引用本文： 潘穎喆, 邢怡橋, 陳長征, 黎智, 王慧, 李璐, 蘇鈺. 抑制光損傷人視網膜色素上皮細胞血管內皮生長因子A的表達對趨化因子受體3配體表達的影響. 中華眼底病雜志, 2015, 31(1): 62-66. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.01.016 復制
血管內皮生長因子(VEGF)在脈絡膜新生血管(CNV)形成過程中發揮著重要的作用。趨化因子受體3(CCR3)也可在CNV中特異性表達，且其表達與CNV的發生發展可能存在相關性[1, 2]。新近研究發現，在體外培養的人視網膜色素上皮(RPE)細胞光損傷模型中，VEGF-A的表達明顯升高；CCR3的3種配體嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)-1、eotaxin-2、eotaxin-3在該模型中的表達亦持續增加[3, 4]。但兩種因子之間是否存在關聯尚不明確。為此，本研究擬通過抑制光損傷后人RPE細胞VEGF-A的表達，觀察CCR3的3種配體eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及核因子(NF)-κB的表達變化，以探討VEGF-A與CCR3配體eotaxins的表達是否存在關聯及可能的作用機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人RPE細胞株ARPE-19(美國ATCC公司)，胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)/F12(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Thermo公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(大連TaKaRa公司)，定量PCR試劑(上海TOYOBO公司)，兔抗人eotaxin-1抗體bs-1601R、兔抗人eotaxin-2抗體bs-2483R、鼠抗兔二抗bs-0295Ms、鼠抗羊二抗bs-0294Ms(北京博奧森生物技術有限公司)，羊抗人eotaxin-3抗體sc-21620(美國Santa Cruz公司)，兔抗人VEGF-A抗體BS2853、兔抗人核因子(NF)-κB-p65抗體BS1257(美國Bioworld公司)，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)試劑盒(武漢博士德生物公司)，牛血清白蛋白(武漢天源生物技術有限公司)，3, 3′, 5, 5′-四甲基聯苯胺顯色液和終止液(武漢科前動物生物制品有限公司)，人VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司)。15W藍色節能燈(荷蘭Philips公司)，MS6610數字式照度儀(深圳華誼儀表有限公司)，酶標儀(芬蘭Thermo公司)。
采用含20%胎牛血清的DMEM/F12(1 :1)培養基，以100 U/ml劑量加入青霉素、鏈霉素，再加入0.1 mmol/L非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺，在37℃、5%CO2、濕度90%的CO2培養箱中培養ARPE-19細胞。待細胞生長融合鋪滿后，加入0.25%胰蛋白酶消化液進行消化，按1 :2~1 :4細胞傳代，取第8~12代生長狀態良好的傳代細胞用于實驗。將同代細胞隨機分為正常對照組、光照損傷組和光照干預組，待其鋪滿培養皿后更換為無血清的DMEM/F12培養基。將波長為400 nm的15W藍色節能燈自制成光照器，置于培養箱頂部，采用直落式照射，用MS6610型照度計測量被照細胞平面的光強度，將細胞平面光照強度控制在(600±100)Lux，溫度變化控制在36.5~37.5℃之間。光照損傷組在持續光照12 h后停止光照，并繼續培養24 h后結束培養；光照干預組在持續光照12 h后停止光照，在培養液中加入終濃度為0.125 mg/ml的雷珠單抗繼續培養24 h后結束培養[5]；正常對照組以錫箔紙包裹培養皿避光后，置于恒溫培養箱內培養36 h后結束培養。倒置相差顯微鏡下觀察3組細胞的形態。
