基因突變，我們同時納入了該家系中尚未發病的19名成員及與之生活在同一地區的9名正常健康者進行了DNA測序。發現所有患者及3名未發病家系成員均在第3外顯子107位堿基出現雜合突變，即Gly83Arg。該結果與陳凌燕等[10]報道的突變位點相同，但其形式有所不同。既往謝兵等[3]報道8例患者發生了Gly83Arg雜合突變。本研究發現的突變位點及形式與之一致，但不同的是我們在未發病的3名家系成員中也發現了相同改變。我們分析認為該家系玻璃體淀粉樣變性的發生與Gly83Arg突變有關，但有關其表現形式為何有異于陳凌燕等[10]報道結果以及已經存在基因突變者為何尚未出現玻璃體淀粉樣變性的原因還有待進一步研究。
FTA不僅可引起外周神經病變和心肌病變，大約10%的患者還可伴發眼部異常[1]，但僅以眼部玻璃體淀粉樣變性為唯一臨床癥狀的家族性病例還較為少見[11, 12]。本組患者無其他異常，僅以玻璃體淀粉樣變性為唯一臨床癥狀。其TTR第3外顯子的107位堿基出現雜合突變，由G變為C，出現套峰，第83氨基酸的密碼子發生堿基突變，由GGC突變成CGC，即Gly83Arg，其氨基酸的極性由中性轉變為堿性。這可能導致TTR在蛋白折疊中發生異常，從而特異性的沉積在玻璃體，導致患者僅以玻璃體淀粉樣變為唯一臨床癥狀。
TTR蛋白主要在肝臟合成，少數在脈絡叢和視網膜細胞中合成[13, 14]。有研究發現，日本和葡萄牙家族性淀粉樣神經病變(FAP)TTR V30M患者血清中TTR含量顯著降低[15, 16]。Buxbaum等[17]對42例瑞典TTR V30M的攜帶者和來自相同地方的16名正常人進行血清TTR檢測，發現正常人血清TTR顯著高于TTR V30M攜帶者。與之相似，我們也發現發病患者血細胞中TTR mRNA和血清中TTR蛋白表達較未發病家系成員和對照組受檢者降低。此外，我們還發現盡管有3名未發病家系成員的TTR基因第3外顯子發生突變，其TTR mRNA表達較對照組明顯降低，但蛋白表達卻未發生明顯變化。但造成這一現象的原因目前并不確切，有待今后研究進一步探討分析。
家族性玻璃體淀粉樣變性(FTA)與甲狀腺激素結合蛋白(TTR)基因突變密切相關，目前已知和淀粉樣蛋白形成相關的TTR基因突變約有113個[1]。國內對FTA的研究更多集中在基因突變位點的檢測[2]，而針對患者及其未發病家系成員血細胞、血清中mRNA和蛋白表達的研究還不多見。為此，我們對來自同一家系的FTA患者及尚未發病的家庭成員進行了TTR基因測序，在發現其存在基因突變的基礎上，再對mRNA和蛋白表達進行了檢測，以期深入探討TTR基因突變與玻璃體淀粉樣變性的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
2012年12月至2013年10月在遵義醫學院附屬醫院眼科診治且來自同一家系的FTA患者7例(發病組)以及家系中未發病成員19名(未發病組)納入本研究(圖 1)。發病組中，男性5例，女性2例；平均年齡(46.7±7.7)歲。未發病組中，男性7名，女性2名；平均年齡(26.1±10.3)歲。選取與該家系來自同一地區的正常健康者9名作為對照組。其中，男性5名，女性4名；平均年齡(30.7±12.9)歲。
圖1
家族性玻璃體淀粉樣變性家系圖。所有受檢者均行全身體格、常規心電圖、胸部X線片、視力、裂隙燈顯微鏡、眼壓、間接檢眼鏡及眼部B型超聲檢查。未發病組及對照組受檢者各項檢查均正常。患者全身體格、常規心電圖及胸部X線片檢查正常；眼部檢查僅發現玻璃體呈灰白色絨狀混濁、稠厚，夾雜有高密度白色斑點；玻璃體標本剛果紅染色呈現特征性紅色。參照文獻[3]確立本組患者的納入標準：(1)?所有患者來自同一家系；(2)?手術中切取的玻璃體標本經剛果紅染色均呈特征性紅色；(3)?玻璃體灰白色致密混濁，其間可夾雜有高密度白色混濁斑點，混濁物可與晶狀體后囊及視網膜粘連緊密；(4)?隨著病程增加玻璃體混濁加重；(5)?可伴或不伴大腦、腎臟、心臟、消化系統及多神經病變的全身淀粉樣變性，皮膚、喉等眼部以外其他部位淀粉樣變性。排除葡萄膜炎、玻璃體積血、Terson綜合征以及眼外傷等導致玻璃體混濁者。
