引用本文： 董凱, 周恩亮, 朱子誠, 文磊, 馮敬仰, 閆泉, 柯根杰, 孫曉東. 實驗性視網膜脫離后光感受器細胞的壞死性凋亡. 中華眼底病雜志, 2014, 30(4): 378-380. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.04.011 復制
視網膜脫離時視網膜色素上皮層和神經纖維層分離，組織缺血、缺氧及激活死亡受體通路，可以導致光感受器細胞的凋亡[1, 2]。近年來研究發現，壞死性凋亡也是一種基本細胞死亡形式，亦受死亡受體通路激活，其發生與組織缺血、缺氧有著密切關系[3]。視網膜脫離后存在死亡受體通路的激活，光感受器細胞不僅有凋亡，同時還可能發生壞死性凋亡[4]。我們的前期研究發現，采用泛半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制劑進行誘導后，會導致視網膜脫離中光感受器細胞的壞死性凋亡[5]。但在單純視網膜脫離中，沒有外源性干預的情況下，光感受器細胞壞死性凋亡的發生情況目前尚不清楚。為此，我們通過建立視網膜脫離大鼠模型，觀察了單純視網膜脫離中光感受器細胞壞死性凋亡的形態學特點，并初步探討了其發生機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
本研究實驗操作均嚴格遵守美國視覺眼科研究學會對動物實驗的要求和上海交通大學、安徽醫科大學對動物實驗的規定。雄性健康的Sprague-Dawley大鼠60只，體重約260~280 g，由上海交通大學附屬第一人民醫院提供。參照文獻[5-8]的方法，右眼視網膜下注入1%透明質酸納(美國博士倫公司)50 μl建立視網膜脫離模型作為實驗組，左眼不作處理為對照組。顯微鏡下可見局部視網膜脫離約占1/2范圍，脫離范圍于結膜面用10-0縫線做標記。
參照文獻[5, 6, 9]的方法，采用電子顯微鏡觀察光感受器細胞的死亡方式。建模后3 d，視網膜組織經2.5％戊二醛固定液固定12 h后，依次浸透、包埋、烤片。切片機切片、染色后，JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)觀察并拍照。每張切片首先根據內界膜的位置確定視網膜組織的位置，然后在雙極細胞和光感受器細胞內節之間確定光感受器細胞的位置，隨機選擇200個光感受器細胞，通過形態學的改變判定視網膜脫離后光感受器細胞的死亡方式。以光感受器細胞皺縮，染色質邊聚為凋亡細胞；細胞腫脹，質膜不完整、破裂為壞死細胞[10, 11]；細胞腫脹，質膜不完整、破裂，且染色質濃集和邊聚，并伴有明顯的自噬泡和空泡為壞死性凋亡[3, 12-14]。
參照文獻[5, 11, 15]的方法和蛋白質免疫印跡(Western blot)法說明書對大鼠視網膜組織進行Western blot檢測。建模后3 d，取視網膜組織，測定蛋白濃度。取等量蛋白質，依次行電泳分離、轉膜、封閉。洗膜緩沖液(TBST)洗膜，加入一抗4℃過夜。復溫后TBST洗膜3次，加入二抗，顯影定影。采用Bandscan 43軟件(加拿大Glyko公司)測定條帶灰度值。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參照。將裂解的Caspase 8與β-actin的灰度比值作為裂解的Caspase 8蛋白相對表達水平。
參照文獻[5, 15, 16]的方法和免疫沉淀法說明書行對大鼠視網膜組織進行免疫沉淀檢測。建模后3 d，收集視網膜標本，1 mg視網膜組織中加入1 mg/ml的抗受體相互作用蛋白1(RIP1)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)1 μl和蛋白質A/G瓊脂糖膠粒40 μl(碧云天生物技術研究所)，Tris緩沖液洗滌沉淀5次。取部分或全部樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。將磷酸化RIP1(p-RIP1)與RIP1蛋白的灰度比值作為p-RIP1蛋白相對表達水平。
采用SPSS 17.0統計軟件行統計分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
電子顯微鏡觀察發現，視網膜脫離后光感受器細胞的死亡方式主要為凋亡和壞死(圖 1，2)。同時還可觀察到光感受器細胞的壞死性凋亡，其形態學與壞死細胞類似，但染色質濃集和邊聚，且伴有明顯的自噬泡和空泡(圖 3)。
圖1
光感受器細胞凋亡電子顯微鏡像。細胞皺縮，染色質邊聚(白箭)標尺：1 μm??圖 2??光感受器細胞壞死電子顯微鏡像。細胞腫脹，質膜不完整、破裂(白箭)標尺：1 μm??圖 3??光感受器細胞壞死性凋亡電子顯微鏡像。細胞腫脹，質膜不完整、破裂，染色質濃集和邊聚(白箭)，且伴有明顯的自噬泡和空泡(白箭頭)標尺：1 μm??圖 4??實驗組與對照組裂解的Caspase 8和p-RIP1蛋白相對表達比較。*：與對照組比較，P<0.05
