引用本文： 趙薇, 戴樂, 唐志屏, 曾勇, 李燕. 熱休克蛋白27致敏對大鼠視網膜神經節細胞凋亡的影響. 中華眼底病雜志, 2014, 30(5): 500-503. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.05.018 復制
在正常生理狀態下，眼存在血房水屏障和血視網膜屏障，能有效避免血源性免疫效應細胞和分子進入，維持眼內環境穩定，使眼成為一特殊的免疫反應場所。自身免疫性疾病引起視網膜神經節細胞(RGC)的凋亡或眼部的自身免疫疾病引起全身的免疫應答成為臨床疾病關注的一個重點。前期實驗研究發現，熱休克蛋白(HSP)27主要在大鼠RGC層(RGCL)及神經纖維層中呈強表達，RGCL和血清中HSP27陽性表達隨著眼壓升高及高眼壓持續時間延長而逐漸增強[1, 2]。為進一步證實因HSP27刺激而產生的自身抗體是否會促進RGC的凋亡，我們通過HSP27致敏大鼠來觀察RGC的凋亡情況。現將結果報道如下。
1 材料和方法
雌性Wistar大鼠35只，體重250 g，由昆明醫學院動物研究中心提供。于安靜、避免強光及外界刺激的環境中靜養1周。將大鼠分為HSP27致敏組、硼酸鹽緩沖液(BBS)對照組、正常組，分別為15、15、5只大鼠。給予HSP27致敏組大鼠后肢皮下注射100 μg的HSP27和完全弗式佐劑，腹腔注射1 μg百日咳毒素。BBS對照組大鼠于相同部位注射等量BBS。正常組大鼠不作任何處理。
注射前3 d及注射后3 d，1、2、4、6、8周，檢測各組大鼠雙眼眼壓。采用奧比卡因眼液(沈陽綠洲制藥有限責任公司)滴雙眼，待局部麻醉顯效后，用TONO-PEN XL眼壓計筆尖(美國Mentor公司)輕輕接觸角膜，讀取數值。每只眼測定3~5次，取平均值作為眼壓測定值。
注射后4、6、8周，各組選取大鼠5只。以1 ml/kg的劑量腹腔注射速眠新溶液，待麻醉顯效后摘除大鼠眼球，置于干燥的離心管中放置于0℃冰面上。沿視神經長軸盡量經過視神經做眼杯縱切面冰凍切片，切片厚度8 μm，保存于-20℃冰箱。按照細胞凋亡試劑盒(美國Chemicon公司)說明書的步驟，采用原位末端標記法檢測視網膜組織切片中RGC的凋亡情況。采用甲基綠染色，以細胞核或細胞漿呈棕黃色或黃色染色為凋亡細胞，細胞核或細胞漿呈藍色染色為存活細胞。每張切片選取RGC較均勻的5個視野，光學顯微鏡下統計陽性及陰性細胞數，計算細胞凋亡率。
注射后4、6、8周，各組選取大鼠5只。以1 ml/kg的劑量腹腔注射速眠新溶液麻醉大鼠，然后用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚，用手術刀沿縱軸切一個約2 cm的縱行切口，用剪刀鈍性分離頸部背側肌肉。為避免出血，最深層附著在骨上的肌肉用手術刀背刮開，暴露寰枕膜。用l ml注射器，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液，一般采集量為100~200 μl。最后從大鼠胸骨正中靠右剪開皮膚及胸部組織，暴露心臟，用5 ml注射空針取右心室血2 ml，放于不抗凝的生化管中，以離心半徑15 cm，3000 r/min離心5 min，取上清液約1 ml放于離心管中凍存于-20℃冰箱。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒(美國KPL公司)說明書步驟，檢測大鼠血清和腦脊液中HSP27抗體的含量。
采用SPSS 11.5軟件行統計學分析處理。各組間眼壓、血清及腦脊液中HSP27抗體含量比較及組內RGC凋亡率比較采用隨機區組的方差分析；各組間RGC凋亡率比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
