引用本文： 底煜, 張軼歐, 陳曉隆. 特異性抑制富含半胱氨酸蛋白61干擾RNA對小鼠視網膜新生血管形成的抑制作用觀察. 中華眼底病雜志, 2015, 31(1): 72-76. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.01.018 復制
血管內皮生長因子(VEGF)是視網膜新生血管(RNV)形成過程中最為密切的細胞因子[1]。抑制VEGF信號途徑能有效抑制RNV的形成[2]。有研究發現，富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61，即CCN1)可通過磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(Akt)信號通路促進VEGF的表達, 從而調節腫瘤新生血管的形成[3]。在氧誘導小鼠視網膜病變(OIR)模型中，小鼠視網膜病變與CCN1的表達水平有關[2]。本研究通過建立OIR小鼠模型，玻璃體腔注射CCN1siRNA，觀察其對高氧誘導的小鼠RNV的抑制作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J新生小鼠120只, 7日齡，雌雄不限，清潔級，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。所有實驗動物、實驗操作和實驗使用條件均遵循中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關規定。聚腺苷二磷酸酶(ADP酶，美國Sigma公司)；陽離子脂質體(LipofectamineTM 2000，美國Invitrogen公司)；CCN1siRNA質粒(上海GenePharma公司合成)；兔抗人CCN1多克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體(美國Santa Cruze公司)；聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa生物工程有限公司)；PCR引物(上海英駿生物技術有限公司合成)；鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。
采用隨機數字表法將120只7日齡小鼠分為對照組和實驗組，每組均為60只。參照Smith等[4]方法制作OIR模型。出氧箱前1 d即鼠齡11 d時，對照組和實驗組小鼠玻璃體腔內分別注射脂質體LipofectamineTM2000介導的空載體質粒1μl和500 ng/μl的CCN1siRNA表達質粒1μl。注射后立即放回氧箱，1 d后即鼠齡12 d時重新出氧箱。所有小鼠均取左眼為實驗眼，右眼不作任何處理。
實時PCR(RT-PCR)檢測重組質粒及mRNA的表達。轉染后1 d即鼠齡12 d時，分別隨機選取對照組、實驗組小鼠10只，過量麻醉處死，摘除左眼球，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。根據引物設計的原則，設計針對小鼠CCN1和β-肌動蛋白(actin)的特異性引物。CCN1引物序列:F: 5′-AGACCCTGTGA ATATAACTCCA-3′, R: 5′-AATTGCGATTAAC TCATTGTTT-3′，擴增產物為300堿基對(bp)；β-actin為內參照，引物序列:F:5′-GAGAGGGAAA TCGTGCGTGA-3′，R: 5′-GCCTAGAAGCATT TGCGGTG-3′，擴增產物為518 bp。反應條件:預熱95℃30 s，二步法，95℃5 s，60℃31 s，50個循環。瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察電泳結果并掃描入電腦。采用β-actin作為內參照, CCN1 mRNA的相對表達量為實驗組目的基因表達量是對照組的倍數，即2-ΔΔCt值, ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)[5]。抑制效率=(對照組CCN1mRNA相對表達量-實驗組CCN1mRNA相對表達量)/對照組CCN1mRNA相對表達量×100%。
鼠齡17 d時，過量麻醉處死所有小鼠，立即摘除眼球。
