引用本文： 侯彬, 沈琳, 王紅, 陳海婷, 趙萌. 白細胞介素-17、白細胞介素-4及γ干擾素在實驗性自身免疫性葡萄膜炎中的表達. 中華眼底病雜志, 2014, 30(4): 386-389. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.04.013 復制
實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是抗原特異性T細胞介導的自身免疫性疾病[1]。輔助性T細胞(Th)1及Th2細胞是參與EAU發病的主要細胞群，分別以分泌γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-4為特征[2]。Th17細胞是一種新發現的CD4+ T細胞，以分泌IL-17為特點，在EAU的發病機制中也發揮重要作用[3]。但有關Th1、Th2及Th17細胞在EAU發病機制中的具有作用目前尚不十分清楚。為此，我們觀察了IFN-γ、IL-4、IL-17在EAU中的表達，以期揭示它們代表的3種Th細胞在EAU發病中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料及設備、光受體視黃醇類結合蛋白(IRBP)多肽片段合成、EAU模型建立
健康雌性C57BL/6小鼠50只，6~8周齡，體重18~20 g，北京維通利華實驗動物中心提供。按國家標準條件，于首都醫科大學動物部清潔級實驗動物飼養室屏障環境中飼養。細胞裂解液Trizol、逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(美國Invitrogen公司)，實時PCR試劑盒(日本Takara公司)，抗小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17抗體一抗(美國R & D公司)，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)抗體二抗(美國Santa Cruz公司)，小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國ADL公司)，Mx3000P熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)，凝膠成像系統、Mini Protean 3型電泳儀及蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，Leica RM2235石蠟切片機、Leica EG1120制蠟機(德國Leica公司)。
IRBP 1-20多肽片段由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，純度為98%。
隨機抽取10只小鼠作為建模前對照，皮下注射雙蒸水0.5 ml。將IRBP多肽片段溶于雙蒸水中，與等容量弗氏完全佐劑充分混勻成乳劑，于其余40只小鼠背部及脅腹部多點皮下注射，每只小鼠注射IRBP 1 mg。注射后14 d，小鼠雙眼行散瞳間接檢眼鏡檢查，觀察小鼠眼底炎癥情況。參照文獻[4]的方法對炎癥反應進行分級，選取0.5~3.0級炎癥反應的24只小鼠納入實驗。建模成功率為60%。
1.2 組織病理學分析及IFN-γ、IL-4、IL-17表達檢測
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死。摘除眼球作石蠟病理切片，切片厚度為5 μm，蘇木精伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察小鼠視網膜結構變化。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取10只小鼠。每只小鼠抽取血液0.7 ml，常溫靜置2 h后置于離心機中，以離心半徑8.4 cm，3000 r/min離心10 min。每只小鼠取上層血清約0.2 ml，保存于-80℃冰箱備用。分別用IFN-γ、IL-4和IL-17 ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死。取脾組織約50~70 mg。摘除眼球，取雙眼視網膜組織30~50 μg。采用細胞裂解液Trizol提取組織內RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度，將其逆轉錄為cDNA，進行普通PCR反應，在優化反應條件后進行實時熒光定量PCR反應。通過PubMed檢索各基因的序列，使用Premier Primer 5和Oligo 6軟件設計引物序列，由上海生工生物工程技術公司合成。