引用本文： 吳建國, 鄭玉強, 徐輝, 孫靜, 何偉. 視網膜靜脈阻塞兔眼微循環變化的激光散斑成像技術定量監測. 中華眼底病雜志, 2014, 30(5): 492-494. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.05.016 復制
視網膜微循環變化是視網膜分支靜脈阻塞(BRVO)研究的方向之一[1, 2]。彩色多普勒超聲檢查可實時檢測血流量，但空間分辨率不夠高[3]。熒光素眼底血管造影(FFA)檢查清晰直觀，但不能長期實時動態監測[2, 4]。探尋一種實時、無創，可定量監測BRVO患眼視網膜微循環的技術具有重要的臨床意義。激光散斑成像(LSI)技術從散斑的動態情況可測量出紅細胞運動速度，在無需掃描的條件下，以較高的空間和時間分辨率，活體、動態、無創地監測血流速度、血管管徑和血流量，獲取微循環的多個指標[5]。目前已成為腸系膜和軟腦膜微循環研究的重要手段[5]，但該技術在BRVO研究中的應用報道較少。為此，我們應用LSI技術觀察了BRVO模型兔眼視網膜微循環變化，評估LSI技術定量監測兔眼視網膜微循環的可行性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
所有實驗操作均遵循遼寧何氏醫學院動物實驗倫理學規定。健康青紫藍兔10只，4月齡，體重3.0～3.5 kg，雌雄不限，由中國北方眼科疾病動物平臺提供。選右眼為實驗眼。所有操作前，均以0.2 ml/kg的劑量肌肉注射速眠新麻醉，10 g/L托吡卡胺散瞳。
將麻醉穩定的青紫藍兔擱置于發射光波長785 nm的LSI儀(型號MoorFLPI2，英國Moor公司)托臺上，安裝免縫線角膜固定環聯合動物角膜接觸鏡矯正實驗眼屈光參差[6, 7]，保持實驗眼與激光發射器的垂直眼位。裂隙燈顯微鏡下，選擇以視盤毗鄰0.5～1.0 mm處的視網膜主干靜脈為靶血管，檢測視網膜微循環。采集圖像時，進入MoorFLPI-2 Measurement V1.0軟件，設定CCD分辨率576×768 像素，時間濾波25幀/s，采集頻率5 Hz，曝光時間0.5 s，每次連續采集時間為1 min。待兔眼眼底血管通過圖像采集器清晰顯示在屏幕上，開始測量1 min，結果存檔為“Normal fundus.MMF”原始文件；分析圖像時，將MMF文件導入MoorFLPI-2 Review V4.0程序進行回放和后處理，選擇靶血管直徑和相應0.2 mm2區域做標尺，將分析標尺存為“標尺文件”待后續使用，利用程序自帶的分析功能獲得血管直徑和血流量結果。血流量以流動的紅細胞產生的多普勒位移值表示。
參照文獻[8]的方法建立BRVO模型。按10 mg/kg 的劑量耳緣靜脈注射孟加拉紅，1 min后，待其循環至視網膜靜脈時，以550 nm 波長氙激光照射靶血管30個點。 激光參數：功率100 mW，直徑50 μm，曝光時間0.1 s。以裂隙燈顯微鏡下見到靶血管內白色血栓形成，血管徑變細，血流減慢甚至完全停止為建模成功。以血管腔完全閉塞、血流徹底阻斷為完全性BRVO；以血流減慢、血管腔部分變細為不完全性BRVO。
建模后10 min，采用建模前的LSI檢測方法，檢測建模后兔眼眼底血流情況。以MoorFLPI-2 Measurement V1.0軟件獲取眼底圖像的“BRVO.MMF”文件，再進入MoorFLPI-2 Review V4.0程序，打開“BRVO.MMF”文件，并導入建模前存入的“標尺文件”，標尺出現在建模前圖像分析的相同坐標上，標定建模前相同位置血管直徑和相同面積的血流量。分析建模前后相同部位血管直徑、血流量的變化。
采用SPSS 11.5統計學軟件行統計分析，所有數據以均數±標準差(
2 結果
裂隙燈顯微鏡觀察發現，氙激光照射30個點后，兔眼眼底靶血管內紅細胞凝集成小團塊，血流速度減慢，但靶血管內始終無法形成徹底有效的完全阻塞，亦未見血流完全停滯，所有動物模型均為不完全性BRVO。
消除兔眼屈光參差后，LSI技術可獲得同步顯示的彩色眼底、紅外激光和血流分布偽彩圖圖像(圖 1)。建模前兔眼眼底靶血管直徑為(0.104±0.009) mm，靶血管0.2 mm2區域面積的血流量為(563.500±28.788) PU。建模10 min后，兔眼眼底靶血管直徑為(0.128±0.008) mm，靶血管0.2 mm2區域面積的血流量為(256.000±53.319) PU。建模后兔眼眼底靶血管直徑較建模前明顯增粗，差異有統計學意義(t=12.14,P=0.008)。建模后兔眼眼底靶血管0.2 mm2區域面積的血流量較建模前明顯降低，差異也有統計學意義(t=183.00，P=0.009)。