視網膜鋪片法觀察血管的形態學變化。分別隨機選取兩組小鼠10只眼球，去除眼前節，完整游離視網膜組織，放射狀切開4刀, 鋪片后光學顯微鏡下觀察視網膜血管發育及增生情況并拍照[6]。
視網膜血管內皮細胞核計數。分別隨機選取兩組小鼠10只眼球，固定, 作6μm厚的連續切片。每只眼球取10張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。隨機、雙盲法光學顯微鏡下計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數[7]。
免疫組織化學法檢測CCN1、VEGF蛋白的表達。分別隨機抽選兩組小鼠10張未經染色的切片，按照SABC免疫組織化學試劑盒說明書進行染色。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照, 二氨基聯苯胺(DAB)顯色。使用Lecia DM400B數字顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析軟件分析CCN1、VEGF表達。每組切片隨機抽取10張，每張切片于高倍鏡下選擇3處不同視野，測定圖像中有棕黃色或棕褐色陽性反應部位的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，記為CCN1、VEGF表達值。
蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測CCN1、VEGF蛋白表達。分別隨機選取兩組小鼠15只眼球，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。按照試劑盒說明書提取視網膜總蛋白，電泳、轉膜、相應抗體進行免疫雜交，然后進行化學發光、顯影和定影。采用Chemi Imager 5500 V2.03圖像分析系統進行灰度分析, 以β-actin作為內參照，目的蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。抑制效率=(對照組蛋白相對表達量-實驗組蛋白相對表達量)/對照組蛋白相對表達量×100%。
RT-PCR檢測CCN1、VEGF mRNA的表達。分別隨機選取兩組小鼠15只眼球，麻醉處死后，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。按照試劑盒說明書提取視網膜總RNA。CCN1和β-actin的引物序列同前；VEGF的引物序列: F: 5′-CCCGACAGGGAAGA CAAT-3′，R: 5′-TCTGGAAGTGAGCCAACG-3′, 擴增產物為131 bp。實驗方法同前。采用β-actin作為內參照, CCN1、VEGF mRNA的相對表達量為實驗組目的基因表達量是對照組的倍數，即2-ΔΔCt值, ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)。抑制效率=(對照組mRNA相對表達量-實驗組mRNA相對表達量)/對照組mRNA相對表達量×100%。
采用SPSS統計13.0軟件進行統計學分析處理。各組測試指標的數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，經Levene檢驗方差齊，以均數±標準差(
2 結果
轉染后1 d, 實驗組可見CCN1siRNA重組質粒的擴增條帶(圖 1)。實驗組、對照組CCN1mRNA相對表達量分別為1.25±0.09、2.22±0.07。實驗組CCN1mRNA相對表達量較對照組顯著下調，差異有統計學意義(t=5.652, P＜0.05)；抑制效率為44.6%。
圖1
RT-PCR電泳圖。M:DL 2000 DNA marker; 1.實驗組; 2.對照組
視網膜鋪片檢查結果顯示，對照組小鼠自視盤發出的視網膜血管紆曲擴張，大片無灌注區，新生血管形成(圖 2A)；實驗組小鼠視網膜血管分布規則、分支良好、新生血管密度明顯減少(圖 2B)。
圖2
小鼠視網膜血管鋪片光學顯微像。A.對照組，可見大片無灌注區, 大量新生血管形成(白箭)；B.實驗組，視網膜血管分布規則、分支良好、新生血管密度明顯減少(白箭) ADP×100