本研究遵循赫爾辛基宣言，取得所有受檢者的知情同意后采集其外周靜脈全血2 ml。離心收集細胞核沉淀，按照全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術公司)說明書操作，提取DNA溶于四溴乙烷中，檢測其濃度。采用逆轉錄(RT)聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本Takara公司)擴增TTR基因外顯子1~4，引物設計與合成均由北京英駿公司完成。外顯子1：上游引物5′-GAACGAATGTTCCGATGCT CTA-3′，下游引物5′-ACCCTTGCCCTAGTAATA AAAGC-3′，擴增片段長度為383堿基對(bp)；外顯子2：上游引物5′-CTTGTTTCGCTCCAGATTTCTA-3′，下游引物5′-TGCTCAGGTTCCTGGTCACT-3′，擴增片段長度為419 bp；外顯子3：上游引物5′-CTCA CTTAGTTGAGGGGAAATG-3′，下游引物5′-AGG GAACCTTTGGTCATTCATC-3′，擴增片段長度為400 bp；外顯子4：上游引物5′-TTAGCTTGCCAGCA TATTTGAG-3′，下游引物5′-AGAAATGCCCACA GTAAAGAAGT-3′，擴增片段長度為708 bp。PCR擴增完畢，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，純化后使用3730XL型DNA測序儀進行測序。采用熒光標記法進行正向測序，DNAMAN Windows 5.2.2.0漢化版軟件和Chromas測序圖分析軟件對結果進行分析。并將其與Genebank、正常人類TTR基因完全序列的4個外顯子進行完全比對[4]。
按照Trizol提取總RNA試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書提取外周血中總RNA。取5μg總RNA，按照RT試劑盒說明書進行加樣操作，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參。TTR：上游引物5′-CCATCCCTCGTCCTTCAGGTCCA-3，下游引物5′-CTGTCCGAGGCAGTCCTGCC-3′。GAPDH：上游引物5′-AGCGTCAAAGGTGGAGGGAGTGG-3′，下游引物5′-TCAAGGGCATCCTGGGCTACAC-3′。反應條件為95℃3 min，95℃10 s，55℃30 s，共40個循環，最后72℃5 min。每個待測基因設3個復孔。采用SYBR Seclect Master Mix系統對cDNA行實時熒光定量PCR，檢測TTR mRNA的表達。數據經Sequence Detection Software 1.3系統處理，按照公式RQ=2-ΔΔCT計算各組間的倍數關系。
采用蛋白免疫印跡法檢測3組受檢者血清中TTR蛋白表達。取外周血離心后取血漿，制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，每孔加樣40μg進行電泳。300 mA濕轉80 min，將聚偏氟乙烯膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h后分別加入抗人TTR(1∶1000)單克隆抗體至抗體稀釋液中，4℃過夜，用洗膜緩沖液(TBST)洗滌3次，每次5 min；放入二抗辣根酶標記山羊抗兔(1∶5000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。采用增強化學發光法檢測目的條帶，Image-Pro Plus 10.0圖像分析軟件對目的條帶進行分析。
采用SPSS 17.0統計軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差(
2 結果
測序分析結果顯示，發病組及未發病組所有受檢者TTR外顯子1~4的測試長度均與Genebank和參考序一致。外顯子1、2、4的測序結果與正常序列一致。發病組7例、未發病組3名受檢者TTR外顯子3的107位堿基出現雜合突變，由G變為C，出現套峰(圖 2)；即第83氨基酸的密碼子發生堿基突變，由GGC突變成CGC，甘氨酸突變為精氨酸(Gly83Arg)，其氨基酸的極性由中性轉變為堿性。其他受檢者未發現該位點基因突變(圖 3)。