應用RT-PCR技術檢測結束光照24 h時3組細胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及NF-κB的mRNA表達情況。利用Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。運用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并委托上海生工生物技術服務有限公司合成。VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGG CAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTG ATGTTGGA-3′，擴增片段長度為226堿基對(bp)；eotaxin-1上游引物：5′-CCAGCTTCTGTCCCAACC AC-3′，下游引物：5′-GGAATCCTGCACCCACTTC TT-3′，擴增片段長度為180 bp；eotaxin-2上游引物：5′-CCCACCACATCATCCCTACG-3′，下游引物：5′-TTGGCGTCCAGGTTCTTCAT-3′，擴增片段長度為223 bp；eotaxin-3上游引物：5′-TCCCTCCTGAGTCT CCACCT-3′，下游引物：5′-TTCCTTGGATGGGTA CAGACTT-3′，擴增片段長度為194 bp；β-肌動蛋白上游引物：5′-GTCCACCGCAAATGCTTC TA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTT C-3′，擴增片段長度為190 bp；NF-κB上游引物：5′-AAGCACAGA TACCACTAAGACGCA-3′，下游引物：5′-GGGAAC TTGAAAGGGGTTATTGT-3′，擴增片段長度為160 bp。反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重復40個循環，72℃末段延伸5 min。采用2ΔΔCt法進行相對定量分析。各標本重復檢測3次后取其平均值。
采用ELISA檢測結束光照24 h時3組細胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達水平。取終止培養時的培養液于4℃條件下，以離心半徑6 cm、12 000 r/min高速離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書步驟進行測定。在96孔板每反應孔中分別加入標準品、樣品稀釋液和待檢上清液100μl，置室溫孵育1 h，洗滌。加酶標抗體100μl，室溫孵育1 h，洗滌。加底物液100μl室溫避光孵育，加入50μl終止液終止反應。用酶標儀在波長450 nm處測量吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，繪制標準曲線，計算各標本濃度。
應用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測結束光照24 h時3組細胞中NF-κB的蛋白表達水平。吸盡細胞培養液后，用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗。加入預冷的細胞裂解液，靜置2 h，超聲波碎核后，4℃冰凍離心機30 000×g離心1 h后取上清液，分裝置于-80℃保存。制膠，十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移，5%脫脂奶粉封閉，加入按說明書要求稀釋后的一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗，加入1 :5000比例稀釋的相應二抗孵育，漂洗。應用超敏化學發光液試劑盒顯色，在暗房內進行曝光顯影，直至條帶出現并達到合適的黑度為止。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為對照。對顯影條帶進行A值分析。
胰酶消化培養瓶中的細胞制成細胞懸液，滴于載玻片上，置培養箱中過夜，制成細胞爬片，冷乙醇室溫固定30 min；按SABC試劑盒說明書步驟進行依次抗原修復、封閉、加相應一抗、生物素標記的二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色法進行免疫組織化學染色。
采用SPSS 13.00統計軟件行統計學分析，數據以均數±標準差(
2 結果
倒置相差顯微鏡觀察發現，光照干預組與正常對照組相比，其細胞形態結構未見明顯變化，色素顆粒無明顯減少，未見明顯細胞核固縮、核碎裂、核溶解以及細胞凝固、凋亡、壞死等改變(圖 1, 2)。
圖1
正常對照組細胞倒置相差顯微鏡像。細胞形態與結構正常×100 ??圖 2 光照干預組細胞倒置相差顯微鏡像。細胞形態與結構較正常對照組無明顯變化×100
RT-PCR檢測結果顯示，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較正常對照組明顯增加，差異均有統計學意義(t=5.13、2.78、6.61、3.47、3.06，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=3.82、4.26、4.73、2.68、5.24，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=11.57、9.42、11.36、7.33、8.42，P＞0.05)(圖 3)。
圖3
3組細胞中各因子mRNA表達比較