HSP27致敏組、BBS對照組、正常組注射前后各時間點大鼠眼壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(圖 1)。HSP27致敏組、BBS對照組、正常組組內注射前后大鼠左眼、右眼眼壓比較，差異也無統計學意義(P>0.05)。
圖1
3組間大鼠眼壓比較。1A. 右眼；1B. 左眼。1 mmHg=0.133 kPa
HSP27致敏組于注射后4周即可見RGC凋亡，注射后6周凋亡的RGC明顯增多(圖 2)。BBS對照組及正常組均未見RGC凋亡(圖 3，4)。HSP27致敏組RGC凋亡率分別與BBS對照組、正常組比較，差異均有統計學意義(P=0.000)(表 1)。HSP27致敏組組內注射后各時間點之間RGC凋亡率比較，差異有統計學意義(P=0.000)。 HSP27致敏組注射后4、6周之間，注射后6、8周之間RGC凋亡率比較，差異均有統計學意義(P=0.000)；注射后4、8周之間RGC凋亡率比較，差異無統計學意義(P=0.062)。
圖2
HSP27致敏組視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。2A. 注射后4周，RGCL可見棕黃色RGC(黑箭)；2B. 注射后6周，RGCL可見棕黃色RGC(黑箭)，較注射后4周增多，并波及內核層(紅箭) 甲基綠 ×200 ? ?圖 3 BBS對照組注射后4周視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。可見大量藍色RGC(黑箭)，未見棕黃色RGC 甲基綠 ×200 ? ?圖 4 正常組注射后4周視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。可見大量藍色RGC(黑箭)，未見棕黃色RGC 甲基綠 ×200
表1
注射后不同時間各組RGC凋亡率比較[(HSP27致敏組大鼠血清中HSP27抗體含量于注射后4周出現高峰，然后隨著注射時間延長而遞減。注射后4、6、8周，HSP27致敏組分別與BBS對照組、正常組比較，其大鼠血清中HSP27抗體含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；BBS對照組與正常組比較，其大鼠血清中HSP27抗體含量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)(表 2)。
HSP27致敏組大鼠腦脊液中HSP27抗體含量于注射后6周出現高峰，然后隨著注射時間延長而遞減。注射后4、6、8周，HSP27致敏組分別與BBS對照組、正常組比較，其大鼠腦脊液中HSP27抗體含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；BBS對照組與正常組比較，其大鼠腦脊液中HSP27抗體含量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)(表 2)。
表2
注射后不同時間各組大鼠血清及腦脊液中HSP27抗體含量[(3 討論
HSP是細胞受到各種刺激時產生的一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質分子家族，普遍存在于原核和真核生物細胞中。HSP27 屬于小分子熱休克蛋白系列，系甾體激素受體結合蛋白，在免疫方面可提供結合蛋白，協同參與抗原加工、遞呈、免疫球蛋白裝配及T細胞導航等作用[3]。體外和體內實驗研究結果發現，HSP27抗體作用機制是通過胞吞方式激活蛋白水解的瀑布效應，裂解多聚氨酸聚合酶，從而誘導細胞調亡[4-6]。并且，HSP27抗體還可能通過競爭效應抑制HSP27的保護作用；在裂解過程中，HSP27抗體與激動蛋白的結合或蛋白的裂解呈劑量依賴性，進一步加速了細胞調亡。