光學顯微鏡觀察結果顯示，對照組小鼠可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核, 單獨或成簇出現(圖 3A)；實驗組小鼠突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數明顯減少(圖 3B)。對照組、實驗組平均每個切面突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核分別為(30.13±1.56)、(10.23±1.48)個。兩組間突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數量比較，差異有統計學意義(t=8.756, P＜0.05)。
圖3
視網膜組織切片光學顯微鏡像。3A.對照組，可見大量突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(黑箭)；3B.實驗組，突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核明顯減少(黑箭) HE×400
免疫組織化學檢測結果顯示，對照組小鼠視網膜CCN1、VEGF蛋白表達呈強陽性，主要位于神經節細胞層、內叢狀層、外從狀層和突破視網膜內界膜的新生血管(圖 4A, 4B)；實驗組小鼠視網膜CCN1、VEGF蛋白在神經節細胞層、內叢狀層和外從狀層的表達明顯減弱(圖 4C, 4D)。陰性對照未見CCN1、VEGF的棕黃色或棕褐色顆粒表達(圖 4E, 4F)。對照組、實驗組CCN1蛋白表達量分別為12.13±2.34、7.23±1.35；VEGF蛋白表達量分別為18.44±2.61、9.51±2.15。兩組間CCN1、VEGF蛋白量表達量比較，差異均有統計學意義(t=3.253、5.365, P＜0.05)。
圖4
視網膜免疫組織化學染色像。4A、4B.對照組，CCN1(4A)、VEGF(4B)在神經節細胞層、內叢狀層、外從狀層和突破視網膜內界膜的新生血管中表達增強(黑箭)；4C、4D.實驗組，CCN1(4C)、VEGF(4D)在神經節細胞層、內叢狀層和外從狀層有少量微弱表達(黑箭)；4E、4F.陰性對照，未見CCN1(4E)、VEGF(4F)表達DAB×400 ??圖 5 Western blot檢測圖?? 圖 6 對照組、實驗組小鼠視網膜中CCN1、VEGF蛋白表達比較。*P＜0.05 ??圖 7 對照組、實驗組小鼠視網膜中CCN1、VEGF mRNA表達比較。*P＜0.05
Western-blot檢測結果顯示，對照組、實驗組CCN1蛋白相對表達量分別為0.34±0.03、0.16±0.02；VEGF蛋白相對表達量分別為0.53±0.01、0.36±0.01。CCN1、VEGF蛋白抑制效率分別為51.51%、32.08%。兩組間CCN1、VEGF蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=4.573、5.323, P＜0.05)(圖 5, 6)。
RT-PCR檢測結果顯示，對照組、實驗組小鼠視網膜CCN1 mRNA相對表達量分別為0.99±0.06、0.62±0.08；VEGF mRNA相對表達量分別為1.00±0.07、0.52±0.07。CCN1、VEGFmRNA抑制效率分別為37.37%、47.47%。兩組間CCN1、VEGFmRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=6.724、9.153, P＜0.05)(圖 7)。
3 討論
CCN1蛋白是一種基質細胞蛋白，參與調節細胞的增生、黏附、遷移、分化、凋亡，以及細胞外基質的生成，在生物發育、軟骨生成、血管生成、腫瘤形成、創傷修復和血管性疾病中起到一定的作用[8]。同時，CCN1還可以通過調節其他血管生成因子包括VEGF(VEGF-A、VEGF-C)，以及Ⅰ型膠原、基質金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(MMP1、MMP3、TIMPs)等的表達和活性，間接地促進血管生成和基質重建[9, 10], 但其相互作用的具體途徑仍需要進一步研究。目前研究發現，CCN1在多種腫瘤的發病中起著重要的作用，其主要機制在于參與腫瘤內血管的生成，CCN1的表達與腫瘤的惡性程度和預后相關[11, 12]。另外研究表明，CCN1的過量表達還可激活PI3K/Akt信號通路，誘導腫瘤生成[13]。而眼部新生血管性病變的血管生成過程與上述情況類似, 但有關CCN1在眼部新生血管性疾病中的作用及目前研究還比較少。