ELISA檢測結果顯示，在結束光照24 h時，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異均有統計學意義(t=6.73、12.51、9.42、10.66，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=5.76、14.26、6.11、7.72，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=3.88、7.46、5.58、5.36，P＞0.05)(圖 4)。
圖4
3組細胞中各因子蛋白表達比較
Western blot檢測結果顯示，光照損傷組NF-κB的蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=14.37，P＜0.05)。光照干預組NF-κB的蛋白表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=10.02，P＜0.05)。光照干預組NF-κB的蛋白表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=2.72，P＞0.05)(圖 5)。
圖5
3組細胞中NF-κB蛋白表達比較
免疫組織化學染色結果顯示，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表達較正常對照組明顯增加。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表達均較光照損傷組降低。
3 討論
RPE結構和功能的改變是老年性黃斑變性(AMD)和CNV發生發展的重要因素，可見光是自然狀態下造成RPE細胞損傷的重要原因[6, 7]。因此，為了更好地模擬老年人長期慢性光損傷所引起的RPE細胞結構和功能的變化，排除動物模型及激光誘導模型等可能造成的種屬差異、炎癥、其他細胞、組織、因子等的干擾，我們延用了前期實驗曾使用的藍光照射培養的ARPE-19細胞制作的RPE細胞慢性光損傷細胞模型。
本研究結果顯示，RPE細胞分泌的VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的mRNA和蛋白表達在光損傷后較正常對照組均有明顯升高。Kernt等[8]研究發現，光損傷后RPE分泌VEGF上升。Takeda等[1]研究發現，滲出型AMD患者的CNV及激光誘發小鼠CNV模型RPE細胞中eotaxin表達增高。Wang等[2]對培養的人RPE細胞應用H2O2處理后，亦觀察到VEGF和CCR3的3種配體表達明顯升高。本研究結果與上述研究結果吻合。說明光損傷后VEGF與CCR3配體的表達呈同向增強趨勢。提示VEGF和CCR3通路可能被共同激活，并且有可能存在某種關聯。
Mizutani等[9]給予激光誘導C57BL/6J小鼠CNV模型玻璃體腔注射小分子CCR3拮抗劑，觀察發現CCR3、eotaxin-1的表達被抑制；VEGF總量雖沒有明顯變化，但卻誘導了其異構體組成的變化，具有更強促炎癥和促血管生成作用的VEGF164表達下調，而具有神經保護作用的VEGF120表達上調。Wang等[2]研究發現，CCR3抑制劑可以對VEGF誘導的循環內皮細胞遷移產生明顯的劑量依賴的抑制作用。說明VEGF通路與CCR3通路之間或許存在某種聯系。我們應用雷珠單抗抑制光照干預組細胞中的VEGF表達。結果顯示，使用雷珠單抗后，VEGF-A蛋白的分泌量較光照損傷組明顯減少；隨之CCR3的3種配體表達亦明顯下降。表明在VEGF受到抑制后，CCR3配體的表達也受到了抑制。提示在RPE細胞中VEGF與CCR3配體的表達是存在關聯的，VEGF表達升高可能上調CCR3配體的表達，而VEGF表達降低則可以下調CCR3的表達。
NF-κB是一種參與一系列基因表達調控的關鍵性核轉錄因子，能夠上調VEGF表達、促進新生血管形成，并且能反過來被VEGF促進表達[10-12]。NF-κB還能促進嗜酸性粒細胞趨化因子靶基因的轉錄，其表達和活性被抑制后，嗜酸性粒細胞趨化因子下調[13]。Huber等[14]在對纖維母細胞的研究中發現，IκB激酶-2/IκBα/NF-κB通路在CCR3及eotaxin-1的表達中起到關鍵性的作用。本研究結果顯示，光照損傷組VEGF、NF-κB、CCR3配體的mRNA和蛋白表達均較對照組明顯升高，而在使用雷珠單抗抑制了VEGF表達后，NF-κB、CCR3配體的mRNA和蛋白表達均下降。表明在RPE細胞中，VEGF與CCR3配體的表達可能存在關聯，兩者間可能是通過NF-κB作為中介的某種通路相聯系的，其過程有可能是VEGF表達的升高上調了NF-κB的表達，進而上調CCR3配體的表達；因此，在阻斷了VEGF之后，NF-κB及CCR3配體的表達相繼下降。在后續的研究中，可以通過在同樣的光損傷RPE細胞模型中使用NF-κB的抑制劑來阻斷NF-κB的表達，觀察CCR3配體的變化，以此來進一步驗證NF-κB在通路中的作用。