Tezel和Wax[4]研究發現，在離體完整的人視網膜組織和培養的鼠視網膜細胞中運用與青光眼患者血清濃度相似的HSP27抗體可促進RGC凋亡。證明HSP27自身抗體可以直接導致神經變性。但在體內實驗中HSP27抗體是否和RGC凋亡相關，目前還不明確。本研究結果顯示，HSP27致敏組、BBS對照組、正常組大鼠注射前后不同時間點眼壓無明顯變化，各組組內左右眼眼壓也無明顯差異。說明HSP27致敏對大鼠眼壓沒有影響，可以排除高眼壓對RGC凋亡的影響。我們還發現，HSP27致敏組大鼠血清中HSP27抗體的濃度明顯較BBS對照組及正常組增高，并且在腦脊液中也發現了抗體水平的明顯改變。但血清中HSP27抗體的濃度表現為注射后4周達高峰，到注射后8周逐漸下降；腦脊液中的HSP27抗體則表現為注射后6周濃度最高。提示血清抗體濃度和腦脊液抗體濃度變化有一定的時間差。我們還觀察到，腦脊液中的HSP27抗體濃度變化趨勢與RGC凋亡的變化趨勢一致。我們分析該現象的發生主要由視神經的特殊解剖特點決定的。有研究認為視神經的血管具有中樞神經系統血管的所有特征和性能，視神經不是一般的周圍神經，而是中樞神經的一個向前突出的神經束[7]。視神經雖然從屬于外周神經，但視神經胚胎發育時來自間腦，與它相關的主要是少突膠質細胞，這和外周神經系統中斯旺細胞是不同的。此外，視神經的3層鞘膜分別與3層腦膜相連續，內層為軟腦膜，中層為蛛網膜，外層為硬腦膜；與外周神經以神經外膜、神經束膜和神經內膜的形式包繞也是不同的。該結果也從另一個側面說明了由于視神經的特殊位置，視神經化學或是物理的變化和腦脊液的生物指標的變化呈一致性。腦脊液的生化指標變化提示視神經病變的敏感性。
本研究結果表明，HSP27致敏可促進大鼠RGC的凋亡，腦脊液中HSP27抗體含量與RGC凋亡趨勢一致。但臨床上腦脊液成分的檢查屬于有創性檢查，患者接受率較低，有關患者腦脊液中HSP27抗體濃度的變化是否與大鼠一致還有待今后研究加以探討。
在正常生理狀態下，眼存在血房水屏障和血視網膜屏障，能有效避免血源性免疫效應細胞和分子進入，維持眼內環境穩定，使眼成為一特殊的免疫反應場所。自身免疫性疾病引起視網膜神經節細胞(RGC)的凋亡或眼部的自身免疫疾病引起全身的免疫應答成為臨床疾病關注的一個重點。前期實驗研究發現，熱休克蛋白(HSP)27主要在大鼠RGC層(RGCL)及神經纖維層中呈強表達，RGCL和血清中HSP27陽性表達隨著眼壓升高及高眼壓持續時間延長而逐漸增強[1, 2]。為進一步證實因HSP27刺激而產生的自身抗體是否會促進RGC的凋亡，我們通過HSP27致敏大鼠來觀察RGC的凋亡情況。現將結果報道如下。
1 材料和方法
雌性Wistar大鼠35只，體重250 g，由昆明醫學院動物研究中心提供。于安靜、避免強光及外界刺激的環境中靜養1周。將大鼠分為HSP27致敏組、硼酸鹽緩沖液(BBS)對照組、正常組，分別為15、15、5只大鼠。給予HSP27致敏組大鼠后肢皮下注射100 μg的HSP27和完全弗式佐劑，腹腔注射1 μg百日咳毒素。BBS對照組大鼠于相同部位注射等量BBS。正常組大鼠不作任何處理。
注射前3 d及注射后3 d，1、2、4、6、8周，檢測各組大鼠雙眼眼壓。采用奧比卡因眼液(沈陽綠洲制藥有限責任公司)滴雙眼，待局部麻醉顯效后，用TONO-PEN XL眼壓計筆尖(美國Mentor公司)輕輕接觸角膜，讀取數值。每只眼測定3~5次，取平均值作為眼壓測定值。