本研究結果顯示，實驗組視網膜血管分布規則、分支良好；與對照組比較，新生血管叢明顯減少，CCN1、VEGF蛋白、mRNA的表達水平顯著下調。從形態學及分子生物學證實玻璃體腔注射脂質體介導CCN1siRNA表達質粒能有效地抑制ROP模型鼠中RNV的發生。推斷可能與玻璃體腔注射的CCN1siRNA能成功地進入產生CCN1的視網膜“靶”細胞有關。有文獻報道，鼠RNV模型中CCN1表達升高的部位主要位于視網膜神經節細胞所在的內層視網膜組織[14]。而玻璃體腔注射陽離子脂質體包裹的質粒能成功地完成玻璃體腔擴散、穿透視網膜內界膜并在視網膜組織中擴散等過程，最終被視網膜神經節細胞所吸收[15]。Masuda等[16]研究發現，玻璃體腔注射只需1d即可將外源性基因轉染至視網膜神經節細胞。我們采用目前眼科領域常用的脂質體LipofectamineTM2000介導通過玻璃體腔注射CCN1siRNA質粒轉染小鼠視網膜，1d后經RT-PCR分析驗證視網膜可見重組質粒的表達。進一步證實了本研究所采用的轉染方法的有效性。因此，玻璃體腔注射的脂質體介導CCN1siRNA表達質粒能成功地進入產生CCN1的視網膜細胞，達到從源頭切斷CCN1產生的作用，起到明顯抑制RNV發生的效果。
本研究結果顯示，CCN1siRNA在鼠齡17 d即視網膜新生血管形成達到高峰時，可以抑制CCN1、VEGF的表達，但不能完全抑制；同時，從形態學及病理學方面也證實CCN1siRNA尚不能完全抑制視網膜新生血管的發生。其原因可能與RNV的發生除了CCN1外仍有其他因子參與有關[17]；同時CCN1siRNA在視網膜中的轉染效率[18, 19]、劑量以及注射的次數等也是相關因素，尚需進一步觀察研究。另外, 本研究中實驗組視網膜切片中未見炎癥反應和細胞毒性反應, 并且正常視網膜血管的生成未受影響, 說明玻璃體腔內注射CCN1siRNA抑制小鼠ROP模型RNV的生成可能是安全有效的。
文獻報道，VEGF在多種視網膜血管性疾病中表達增加，是RNV形成的關鍵因素[20, 21]。Heidary等[1]發現在小鼠OIR模型中，由于低氧誘導視網膜CCN1表達增強，CCN1進而促使其下游基因VEGF表達增強。本研究結果推測，通過RNAi干擾技術抑制CCN1的表達，可能通過下調PI3K/Akt信號通路從而下調視網膜VEGF的表達，進而抑制RNV的發生。
血管內皮生長因子(VEGF)是視網膜新生血管(RNV)形成過程中最為密切的細胞因子[1]。抑制VEGF信號途徑能有效抑制RNV的形成[2]。有研究發現，富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61，即CCN1)可通過磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(Akt)信號通路促進VEGF的表達, 從而調節腫瘤新生血管的形成[3]。在氧誘導小鼠視網膜病變(OIR)模型中，小鼠視網膜病變與CCN1的表達水平有關[2]。本研究通過建立OIR小鼠模型，玻璃體腔注射CCN1siRNA，觀察其對高氧誘導的小鼠RNV的抑制作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J新生小鼠120只, 7日齡，雌雄不限，清潔級，由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供。所有實驗動物、實驗操作和實驗使用條件均遵循中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關規定。聚腺苷二磷酸酶(ADP酶，美國Sigma公司)；陽離子脂質體(LipofectamineTM 2000，美國Invitrogen公司)；CCN1siRNA質粒(上海GenePharma公司合成)；兔抗人CCN1多克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體(美國Santa Cruze公司)；聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa生物工程有限公司)；PCR引物(上海英駿生物技術有限公司合成)；鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。