本研究結果表明，光損傷后RPE細胞分泌的VEGF與CCR3配體的表達不僅存在關聯，而且可能是通過以NF-κB作為中介的某種通路相聯系的。至于其中具體的分子機制，以及與其他可能的信號通路之間的關聯，仍需要進一步的研究。
血管內皮生長因子(VEGF)在脈絡膜新生血管(CNV)形成過程中發揮著重要的作用。趨化因子受體3(CCR3)也可在CNV中特異性表達，且其表達與CNV的發生發展可能存在相關性[1, 2]。新近研究發現，在體外培養的人視網膜色素上皮(RPE)細胞光損傷模型中，VEGF-A的表達明顯升高；CCR3的3種配體嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)-1、eotaxin-2、eotaxin-3在該模型中的表達亦持續增加[3, 4]。但兩種因子之間是否存在關聯尚不明確。為此，本研究擬通過抑制光損傷后人RPE細胞VEGF-A的表達，觀察CCR3的3種配體eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及核因子(NF)-κB的表達變化，以探討VEGF-A與CCR3配體eotaxins的表達是否存在關聯及可能的作用機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
人RPE細胞株ARPE-19(美國ATCC公司)，胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)/F12(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Thermo公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(大連TaKaRa公司)，定量PCR試劑(上海TOYOBO公司)，兔抗人eotaxin-1抗體bs-1601R、兔抗人eotaxin-2抗體bs-2483R、鼠抗兔二抗bs-0295Ms、鼠抗羊二抗bs-0294Ms(北京博奧森生物技術有限公司)，羊抗人eotaxin-3抗體sc-21620(美國Santa Cruz公司)，兔抗人VEGF-A抗體BS2853、兔抗人核因子(NF)-κB-p65抗體BS1257(美國Bioworld公司)，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)試劑盒(武漢博士德生物公司)，牛血清白蛋白(武漢天源生物技術有限公司)，3, 3′, 5, 5′-四甲基聯苯胺顯色液和終止液(武漢科前動物生物制品有限公司)，人VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國R&D Systems公司)。15W藍色節能燈(荷蘭Philips公司)，MS6610數字式照度儀(深圳華誼儀表有限公司)，酶標儀(芬蘭Thermo公司)。
采用含20%胎牛血清的DMEM/F12(1 :1)培養基，以100 U/ml劑量加入青霉素、鏈霉素，再加入0.1 mmol/L非必需氨基酸和2 mmol/L谷氨酰胺，在37℃、5%CO2、濕度90%的CO2培養箱中培養ARPE-19細胞。待細胞生長融合鋪滿后，加入0.25%胰蛋白酶消化液進行消化，按1 :2~1 :4細胞傳代，取第8~12代生長狀態良好的傳代細胞用于實驗。將同代細胞隨機分為正常對照組、光照損傷組和光照干預組，待其鋪滿培養皿后更換為無血清的DMEM/F12培養基。將波長為400 nm的15W藍色節能燈自制成光照器，置于培養箱頂部，采用直落式照射，用MS6610型照度計測量被照細胞平面的光強度，將細胞平面光照強度控制在(600±100)Lux，溫度變化控制在36.5~37.5℃之間。光照損傷組在持續光照12 h后停止光照，并繼續培養24 h后結束培養；光照干預組在持續光照12 h后停止光照，在培養液中加入終濃度為0.125 mg/ml的雷珠單抗繼續培養24 h后結束培養[5]；正常對照組以錫箔紙包裹培養皿避光后，置于恒溫培養箱內培養36 h后結束培養。倒置相差顯微鏡下觀察3組細胞的形態。
應用RT-PCR技術檢測結束光照24 h時3組細胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3及NF-κB的mRNA表達情況。利用Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。運用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并委托上海生工生物技術服務有限公司合成。