GAPDH：上游引物5′-TCGTGGCCAT ATTTGGCTTTGTGG-3′，下游引物5′-TAAGGAC CCATAGCATCCGCAACA-3′，擴增片段長度為190堿基對(bp)；IFN-γ：上游引物5′-GGCCATCAGCA ACAACATAAGCGT-3′，下游引物5′-TGGGTTG TTGACCTCAAACTTGGC-3′，擴增片段長度為118 bp；IL-4：上游引物5′-TCTCGAATGTACCAGG AGCCATATC-3′，下游引物5′-AGCACCTTGGA AGCCCTACAGA-3′，擴增片段長度為183 bp；IL-17：上游引物5′-TCCACCGCAATGAAGACCCTGAT A-3′，下游引物5′-ACCAGCATCTTCTCGACCCTG AAA-3′，擴增片段長度為193 bp。PCR反應條件：預變性95℃10 s，PCR反應95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環，65℃ 15 s。所有標本均檢測3次。參照文獻[5]的比較閾值法計算小鼠視網膜組織中IFN-γ、IL-4、IL-17 mRNA表達。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死，采用蛋白質免疫印跡法檢測小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ、IL-4、IL-17蛋白表達。采用細胞裂解液裂解組織細胞，提取蛋白質，以二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，進行蛋白電泳、轉膜、封閉、孵一抗及二抗，最后凝膠成像。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
建模前，小鼠視網膜組織結構完整，未見炎癥細胞浸潤(圖 1)。建模后14 d，間接檢眼鏡檢查發現，小鼠視網膜水腫、滲出，視網膜血管閉塞；光學顯微鏡觀察發現，葡萄膜組織結構破壞，大量炎癥細胞浸潤(圖 2)。
圖1
建模前小鼠視網膜光學顯微鏡像。視網膜組織結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤??HE ×200??圖 2??建模后14 d小鼠視網膜光學顯微鏡像。葡萄膜組織結構破壞，大量炎癥細胞浸潤??HE ×40
建模后7、14、21 d，小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-17含量明顯升高。小鼠血清中IFN-γ含量于建模后7 d達到高峰，IL-4、IL-17含量于建模后14 d達到高峰；高峰后均逐漸下降(圖 3)。小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量均于建模后28 d下降至建模前水平，IL-17含量于建模后28 d仍稍高于建模前水平。小鼠血清中IL-17含量升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。建模前與建模后7、14、21 d小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異有統計學意義(F=1 817.346、268.600、164.621，P<0.05)；建模前與建模后28 d小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。
圖3
建模前后小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較
小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ mRNA表達于建模后7 d達到高峰，分別為建模前的1.77、1.64倍；此后逐漸下降，于建模后28 d下降至建模前水平(圖 4, 5)。小鼠脾及視網膜組織中IL-4、IL-17 mRNA表達均于建模后14 d達到高峰，分別為建模前的3.28、2.03，3.16、1.93倍；此后逐漸下降，于建模后28 d下降至建模前水平。小鼠脾及視網膜組織中IL-17 mRNA表達升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。
圖4
建模前后小鼠脾組織中IL-17、IL-4、IFN-γmRNA相對表達量比較
圖5
建模前后小鼠視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ mRNA相對表達量比較
小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ蛋白表達均于建模后7 d達到高峰，IL-4、IL-17蛋白表達于建模后14 d達到高峰；高峰后逐漸下降，均于建模后28 d下降至建模前水平(圖 6, 7)。小鼠脾及視網膜組織中IL-17蛋白表達升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。建模前與建模后7、14、21 d小鼠脾(F=312.670、114.250、216.220)及視網膜(F=271.504、85.370、80.722)組織中蛋白表達IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；建模前與建模后28 d小鼠脾及視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。