采用隨機數字表法將120只7日齡小鼠分為對照組和實驗組，每組均為60只。參照Smith等[4]方法制作OIR模型。出氧箱前1 d即鼠齡11 d時，對照組和實驗組小鼠玻璃體腔內分別注射脂質體LipofectamineTM2000介導的空載體質粒1μl和500 ng/μl的CCN1siRNA表達質粒1μl。注射后立即放回氧箱，1 d后即鼠齡12 d時重新出氧箱。所有小鼠均取左眼為實驗眼，右眼不作任何處理。
實時PCR(RT-PCR)檢測重組質粒及mRNA的表達。轉染后1 d即鼠齡12 d時，分別隨機選取對照組、實驗組小鼠10只，過量麻醉處死，摘除左眼球，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。根據引物設計的原則，設計針對小鼠CCN1和β-肌動蛋白(actin)的特異性引物。CCN1引物序列:F: 5′-AGACCCTGTGA ATATAACTCCA-3′, R: 5′-AATTGCGATTAAC TCATTGTTT-3′，擴增產物為300堿基對(bp)；β-actin為內參照，引物序列:F:5′-GAGAGGGAAA TCGTGCGTGA-3′，R: 5′-GCCTAGAAGCATT TGCGGTG-3′，擴增產物為518 bp。反應條件:預熱95℃30 s，二步法，95℃5 s，60℃31 s，50個循環。瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察電泳結果并掃描入電腦。采用β-actin作為內參照, CCN1 mRNA的相對表達量為實驗組目的基因表達量是對照組的倍數，即2-ΔΔCt值, ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)[5]。抑制效率=(對照組CCN1mRNA相對表達量-實驗組CCN1mRNA相對表達量)/對照組CCN1mRNA相對表達量×100%。
鼠齡17 d時，過量麻醉處死所有小鼠，立即摘除眼球。
視網膜鋪片法觀察血管的形態學變化。分別隨機選取兩組小鼠10只眼球，去除眼前節，完整游離視網膜組織，放射狀切開4刀, 鋪片后光學顯微鏡下觀察視網膜血管發育及增生情況并拍照[6]。
視網膜血管內皮細胞核計數。分別隨機選取兩組小鼠10只眼球，固定, 作6μm厚的連續切片。每只眼球取10張切片行蘇木精-伊紅(HE)染色。隨機、雙盲法光學顯微鏡下計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數[7]。
免疫組織化學法檢測CCN1、VEGF蛋白的表達。分別隨機抽選兩組小鼠10張未經染色的切片，按照SABC免疫組織化學試劑盒說明書進行染色。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照, 二氨基聯苯胺(DAB)顯色。使用Lecia DM400B數字顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析軟件分析CCN1、VEGF表達。每組切片隨機抽取10張，每張切片于高倍鏡下選擇3處不同視野，測定圖像中有棕黃色或棕褐色陽性反應部位的平均吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，記為CCN1、VEGF表達值。
蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測CCN1、VEGF蛋白表達。分別隨機選取兩組小鼠15只眼球，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。按照試劑盒說明書提取視網膜總蛋白，電泳、轉膜、相應抗體進行免疫雜交，然后進行化學發光、顯影和定影。采用Chemi Imager 5500 V2.03圖像分析系統進行灰度分析, 以β-actin作為內參照，目的蛋白的相對表達量為目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。抑制效率=(對照組蛋白相對表達量-實驗組蛋白相對表達量)/對照組蛋白相對表達量×100%。