注射后4、6、8周，各組選取大鼠5只。以1 ml/kg的劑量腹腔注射速眠新溶液，待麻醉顯效后摘除大鼠眼球，置于干燥的離心管中放置于0℃冰面上。沿視神經長軸盡量經過視神經做眼杯縱切面冰凍切片，切片厚度8 μm，保存于-20℃冰箱。按照細胞凋亡試劑盒(美國Chemicon公司)說明書的步驟，采用原位末端標記法檢測視網膜組織切片中RGC的凋亡情況。采用甲基綠染色，以細胞核或細胞漿呈棕黃色或黃色染色為凋亡細胞，細胞核或細胞漿呈藍色染色為存活細胞。每張切片選取RGC較均勻的5個視野，光學顯微鏡下統計陽性及陰性細胞數，計算細胞凋亡率。
注射后4、6、8周，各組選取大鼠5只。以1 ml/kg的劑量腹腔注射速眠新溶液麻醉大鼠，然后用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚，用手術刀沿縱軸切一個約2 cm的縱行切口，用剪刀鈍性分離頸部背側肌肉。為避免出血，最深層附著在骨上的肌肉用手術刀背刮開，暴露寰枕膜。用l ml注射器，針斜面向上，針尖端近水平刺入蛛網膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液，一般采集量為100~200 μl。最后從大鼠胸骨正中靠右剪開皮膚及胸部組織，暴露心臟，用5 ml注射空針取右心室血2 ml，放于不抗凝的生化管中，以離心半徑15 cm，3000 r/min離心5 min，取上清液約1 ml放于離心管中凍存于-20℃冰箱。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒(美國KPL公司)說明書步驟，檢測大鼠血清和腦脊液中HSP27抗體的含量。
采用SPSS 11.5軟件行統計學分析處理。各組間眼壓、血清及腦脊液中HSP27抗體含量比較及組內RGC凋亡率比較采用隨機區組的方差分析；各組間RGC凋亡率比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
HSP27致敏組、BBS對照組、正常組注射前后各時間點大鼠眼壓比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(圖 1)。HSP27致敏組、BBS對照組、正常組組內注射前后大鼠左眼、右眼眼壓比較，差異也無統計學意義(P>0.05)。
圖1
3組間大鼠眼壓比較。1A. 右眼；1B. 左眼。1 mmHg=0.133 kPa
HSP27致敏組于注射后4周即可見RGC凋亡，注射后6周凋亡的RGC明顯增多(圖 2)。BBS對照組及正常組均未見RGC凋亡(圖 3，4)。HSP27致敏組RGC凋亡率分別與BBS對照組、正常組比較，差異均有統計學意義(P=0.000)(表 1)。HSP27致敏組組內注射后各時間點之間RGC凋亡率比較，差異有統計學意義(P=0.000)。 HSP27致敏組注射后4、6周之間，注射后6、8周之間RGC凋亡率比較，差異均有統計學意義(P=0.000)；注射后4、8周之間RGC凋亡率比較，差異無統計學意義(P=0.062)。
圖2
HSP27致敏組視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。2A. 注射后4周，RGCL可見棕黃色RGC(黑箭)；2B. 注射后6周，RGCL可見棕黃色RGC(黑箭)，較注射后4周增多，并波及內核層(紅箭) 甲基綠 ×200 ? ?圖 3 BBS對照組注射后4周視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。可見大量藍色RGC(黑箭)，未見棕黃色RGC 甲基綠 ×200 ? ?圖 4 正常組注射后4周視網膜冰凍切片光學顯微鏡像。可見大量藍色RGC(黑箭)，未見棕黃色RGC 甲基綠 ×200
表1