圖6
建模前后小鼠脾組織中IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白表達比較
圖7
建模前后小鼠視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白表達比較
3 討論
EAU與人類葡萄膜炎具有許多相似的臨床特點及病理特征，病變主要位于視網膜、葡萄膜，是研究葡萄膜炎較好的動物模型。本研究結果顯示，建模后14 d小鼠炎癥反應達到高峰，證明模型建立成功。
初始CD4+T細胞在IL-12、IFN-γ的誘導下分化為Th1細胞，產生IFN-γ；在轉化生長因子β和IL-6的共同誘導下分化為Th17細胞，分泌IL-17和IL-6；在IL-4的誘導下分化為Th2細胞，分泌IL-4、IL-5和IL-13；其參與炎癥反應和自身免疫性疾病，以Th1和Th2細胞因子抑制Th17的分化。說明在正常機體中，各種細胞因子之間相互影響和制約，達到平衡狀態。當各種原因導致此平衡破壞時，便產生自身免疫性疾病。本研究結果顯示，建模后IL-17、IL-4、IFN-γ這3種細胞因子水平均有不同程度的升高，IL-17、IL-4在建模后14 d達到高峰，IFN-γ于建模后7 d達到高峰，此后小鼠血清中3種因子的含量均逐漸下降。說明在EAU早期，Th1細胞在免疫反應中起主要作用，而Th17和Th2則在中后期占主要地位。新近研究發現，Th17細胞在誘導免疫性疾病方面較Th1的作用更為強烈[6]。初始T細胞于抗原刺激后5~7 d分化為大量成熟的Th17細胞，含量大于Th1細胞，隨后Th1細胞數量逐漸上升，于刺激后10~14d生成量大于Th17細胞[6]。說明在體外實驗中，Th17細胞在免疫反應的早期起主要作用，而Th1細胞在免疫反應的中后期可能占主要地位[7]。該結果與本研究在CD4+T細胞作用時間點上有一定差別，可能與實驗對象和體內外實驗的差別有關，還需要今后進一步的研究證實。
在對燒傷后小鼠機體免疫反應的研究中，IFN-γ可阻礙初始CD4+T細胞向Th17路徑分化[8]。本研究結果顯示，IFN-γ在建模后7d高表達，隨后逐漸減少；而IL-17、IL-4在建模后7 d低表達，而建模后14 d達高峰。這或許提示IFN-γ抑制了Th17路徑的分化，但還有待今后研究加以證實。
體外實驗研究證實，抑制Th1細胞的發育，可以增強Th17細胞的分化和加重由IL-17介導的免疫應答反應[7]。同樣，Th1、Th2細胞各自的特征性細胞因子IFN-γ、IL-4均抑制了誘導分化Th17細胞的細胞因子IL-23[1]。據此我們推測，在免疫應答反應中，Th1、Th2和Th17細胞共同參與且互相抑制各自的分化。說明3種細胞因子相互作用，不能將某一特定的細胞因子完全視為致病性或保護性因子，而應將其視為復雜的分子機制的一部分。
實驗性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是抗原特異性T細胞介導的自身免疫性疾病[1]。輔助性T細胞(Th)1及Th2細胞是參與EAU發病的主要細胞群，分別以分泌γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素(IL)-4為特征[2]。Th17細胞是一種新發現的CD4+ T細胞，以分泌IL-17為特點，在EAU的發病機制中也發揮重要作用[3]。但有關Th1、Th2及Th17細胞在EAU發病機制中的具有作用目前尚不十分清楚。為此，我們觀察了IFN-γ、IL-4、IL-17在EAU中的表達，以期揭示它們代表的3種Th細胞在EAU發病中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料及設備、光受體視黃醇類結合蛋白(IRBP)多肽片段合成、EAU模型建立
健康雌性C57BL/6小鼠50只，6~8周齡，體重18~20 g，北京維通利華實驗動物中心提供。按國家標準條件，于首都醫科大學動物部清潔級實驗動物飼養室屏障環境中飼養。細胞裂解液Trizol、逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(美國Invitrogen公司)，實時PCR試劑盒(日本Takara公司)，抗小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17抗體一抗(美國R & D公司)，兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)抗體二抗(美國Santa Cruz公司)，小鼠IFN-γ、IL-4、IL-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國ADL公司)，Mx3000P熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司)，凝膠成像系統、Mini Protean 3型電泳儀及蛋白轉膜儀(美國Bio-Rad公司)，Leica RM2235石蠟切片機、Leica EG1120制蠟機(德國Leica公司)。