圖1
LSI技術實時采集的兔視網膜微循環像。1A. 彩色眼底像。清晰可見眼底視盤區域與視盤發散出的血管，靶血管的血管徑變細(白箭)；1B. 紅外激光圖，與彩色眼底像對應的靶血管位置(白箭)；1C. 血流偽彩圖，可見與彩色眼底像與紅外激光圖對應的靶血管顯影(白箭)
3 討論
我們曾采用視頻技術記錄兔眼眼底視網膜靜脈血栓形成和血栓溶解動態過程，其方法較腸系膜、軟腦膜等部位的有創微循環研究更能體現自然狀態下血管內的變化[1, 5]。但早期研究僅從時間和空間上觀察了視網膜血栓形態變化，尚存在不能定量顯示眼底血流的不足。我們嘗試采用彩色多普勒超聲及FFA檢查，均未能解決此困難[2-4]。LSI儀是近年來全球廣泛使用的一種微循環測量儀，已在動物的腸系膜和軟腦膜等部位得到廣泛應用[5]。但由于其發射的激光為平行光，而兔眼存在著近65D的屈光系統，故本研究采用動物角膜接觸鏡矯正兔眼的屈光參差。同時為了防止角膜接觸鏡滑動，我們還采用硅膠角膜環來輔助支撐，摒棄傳統的縫線固定金屬環這一步驟，減少了對兔眼眼表的損傷。
本研究結果顯示，消除兔眼屈光參差后，LSI技術可獲得同步顯示的彩色眼底、紅外激光和血流分布偽彩圖圖像。說明LSI技術能在時間、空間層面上定量化觀察兔眼視網膜血管內的血流變化。不僅可以如同視頻技術一樣，以直視狀態定性判斷血管是否通暢，更為重要的是可實時測量靶血管直徑和視網膜單位面積血流量，初步解決了定量化觀察指標的技術困難。此外，在實驗動物僅有10只且BRVO并不完全的情況下，我們依然判斷出建模前后血管直徑和血流量具有明顯差異。提示LSI技術有助于精確、穩定檢測眼底血流量的變化，這或許對減少實驗動物用量有著積極意義。
但本研究采用的LSI儀仍有值得改進之處。首先，本型號LSI儀配置的CCD比較粗糙，最大分辨率僅能達到576×768像素，圖像細節有進一步提高的空間。其次，本儀器可實時記錄血流偽彩視頻和紅外激光眼底視頻，但卻沒有彩色眼底的視頻。期待醫學研究者與儀器研發者的合作，改進LSI儀的CCD和記錄測量軟件，使其在BRVO等眼底血管性疾病研究中發揮更大的作用。
視網膜微循環變化是視網膜分支靜脈阻塞(BRVO)研究的方向之一[1, 2]。彩色多普勒超聲檢查可實時檢測血流量，但空間分辨率不夠高[3]。熒光素眼底血管造影(FFA)檢查清晰直觀，但不能長期實時動態監測[2, 4]。探尋一種實時、無創，可定量監測BRVO患眼視網膜微循環的技術具有重要的臨床意義。激光散斑成像(LSI)技術從散斑的動態情況可測量出紅細胞運動速度，在無需掃描的條件下，以較高的空間和時間分辨率，活體、動態、無創地監測血流速度、血管管徑和血流量，獲取微循環的多個指標[5]。目前已成為腸系膜和軟腦膜微循環研究的重要手段[5]，但該技術在BRVO研究中的應用報道較少。為此，我們應用LSI技術觀察了BRVO模型兔眼視網膜微循環變化，評估LSI技術定量監測兔眼視網膜微循環的可行性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
所有實驗操作均遵循遼寧何氏醫學院動物實驗倫理學規定。健康青紫藍兔10只，4月齡，體重3.0～3.5 kg，雌雄不限，由中國北方眼科疾病動物平臺提供。選右眼為實驗眼。所有操作前，均以0.2 ml/kg的劑量肌肉注射速眠新麻醉，10 g/L托吡卡胺散瞳。
將麻醉穩定的青紫藍兔擱置于發射光波長785 nm的LSI儀(型號MoorFLPI2，英國Moor公司)托臺上，安裝免縫線角膜固定環聯合動物角膜接觸鏡矯正實驗眼屈光參差[6, 7]，保持實驗眼與激光發射器的垂直眼位。裂隙燈顯微鏡下，選擇以視盤毗鄰0.5～1.0 mm處的視網膜主干靜脈為靶血管，檢測視網膜微循環。采集圖像時，進入MoorFLPI-2 Measurement V1.0軟件，設定CCD分辨率576×768 像素，時間濾波25幀/s，采集頻率5 Hz，曝光時間0.5 s，每次連續采集時間為1 min。待兔眼眼底血管通過圖像采集器清晰顯示在屏幕上，開始測量1 min，結果存檔為“Normal fundus.MMF”原始文件；分析圖像時，將MMF文件導入MoorFLPI-2 Review V4.0程序進行回放和后處理，選擇靶血管直徑和相應0.2 mm2區域做標尺，將分析標尺存為“標尺文件”待后續使用，利用程序自帶的分析功能獲得血管直徑和血流量結果。血流量以流動的紅細胞產生的多普勒位移值表示。