注射后不同時間各組RGC凋亡率比較[(HSP27致敏組大鼠血清中HSP27抗體含量于注射后4周出現高峰，然后隨著注射時間延長而遞減。注射后4、6、8周，HSP27致敏組分別與BBS對照組、正常組比較，其大鼠血清中HSP27抗體含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；BBS對照組與正常組比較，其大鼠血清中HSP27抗體含量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)(表 2)。
HSP27致敏組大鼠腦脊液中HSP27抗體含量于注射后6周出現高峰，然后隨著注射時間延長而遞減。注射后4、6、8周，HSP27致敏組分別與BBS對照組、正常組比較，其大鼠腦脊液中HSP27抗體含量明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；BBS對照組與正常組比較，其大鼠腦脊液中HSP27抗體含量無明顯變化，差異無統計學意義(P>0.05)(表 2)。
表2
注射后不同時間各組大鼠血清及腦脊液中HSP27抗體含量[(3 討論
HSP是細胞受到各種刺激時產生的一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質分子家族，普遍存在于原核和真核生物細胞中。HSP27 屬于小分子熱休克蛋白系列，系甾體激素受體結合蛋白，在免疫方面可提供結合蛋白，協同參與抗原加工、遞呈、免疫球蛋白裝配及T細胞導航等作用[3]。體外和體內實驗研究結果發現，HSP27抗體作用機制是通過胞吞方式激活蛋白水解的瀑布效應，裂解多聚氨酸聚合酶，從而誘導細胞調亡[4-6]。并且，HSP27抗體還可能通過競爭效應抑制HSP27的保護作用；在裂解過程中，HSP27抗體與激動蛋白的結合或蛋白的裂解呈劑量依賴性，進一步加速了細胞調亡。
Tezel和Wax[4]研究發現，在離體完整的人視網膜組織和培養的鼠視網膜細胞中運用與青光眼患者血清濃度相似的HSP27抗體可促進RGC凋亡。證明HSP27自身抗體可以直接導致神經變性。但在體內實驗中HSP27抗體是否和RGC凋亡相關，目前還不明確。本研究結果顯示，HSP27致敏組、BBS對照組、正常組大鼠注射前后不同時間點眼壓無明顯變化，各組組內左右眼眼壓也無明顯差異。說明HSP27致敏對大鼠眼壓沒有影響，可以排除高眼壓對RGC凋亡的影響。我們還發現，HSP27致敏組大鼠血清中HSP27抗體的濃度明顯較BBS對照組及正常組增高，并且在腦脊液中也發現了抗體水平的明顯改變。但血清中HSP27抗體的濃度表現為注射后4周達高峰，到注射后8周逐漸下降；腦脊液中的HSP27抗體則表現為注射后6周濃度最高。提示血清抗體濃度和腦脊液抗體濃度變化有一定的時間差。我們還觀察到，腦脊液中的HSP27抗體濃度變化趨勢與RGC凋亡的變化趨勢一致。我們分析該現象的發生主要由視神經的特殊解剖特點決定的。有研究認為視神經的血管具有中樞神經系統血管的所有特征和性能，視神經不是一般的周圍神經，而是中樞神經的一個向前突出的神經束[7]。視神經雖然從屬于外周神經，但視神經胚胎發育時來自間腦，與它相關的主要是少突膠質細胞，這和外周神經系統中斯旺細胞是不同的。此外，視神經的3層鞘膜分別與3層腦膜相連續，內層為軟腦膜，中層為蛛網膜，外層為硬腦膜；與外周神經以神經外膜、神經束膜和神經內膜的形式包繞也是不同的。該結果也從另一個側面說明了由于視神經的特殊位置，視神經化學或是物理的變化和腦脊液的生物指標的變化呈一致性。腦脊液的生化指標變化提示視神經病變的敏感性。
本研究結果表明，HSP27致敏可促進大鼠RGC的凋亡，腦脊液中HSP27抗體含量與RGC凋亡趨勢一致。但臨床上腦脊液成分的檢查屬于有創性檢查，患者接受率較低，有關患者腦脊液中HSP27抗體濃度的變化是否與大鼠一致還有待今后研究加以探討。