圖2
發病組、未發病組受檢者TTR外顯子3測序圖。107位堿基處出現雜合突變，呈套峰(黑箭)第83氨基酸的密碼子由GGC突變成CGC，即Gly83Arg
圖3
對照組TTR外顯子3測序圖。107位堿基處未見突變(黑箭)
發病組、未發病組及對照組受檢者血細胞中TTR mRNA表達比較，差異有統計學意義(F=24.564，P=0.000)。組間兩兩比較結果顯示，發病組患者TTR mRNA表達均較未發病組、對照組低，差異有統計學意義(P=0.032、0.001)；未發病組受檢者血細胞中TTR mRNA表達較對照組低，差異有統計學意義(P=0.001)(圖 4)。
圖4
3組受檢者血細胞中TTR mRNA表達比較。*與對照組比較，P＜0.05；#與未發病組比較，P＜0.05
發病組、未發病組及對照組受檢者血清中TTR蛋白表達比較，差異有統計學意義(F=7.670，P=0.005)。組間兩兩比較結果顯示，發病組患者血清中TTR蛋白表達均較未發病組、對照組低，差異有統計學意義(P=0.035、0.038)；未發病組與對照組受檢者血清中TTR蛋白表達比較，差異無統計學意義(P=0.491)(圖 5)。
圖5
3組受檢者血清中TTR蛋白表達比較。*與對照組比較，P＜0.05；#與未發病組比較，P＜0.05
3 討論
本組患者玻璃體呈灰白色絨狀混濁、稠厚，夾雜有高密度的白色斑點；玻璃體標本剛果紅染色均呈陽性。其臨床表現及實驗檢查結果均符合FTA的診斷[3]。
FTA是不可溶性纖維異常沉積在多個組織器官，引起組織、器官結構的損傷和功能的紊亂，與TTR基因突變密切相關[5]。致病性的突變主要導致神經性病變、心肌淀粉樣變性以及視網膜病變[6]。目前已知可出現眼部病變的TTR基因突變有Cys10Arg、Val30Met、Val30Gly、Phe33Ile Ala36Pro、Trp41Leu、Glu54Gly、Leu58Arg、Lys70Asn、Val71Ala、Tyr78Phe、Ile84Ser Ile84Asn、Tyr114Cys、Val30Met+Arg104His等[7, 8]。最新研究發現，中國人群中TTR Ala36Pro突變同樣可致玻璃體淀粉樣變性[9]。為排除單核苷酸多態性和環境導致的基因突變，我們同時納入了該家系中尚未發病的19名成員及與之生活在同一地區的9名正常健康者進行了DNA測序。發現所有患者及3名未發病家系成員均在第3外顯子107位堿基出現雜合突變，即Gly83Arg。該結果與陳凌燕等[10]報道的突變位點相同，但其形式有所不同。既往謝兵等[3]報道8例患者發生了Gly83Arg雜合突變。本研究發現的突變位點及形式與之一致，但不同的是我們在未發病的3名家系成員中也發現了相同改變。我們分析認為該家系玻璃體淀粉樣變性的發生與Gly83Arg突變有關，但有關其表現形式為何有異于陳凌燕等[10]報道結果以及已經存在基因突變者為何尚未出現玻璃體淀粉樣變性的原因還有待進一步研究。
FTA不僅可引起外周神經病變和心肌病變，大約10%的患者還可伴發眼部異常[1]，但僅以眼部玻璃體淀粉樣變性為唯一臨床癥狀的家族性病例還較為少見[11, 12]。本組患者無其他異常，僅以玻璃體淀粉樣變性為唯一臨床癥狀。其TTR第3外顯子的107位堿基出現雜合突變，由G變為C，出現套峰，第83氨基酸的密碼子發生堿基突變，由GGC突變成CGC，即Gly83Arg，其氨基酸的極性由中性轉變為堿性。這可能導致TTR在蛋白折疊中發生異常，從而特異性的沉積在玻璃體，導致患者僅以玻璃體淀粉樣變為唯一臨床癥狀。
TTR蛋白主要在肝臟合成，少數在脈絡叢和視網膜細胞中合成[13, 14]。有研究發現，日本和葡萄牙家族性淀粉樣神經病變(FAP)TTR V30M患者血清中TTR含量顯著降低[15, 16]。Buxbaum等[17]對42例瑞典TTR V30M的攜帶者和來自相同地方的16名正常人進行血清TTR檢測，發現正常人血清TTR顯著高于TTR V30M攜帶者。與之相似，我們也發現發病患者血細胞中TTR mRNA和血清中TTR蛋白表達較未發病家系成員和對照組受檢者降低。此外，我們還發現盡管有3名未發病家系成員的TTR基因第3外顯子發生突變，其TTR mRNA表達較對照組明顯降低，但蛋白表達卻未發生明顯變化。但造成這一現象的原因目前并不確切，有待今后研究進一步探討分析。