VEGF-A上游引物：5′-AAGGAGGAGGG CAGAATCAT-3′，下游引物：5′-ATCTGCATGGTG ATGTTGGA-3′，擴增片段長度為226堿基對(bp)；eotaxin-1上游引物：5′-CCAGCTTCTGTCCCAACC AC-3′，下游引物：5′-GGAATCCTGCACCCACTTC TT-3′，擴增片段長度為180 bp；eotaxin-2上游引物：5′-CCCACCACATCATCCCTACG-3′，下游引物：5′-TTGGCGTCCAGGTTCTTCAT-3′，擴增片段長度為223 bp；eotaxin-3上游引物：5′-TCCCTCCTGAGTCT CCACCT-3′，下游引物：5′-TTCCTTGGATGGGTA CAGACTT-3′，擴增片段長度為194 bp；β-肌動蛋白上游引物：5′-GTCCACCGCAAATGCTTC TA-3′，下游引物：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTT C-3′，擴增片段長度為190 bp；NF-κB上游引物：5′-AAGCACAGA TACCACTAAGACGCA-3′，下游引物：5′-GGGAAC TTGAAAGGGGTTATTGT-3′，擴增片段長度為160 bp。反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，重復40個循環，72℃末段延伸5 min。采用2ΔΔCt法進行相對定量分析。各標本重復檢測3次后取其平均值。
采用ELISA檢測結束光照24 h時3組細胞中VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達水平。取終止培養時的培養液于4℃條件下，以離心半徑6 cm、12 000 r/min高速離心10 min，取上清液按照試劑盒說明書步驟進行測定。在96孔板每反應孔中分別加入標準品、樣品稀釋液和待檢上清液100μl，置室溫孵育1 h，洗滌。加酶標抗體100μl，室溫孵育1 h，洗滌。加底物液100μl室溫避光孵育，加入50μl終止液終止反應。用酶標儀在波長450 nm處測量吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值，繪制標準曲線，計算各標本濃度。
應用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測結束光照24 h時3組細胞中NF-κB的蛋白表達水平。吸盡細胞培養液后，用預冷的磷酸鹽緩沖液漂洗。加入預冷的細胞裂解液，靜置2 h，超聲波碎核后，4℃冰凍離心機30 000×g離心1 h后取上清液，分裝置于-80℃保存。制膠，十二烷基硫酸納-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移，5%脫脂奶粉封閉，加入按說明書要求稀釋后的一抗，4℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液漂洗，加入1 :5000比例稀釋的相應二抗孵育，漂洗。應用超敏化學發光液試劑盒顯色，在暗房內進行曝光顯影，直至條帶出現并達到合適的黑度為止。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為對照。對顯影條帶進行A值分析。
胰酶消化培養瓶中的細胞制成細胞懸液，滴于載玻片上，置培養箱中過夜，制成細胞爬片，冷乙醇室溫固定30 min；按SABC試劑盒說明書步驟進行依次抗原修復、封閉、加相應一抗、生物素標記的二抗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色法進行免疫組織化學染色。
采用SPSS 13.00統計軟件行統計學分析，數據以均數±標準差(
2 結果
倒置相差顯微鏡觀察發現，光照干預組與正常對照組相比，其細胞形態結構未見明顯變化，色素顆粒無明顯減少，未見明顯細胞核固縮、核碎裂、核溶解以及細胞凝固、凋亡、壞死等改變(圖 1, 2)。
圖1
正常對照組細胞倒置相差顯微鏡像。細胞形態與結構正常×100 ??圖 2 光照干預組細胞倒置相差顯微鏡像。細胞形態與結構較正常對照組無明顯變化×100
RT-PCR檢測結果顯示，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較正常對照組明顯增加，差異均有統計學意義(t=5.13、2.78、6.61、3.47、3.06，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=3.82、4.26、4.73、2.68、5.24，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB的mRNA表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=11.57、9.42、11.36、7.33、8.42，P＞0.05)(圖 3)。
圖3
3組細胞中各因子mRNA表達比較