RT-PCR檢測CCN1、VEGF mRNA的表達。分別隨機選取兩組小鼠15只眼球，麻醉處死后，手術顯微鏡下分離取出視網膜組織。按照試劑盒說明書提取視網膜總RNA。CCN1和β-actin的引物序列同前；VEGF的引物序列: F: 5′-CCCGACAGGGAAGA CAAT-3′，R: 5′-TCTGGAAGTGAGCCAACG-3′, 擴增產物為131 bp。實驗方法同前。采用β-actin作為內參照, CCN1、VEGF mRNA的相對表達量為實驗組目的基因表達量是對照組的倍數，即2-ΔΔCt值, ΔΔCt=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)。抑制效率=(對照組mRNA相對表達量-實驗組mRNA相對表達量)/對照組mRNA相對表達量×100%。
采用SPSS統計13.0軟件進行統計學分析處理。各組測試指標的數據資料經Shapiro-Wilk檢驗呈正態分布，經Levene檢驗方差齊，以均數±標準差(
2 結果
轉染后1 d, 實驗組可見CCN1siRNA重組質粒的擴增條帶(圖 1)。實驗組、對照組CCN1mRNA相對表達量分別為1.25±0.09、2.22±0.07。實驗組CCN1mRNA相對表達量較對照組顯著下調，差異有統計學意義(t=5.652, P＜0.05)；抑制效率為44.6%。
圖1
RT-PCR電泳圖。M:DL 2000 DNA marker; 1.實驗組; 2.對照組
視網膜鋪片檢查結果顯示，對照組小鼠自視盤發出的視網膜血管紆曲擴張，大片無灌注區，新生血管形成(圖 2A)；實驗組小鼠視網膜血管分布規則、分支良好、新生血管密度明顯減少(圖 2B)。
圖2
小鼠視網膜血管鋪片光學顯微像。A.對照組，可見大片無灌注區, 大量新生血管形成(白箭)；B.實驗組，視網膜血管分布規則、分支良好、新生血管密度明顯減少(白箭) ADP×100
光學顯微鏡觀察結果顯示，對照組小鼠可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核, 單獨或成簇出現(圖 3A)；實驗組小鼠突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數明顯減少(圖 3B)。對照組、實驗組平均每個切面突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核分別為(30.13±1.56)、(10.23±1.48)個。兩組間突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核數量比較，差異有統計學意義(t=8.756, P＜0.05)。
圖3
視網膜組織切片光學顯微鏡像。3A.對照組，可見大量突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(黑箭)；3B.實驗組，突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核明顯減少(黑箭) HE×400
免疫組織化學檢測結果顯示，對照組小鼠視網膜CCN1、VEGF蛋白表達呈強陽性，主要位于神經節細胞層、內叢狀層、外從狀層和突破視網膜內界膜的新生血管(圖 4A, 4B)；實驗組小鼠視網膜CCN1、VEGF蛋白在神經節細胞層、內叢狀層和外從狀層的表達明顯減弱(圖 4C, 4D)。陰性對照未見CCN1、VEGF的棕黃色或棕褐色顆粒表達(圖 4E, 4F)。對照組、實驗組CCN1蛋白表達量分別為12.13±2.34、7.23±1.35；VEGF蛋白表達量分別為18.44±2.61、9.51±2.15。兩組間CCN1、VEGF蛋白量表達量比較，差異均有統計學意義(t=3.253、5.365, P＜0.05)。
圖4
視網膜免疫組織化學染色像。4A、4B.對照組，CCN1(4A)、VEGF(4B)在神經節細胞層、內叢狀層、外從狀層和突破視網膜內界膜的新生血管中表達增強(黑箭)；4C、4D.實驗組，CCN1(4C)、VEGF(4D)在神經節細胞層、內叢狀層和外從狀層有少量微弱表達(黑箭)；4E、4F.陰性對照，未見CCN1(4E)、VEGF(4F)表達DAB×400 ??圖 5 Western blot檢測圖?? 圖 6 對照組、實驗組小鼠視網膜中CCN1、VEGF蛋白表達比較。*P＜0.05 ??圖 7 對照組、實驗組小鼠視網膜中CCN1、VEGF mRNA表達比較。*P＜0.05