IRBP 1-20多肽片段由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，純度為98%。
隨機抽取10只小鼠作為建模前對照，皮下注射雙蒸水0.5 ml。將IRBP多肽片段溶于雙蒸水中，與等容量弗氏完全佐劑充分混勻成乳劑，于其余40只小鼠背部及脅腹部多點皮下注射，每只小鼠注射IRBP 1 mg。注射后14 d，小鼠雙眼行散瞳間接檢眼鏡檢查，觀察小鼠眼底炎癥情況。參照文獻[4]的方法對炎癥反應進行分級，選取0.5~3.0級炎癥反應的24只小鼠納入實驗。建模成功率為60%。
1.2 組織病理學分析及IFN-γ、IL-4、IL-17表達檢測
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死。摘除眼球作石蠟病理切片，切片厚度為5 μm，蘇木精伊紅(HE)染色，光學顯微鏡觀察小鼠視網膜結構變化。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取10只小鼠。每只小鼠抽取血液0.7 ml，常溫靜置2 h后置于離心機中，以離心半徑8.4 cm，3000 r/min離心10 min。每只小鼠取上層血清約0.2 ml，保存于-80℃冰箱備用。分別用IFN-γ、IL-4和IL-17 ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死。取脾組織約50~70 mg。摘除眼球，取雙眼視網膜組織30~50 μg。采用細胞裂解液Trizol提取組織內RNA，紫外分光光度計測定RNA純度和濃度，將其逆轉錄為cDNA，進行普通PCR反應，在優化反應條件后進行實時熒光定量PCR反應。通過PubMed檢索各基因的序列，使用Premier Primer 5和Oligo 6軟件設計引物序列，由上海生工生物工程技術公司合成。GAPDH：上游引物5′-TCGTGGCCAT ATTTGGCTTTGTGG-3′，下游引物5′-TAAGGAC CCATAGCATCCGCAACA-3′，擴增片段長度為190堿基對(bp)；IFN-γ：上游引物5′-GGCCATCAGCA ACAACATAAGCGT-3′，下游引物5′-TGGGTTG TTGACCTCAAACTTGGC-3′，擴增片段長度為118 bp；IL-4：上游引物5′-TCTCGAATGTACCAGG AGCCATATC-3′，下游引物5′-AGCACCTTGGA AGCCCTACAGA-3′，擴增片段長度為183 bp；IL-17：上游引物5′-TCCACCGCAATGAAGACCCTGAT A-3′，下游引物5′-ACCAGCATCTTCTCGACCCTG AAA-3′，擴增片段長度為193 bp。PCR反應條件：預變性95℃10 s，PCR反應95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環，65℃ 15 s。所有標本均檢測3次。參照文獻[5]的比較閾值法計算小鼠視網膜組織中IFN-γ、IL-4、IL-17 mRNA表達。
建模前及建模后7、14、21、28 d，隨機選取5只小鼠處死，采用蛋白質免疫印跡法檢測小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ、IL-4、IL-17蛋白表達。采用細胞裂解液裂解組織細胞，提取蛋白質，以二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，進行蛋白電泳、轉膜、封閉、孵一抗及二抗，最后凝膠成像。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
建模前，小鼠視網膜組織結構完整，未見炎癥細胞浸潤(圖 1)。建模后14 d，間接檢眼鏡檢查發現，小鼠視網膜水腫、滲出，視網膜血管閉塞；光學顯微鏡觀察發現，葡萄膜組織結構破壞，大量炎癥細胞浸潤(圖 2)。
圖1
建模前小鼠視網膜光學顯微鏡像。視網膜組織結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤??HE ×200??圖 2??建模后14 d小鼠視網膜光學顯微鏡像。葡萄膜組織結構破壞，大量炎癥細胞浸潤??HE ×40
建模后7、14、21 d，小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-17含量明顯升高。小鼠血清中IFN-γ含量于建模后7 d達到高峰，IL-4、IL-17含量于建模后14 d達到高峰；高峰后均逐漸下降(圖 3)。小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量均于建模后28 d下降至建模前水平，IL-17含量于建模后28 d仍稍高于建模前水平。小鼠血清中IL-17含量升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。建模前與建模后7、14、21 d小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異有統計學意義(F=1 817.346、268.600、164.621，P<0.05)；建模前與建模后28 d小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。