ELISA檢測結果顯示，在結束光照24 h時，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異均有統計學意義(t=6.73、12.51、9.42、10.66，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=5.76、14.26、6.11、7.72，P＜0.05)。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的蛋白表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=3.88、7.46、5.58、5.36，P＞0.05)(圖 4)。
圖4
3組細胞中各因子蛋白表達比較
Western blot檢測結果顯示，光照損傷組NF-κB的蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=14.37，P＜0.05)。光照干預組NF-κB的蛋白表達較光照損傷組明顯降低，差異也有統計學意義(t=10.02，P＜0.05)。光照干預組NF-κB的蛋白表達較正常對照組無明顯變化，差異無統計學意義(t=2.72，P＞0.05)(圖 5)。
圖5
3組細胞中NF-κB蛋白表達比較
免疫組織化學染色結果顯示，光照損傷組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表達較正常對照組明顯增加。光照干預組VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、NF-κB蛋白表達均較光照損傷組降低。
3 討論
RPE結構和功能的改變是老年性黃斑變性(AMD)和CNV發生發展的重要因素，可見光是自然狀態下造成RPE細胞損傷的重要原因[6, 7]。因此，為了更好地模擬老年人長期慢性光損傷所引起的RPE細胞結構和功能的變化，排除動物模型及激光誘導模型等可能造成的種屬差異、炎癥、其他細胞、組織、因子等的干擾，我們延用了前期實驗曾使用的藍光照射培養的ARPE-19細胞制作的RPE細胞慢性光損傷細胞模型。
本研究結果顯示，RPE細胞分泌的VEGF-A、eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3的mRNA和蛋白表達在光損傷后較正常對照組均有明顯升高。Kernt等[8]研究發現，光損傷后RPE分泌VEGF上升。Takeda等[1]研究發現，滲出型AMD患者的CNV及激光誘發小鼠CNV模型RPE細胞中eotaxin表達增高。Wang等[2]對培養的人RPE細胞應用H2O2處理后，亦觀察到VEGF和CCR3的3種配體表達明顯升高。本研究結果與上述研究結果吻合。說明光損傷后VEGF與CCR3配體的表達呈同向增強趨勢。提示VEGF和CCR3通路可能被共同激活，并且有可能存在某種關聯。
Mizutani等[9]給予激光誘導C57BL/6J小鼠CNV模型玻璃體腔注射小分子CCR3拮抗劑，觀察發現CCR3、eotaxin-1的表達被抑制；VEGF總量雖沒有明顯變化，但卻誘導了其異構體組成的變化，具有更強促炎癥和促血管生成作用的VEGF164表達下調，而具有神經保護作用的VEGF120表達上調。Wang等[2]研究發現，CCR3抑制劑可以對VEGF誘導的循環內皮細胞遷移產生明顯的劑量依賴的抑制作用。說明VEGF通路與CCR3通路之間或許存在某種聯系。我們應用雷珠單抗抑制光照干預組細胞中的VEGF表達。結果顯示，使用雷珠單抗后，VEGF-A蛋白的分泌量較光照損傷組明顯減少；隨之CCR3的3種配體表達亦明顯下降。表明在VEGF受到抑制后，CCR3配體的表達也受到了抑制。提示在RPE細胞中VEGF與CCR3配體的表達是存在關聯的，VEGF表達升高可能上調CCR3配體的表達，而VEGF表達降低則可以下調CCR3的表達。
NF-κB是一種參與一系列基因表達調控的關鍵性核轉錄因子，能夠上調VEGF表達、促進新生血管形成，并且能反過來被VEGF促進表達[10-12]。NF-κB還能促進嗜酸性粒細胞趨化因子靶基因的轉錄，其表達和活性被抑制后，嗜酸性粒細胞趨化因子下調[13]。Huber等[14]在對纖維母細胞的研究中發現，IκB激酶-2/IκBα/NF-κB通路在CCR3及eotaxin-1的表達中起到關鍵性的作用。本研究結果顯示，光照損傷組VEGF、NF-κB、CCR3配體的mRNA和蛋白表達均較對照組明顯升高，而在使用雷珠單抗抑制了VEGF表達后，NF-κB、CCR3配體的mRNA和蛋白表達均下降。表明在RPE細胞中，VEGF與CCR3配體的表達可能存在關聯，兩者間可能是通過NF-κB作為中介的某種通路相聯系的，其過程有可能是VEGF表達的升高上調了NF-κB的表達，進而上調CCR3配體的表達；因此，在阻斷了VEGF之后，NF-κB及CCR3配體的表達相繼下降。在后續的研究中，可以通過在同樣的光損傷RPE細胞模型中使用NF-κB的抑制劑來阻斷NF-κB的表達，觀察CCR3配體的變化，以此來進一步驗證NF-κB在通路中的作用。
本研究結果表明，光損傷后RPE細胞分泌的VEGF與CCR3配體的表達不僅存在關聯，而且可能是通過以NF-κB作為中介的某種通路相聯系的。至于其中具體的分子機制，以及與其他可能的信號通路之間的關聯，仍需要進一步的研究。