Western-blot檢測結果顯示，對照組、實驗組CCN1蛋白相對表達量分別為0.34±0.03、0.16±0.02；VEGF蛋白相對表達量分別為0.53±0.01、0.36±0.01。CCN1、VEGF蛋白抑制效率分別為51.51%、32.08%。兩組間CCN1、VEGF蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=4.573、5.323, P＜0.05)(圖 5, 6)。
RT-PCR檢測結果顯示，對照組、實驗組小鼠視網膜CCN1 mRNA相對表達量分別為0.99±0.06、0.62±0.08；VEGF mRNA相對表達量分別為1.00±0.07、0.52±0.07。CCN1、VEGFmRNA抑制效率分別為37.37%、47.47%。兩組間CCN1、VEGFmRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義(t=6.724、9.153, P＜0.05)(圖 7)。
3 討論
CCN1蛋白是一種基質細胞蛋白，參與調節細胞的增生、黏附、遷移、分化、凋亡，以及細胞外基質的生成，在生物發育、軟骨生成、血管生成、腫瘤形成、創傷修復和血管性疾病中起到一定的作用[8]。同時，CCN1還可以通過調節其他血管生成因子包括VEGF(VEGF-A、VEGF-C)，以及Ⅰ型膠原、基質金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(MMP1、MMP3、TIMPs)等的表達和活性，間接地促進血管生成和基質重建[9, 10], 但其相互作用的具體途徑仍需要進一步研究。目前研究發現，CCN1在多種腫瘤的發病中起著重要的作用，其主要機制在于參與腫瘤內血管的生成，CCN1的表達與腫瘤的惡性程度和預后相關[11, 12]。另外研究表明，CCN1的過量表達還可激活PI3K/Akt信號通路，誘導腫瘤生成[13]。而眼部新生血管性病變的血管生成過程與上述情況類似, 但有關CCN1在眼部新生血管性疾病中的作用及目前研究還比較少。
本研究結果顯示，實驗組視網膜血管分布規則、分支良好；與對照組比較，新生血管叢明顯減少，CCN1、VEGF蛋白、mRNA的表達水平顯著下調。從形態學及分子生物學證實玻璃體腔注射脂質體介導CCN1siRNA表達質粒能有效地抑制ROP模型鼠中RNV的發生。推斷可能與玻璃體腔注射的CCN1siRNA能成功地進入產生CCN1的視網膜“靶”細胞有關。有文獻報道，鼠RNV模型中CCN1表達升高的部位主要位于視網膜神經節細胞所在的內層視網膜組織[14]。而玻璃體腔注射陽離子脂質體包裹的質粒能成功地完成玻璃體腔擴散、穿透視網膜內界膜并在視網膜組織中擴散等過程，最終被視網膜神經節細胞所吸收[15]。Masuda等[16]研究發現，玻璃體腔注射只需1d即可將外源性基因轉染至視網膜神經節細胞。我們采用目前眼科領域常用的脂質體LipofectamineTM2000介導通過玻璃體腔注射CCN1siRNA質粒轉染小鼠視網膜，1d后經RT-PCR分析驗證視網膜可見重組質粒的表達。進一步證實了本研究所采用的轉染方法的有效性。因此，玻璃體腔注射的脂質體介導CCN1siRNA表達質粒能成功地進入產生CCN1的視網膜細胞，達到從源頭切斷CCN1產生的作用，起到明顯抑制RNV發生的效果。
本研究結果顯示，CCN1siRNA在鼠齡17 d即視網膜新生血管形成達到高峰時，可以抑制CCN1、VEGF的表達，但不能完全抑制；同時，從形態學及病理學方面也證實CCN1siRNA尚不能完全抑制視網膜新生血管的發生。其原因可能與RNV的發生除了CCN1外仍有其他因子參與有關[17]；同時CCN1siRNA在視網膜中的轉染效率[18, 19]、劑量以及注射的次數等也是相關因素，尚需進一步觀察研究。另外, 本研究中實驗組視網膜切片中未見炎癥反應和細胞毒性反應, 并且正常視網膜血管的生成未受影響, 說明玻璃體腔內注射CCN1siRNA抑制小鼠ROP模型RNV的生成可能是安全有效的。
文獻報道，VEGF在多種視網膜血管性疾病中表達增加，是RNV形成的關鍵因素[20, 21]。Heidary等[1]發現在小鼠OIR模型中，由于低氧誘導視網膜CCN1表達增強，CCN1進而促使其下游基因VEGF表達增強。本研究結果推測，通過RNAi干擾技術抑制CCN1的表達，可能通過下調PI3K/Akt信號通路從而下調視網膜VEGF的表達，進而抑制RNV的發生。