參照文獻[8]的方法建立BRVO模型。按10 mg/kg 的劑量耳緣靜脈注射孟加拉紅，1 min后，待其循環至視網膜靜脈時，以550 nm 波長氙激光照射靶血管30個點。 激光參數：功率100 mW，直徑50 μm，曝光時間0.1 s。以裂隙燈顯微鏡下見到靶血管內白色血栓形成，血管徑變細，血流減慢甚至完全停止為建模成功。以血管腔完全閉塞、血流徹底阻斷為完全性BRVO；以血流減慢、血管腔部分變細為不完全性BRVO。
建模后10 min，采用建模前的LSI檢測方法，檢測建模后兔眼眼底血流情況。以MoorFLPI-2 Measurement V1.0軟件獲取眼底圖像的“BRVO.MMF”文件，再進入MoorFLPI-2 Review V4.0程序，打開“BRVO.MMF”文件，并導入建模前存入的“標尺文件”，標尺出現在建模前圖像分析的相同坐標上，標定建模前相同位置血管直徑和相同面積的血流量。分析建模前后相同部位血管直徑、血流量的變化。
采用SPSS 11.5統計學軟件行統計分析，所有數據以均數±標準差(
2 結果
裂隙燈顯微鏡觀察發現，氙激光照射30個點后，兔眼眼底靶血管內紅細胞凝集成小團塊，血流速度減慢，但靶血管內始終無法形成徹底有效的完全阻塞，亦未見血流完全停滯，所有動物模型均為不完全性BRVO。
消除兔眼屈光參差后，LSI技術可獲得同步顯示的彩色眼底、紅外激光和血流分布偽彩圖圖像(圖 1)。建模前兔眼眼底靶血管直徑為(0.104±0.009) mm，靶血管0.2 mm2區域面積的血流量為(563.500±28.788) PU。建模10 min后，兔眼眼底靶血管直徑為(0.128±0.008) mm，靶血管0.2 mm2區域面積的血流量為(256.000±53.319) PU。建模后兔眼眼底靶血管直徑較建模前明顯增粗，差異有統計學意義(t=12.14,P=0.008)。建模后兔眼眼底靶血管0.2 mm2區域面積的血流量較建模前明顯降低，差異也有統計學意義(t=183.00，P=0.009)。
圖1
LSI技術實時采集的兔視網膜微循環像。1A. 彩色眼底像。清晰可見眼底視盤區域與視盤發散出的血管，靶血管的血管徑變細(白箭)；1B. 紅外激光圖，與彩色眼底像對應的靶血管位置(白箭)；1C. 血流偽彩圖，可見與彩色眼底像與紅外激光圖對應的靶血管顯影(白箭)
3 討論
我們曾采用視頻技術記錄兔眼眼底視網膜靜脈血栓形成和血栓溶解動態過程，其方法較腸系膜、軟腦膜等部位的有創微循環研究更能體現自然狀態下血管內的變化[1, 5]。但早期研究僅從時間和空間上觀察了視網膜血栓形態變化，尚存在不能定量顯示眼底血流的不足。我們嘗試采用彩色多普勒超聲及FFA檢查，均未能解決此困難[2-4]。LSI儀是近年來全球廣泛使用的一種微循環測量儀，已在動物的腸系膜和軟腦膜等部位得到廣泛應用[5]。但由于其發射的激光為平行光，而兔眼存在著近65D的屈光系統，故本研究采用動物角膜接觸鏡矯正兔眼的屈光參差。同時為了防止角膜接觸鏡滑動，我們還采用硅膠角膜環來輔助支撐，摒棄傳統的縫線固定金屬環這一步驟，減少了對兔眼眼表的損傷。
本研究結果顯示，消除兔眼屈光參差后，LSI技術可獲得同步顯示的彩色眼底、紅外激光和血流分布偽彩圖圖像。說明LSI技術能在時間、空間層面上定量化觀察兔眼視網膜血管內的血流變化。不僅可以如同視頻技術一樣，以直視狀態定性判斷血管是否通暢，更為重要的是可實時測量靶血管直徑和視網膜單位面積血流量，初步解決了定量化觀察指標的技術困難。此外，在實驗動物僅有10只且BRVO并不完全的情況下，我們依然判斷出建模前后血管直徑和血流量具有明顯差異。提示LSI技術有助于精確、穩定檢測眼底血流量的變化，這或許對減少實驗動物用量有著積極意義。
但本研究采用的LSI儀仍有值得改進之處。首先，本型號LSI儀配置的CCD比較粗糙，最大分辨率僅能達到576×768像素，圖像細節有進一步提高的空間。其次，本儀器可實時記錄血流偽彩視頻和紅外激光眼底視頻，但卻沒有彩色眼底的視頻。期待醫學研究者與儀器研發者的合作，改進LSI儀的CCD和記錄測量軟件，使其在BRVO等眼底血管性疾病研究中發揮更大的作用。