圖3
建模前后小鼠血清中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較
小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ mRNA表達于建模后7 d達到高峰，分別為建模前的1.77、1.64倍；此后逐漸下降，于建模后28 d下降至建模前水平(圖 4, 5)。小鼠脾及視網膜組織中IL-4、IL-17 mRNA表達均于建模后14 d達到高峰，分別為建模前的3.28、2.03，3.16、1.93倍；此后逐漸下降，于建模后28 d下降至建模前水平。小鼠脾及視網膜組織中IL-17 mRNA表達升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。
圖4
建模前后小鼠脾組織中IL-17、IL-4、IFN-γmRNA相對表達量比較
圖5
建模前后小鼠視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ mRNA相對表達量比較
小鼠脾及視網膜組織中IFN-γ蛋白表達均于建模后7 d達到高峰，IL-4、IL-17蛋白表達于建模后14 d達到高峰；高峰后逐漸下降，均于建模后28 d下降至建模前水平(圖 6, 7)。小鼠脾及視網膜組織中IL-17蛋白表達升高程度較IFN-γ、IL-4更為顯著。建模前與建模后7、14、21 d小鼠脾(F=312.670、114.250、216.220)及視網膜(F=271.504、85.370、80.722)組織中蛋白表達IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；建模前與建模后28 d小鼠脾及視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。
圖6
建模前后小鼠脾組織中IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白表達比較
圖7
建模前后小鼠視網膜組織中IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白表達比較
3 討論
EAU與人類葡萄膜炎具有許多相似的臨床特點及病理特征，病變主要位于視網膜、葡萄膜，是研究葡萄膜炎較好的動物模型。本研究結果顯示，建模后14 d小鼠炎癥反應達到高峰，證明模型建立成功。
初始CD4+T細胞在IL-12、IFN-γ的誘導下分化為Th1細胞，產生IFN-γ；在轉化生長因子β和IL-6的共同誘導下分化為Th17細胞，分泌IL-17和IL-6；在IL-4的誘導下分化為Th2細胞，分泌IL-4、IL-5和IL-13；其參與炎癥反應和自身免疫性疾病，以Th1和Th2細胞因子抑制Th17的分化。說明在正常機體中，各種細胞因子之間相互影響和制約，達到平衡狀態。當各種原因導致此平衡破壞時，便產生自身免疫性疾病。本研究結果顯示，建模后IL-17、IL-4、IFN-γ這3種細胞因子水平均有不同程度的升高，IL-17、IL-4在建模后14 d達到高峰，IFN-γ于建模后7 d達到高峰，此后小鼠血清中3種因子的含量均逐漸下降。說明在EAU早期，Th1細胞在免疫反應中起主要作用，而Th17和Th2則在中后期占主要地位。新近研究發現，Th17細胞在誘導免疫性疾病方面較Th1的作用更為強烈[6]。初始T細胞于抗原刺激后5~7 d分化為大量成熟的Th17細胞，含量大于Th1細胞，隨后Th1細胞數量逐漸上升，于刺激后10~14d生成量大于Th17細胞[6]。說明在體外實驗中，Th17細胞在免疫反應的早期起主要作用，而Th1細胞在免疫反應的中后期可能占主要地位[7]。該結果與本研究在CD4+T細胞作用時間點上有一定差別，可能與實驗對象和體內外實驗的差別有關，還需要今后進一步的研究證實。
在對燒傷后小鼠機體免疫反應的研究中，IFN-γ可阻礙初始CD4+T細胞向Th17路徑分化[8]。本研究結果顯示，IFN-γ在建模后7d高表達，隨后逐漸減少；而IL-17、IL-4在建模后7 d低表達，而建模后14 d達高峰。這或許提示IFN-γ抑制了Th17路徑的分化，但還有待今后研究加以證實。
體外實驗研究證實，抑制Th1細胞的發育，可以增強Th17細胞的分化和加重由IL-17介導的免疫應答反應[7]。同樣，Th1、Th2細胞各自的特征性細胞因子IFN-γ、IL-4均抑制了誘導分化Th17細胞的細胞因子IL-23[1]。據此我們推測，在免疫應答反應中，Th1、Th2和Th17細胞共同參與且互相抑制各自的分化。說明3種細胞因子相互作用，不能將某一特定的細胞因子完全視為致病性或保護性因子，而應將其視為復雜的分子機制的一部分。