Western blot檢測結果顯示，實驗組、對照組裂解的Caspase 8蛋白相對表達分別為0.78±0.03、0.06±0.01，實驗組裂解的Caspase 8蛋白相對表達較對照組明顯增加。兩組裂解的Caspase 8蛋白相對表達比較，差異有統計學意義(F=4 023.21，P<0.05)(圖 4)。
免疫沉淀法檢測結果顯示，實驗組、對照組p-RIP1蛋白相對表達分別為0.23±0.03、0.14±0.02，實驗組p-RIP1蛋白相對表達較對照組明顯增加。兩組p-RIP1蛋白相對表達比較，差異有統計學意義(F=56.44，P<0.05)(圖 4)。
3 討論
死亡受體通路的激活，除引起細胞凋亡以外，還可以導致細胞發生壞死性凋亡[3]。本研究結果顯示，單純視網膜脫離后，光感受器細胞不僅出現了凋亡和壞死的病理學形態改變，同時部分細胞也表現為染色質濃集和邊聚，并且可以觀察到明顯的自噬泡和空泡，符合壞死性凋亡的表現[5]。說明在單純視網膜脫離中，沒有Caspase抑制劑的誘導下，光感受器細胞也會出現壞死性凋亡。
研究發現，實驗性視網膜脫離后3 d，光感受器細胞的原位末端標記陽性細胞數達到最高峰[6, 17]。因此，本研究也選用建模后3 d為實驗時間點，采用Western blot和免疫沉淀的方法進一步研究死亡受體通路的標記蛋白Caspase 8的表達情況。結果發現，視網膜脫離后3 d，實驗組裂解的Caspase 8蛋白相對表達較對照組明顯增加。進一步證明了視網膜脫離中有死亡受體通路的激活。
壞死性凋亡同樣也受死亡受體通路的激活，其主要通過死亡受體信號通路中RIP1蛋白來執行，當RIP1被磷酸化后，會傳遞壞死性凋亡信號，所以RIP1磷酸化水平增加是壞死性凋亡特異的生物學標記[3, 13, 14]。Degterev等[3]研究發現，程序性壞死特異性抑制劑Necrostatin-1可以特異性抑制壞死性凋亡，其靶點證實為RIP1的激酶活性，證實了在壞死性凋亡的發生中，RIP1的磷酸化是壞死性凋亡所必須的。本研究結果顯示，視網膜脫離后3 d，實驗組p-RIP1的蛋白相對表達較對照組明顯增加。進一步驗證了在單純視網膜脫離中存在光感受器細胞的壞死性凋亡。
本研究通過視網膜下注入透明質酸鈉成功建立視網膜脫離模型，證明單純視網膜脫離中，沒有外源性干預劑誘導的情況下光感受器細胞也會有壞死性凋亡的發生，其發生機制與RIP1磷酸化水平有關。但在單純視網膜脫離中壞死性凋亡在壞死性細胞中所占比重，以及壞死性凋亡特異性抑制劑干預是否也會有神經保護作用還有待深入研究，這或許可以為視網膜脫離患者臨床恢復和重建視功能提供新的治療思路。
視網膜脫離時視網膜色素上皮層和神經纖維層分離，組織缺血、缺氧及激活死亡受體通路，可以導致光感受器細胞的凋亡[1, 2]。近年來研究發現，壞死性凋亡也是一種基本細胞死亡形式，亦受死亡受體通路激活，其發生與組織缺血、缺氧有著密切關系[3]。視網膜脫離后存在死亡受體通路的激活，光感受器細胞不僅有凋亡，同時還可能發生壞死性凋亡[4]。我們的前期研究發現，采用泛半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制劑進行誘導后，會導致視網膜脫離中光感受器細胞的壞死性凋亡[5]。但在單純視網膜脫離中，沒有外源性干預的情況下，光感受器細胞壞死性凋亡的發生情況目前尚不清楚。為此，我們通過建立視網膜脫離大鼠模型，觀察了單純視網膜脫離中光感受器細胞壞死性凋亡的形態學特點，并初步探討了其發生機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
本研究實驗操作均嚴格遵守美國視覺眼科研究學會對動物實驗的要求和上海交通大學、安徽醫科大學對動物實驗的規定。雄性健康的Sprague-Dawley大鼠60只，體重約260~280 g，由上海交通大學附屬第一人民醫院提供。參照文獻[5-8]的方法，右眼視網膜下注入1%透明質酸納(美國博士倫公司)50 μl建立視網膜脫離模型作為實驗組，左眼不作處理為對照組。顯微鏡下可見局部視網膜脫離約占1/2范圍，脫離范圍于結膜面用10-0縫線做標記。
參照文獻[5, 6, 9]的方法，采用電子顯微鏡觀察光感受器細胞的死亡方式。建模后3 d，視網膜組織經2.5％戊二醛固定液固定12 h后，依次浸透、包埋、烤片。切片機切片、染色后，JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)觀察并拍照。每張切片首先根據內界膜的位置確定視網膜組織的位置，然后在雙極細胞和光感受器細胞內節之間確定光感受器細胞的位置，隨機選擇200個光感受器細胞，通過形態學的改變判定視網膜脫離后光感受器細胞的死亡方式。以光感受器細胞皺縮，染色質邊聚為凋亡細胞；細胞腫脹，質膜不完整、破裂為壞死細胞[10, 11]；細胞腫脹，質膜不完整、破裂，且染色質濃集和邊聚，并伴有明顯的自噬泡和空泡為壞死性凋亡[3, 12-14]。
參照文獻[5, 11, 15]的方法和蛋白質免疫印跡(Western blot)法說明書對大鼠視網膜組織進行Western blot檢測。建模后3 d，取視網膜組織，測定蛋白濃度。取等量蛋白質，依次行電泳分離、轉膜、封閉。洗膜緩沖液(TBST)洗膜，加入一抗4℃過夜。復溫后TBST洗膜3次，加入二抗，顯影定影。采用Bandscan 43軟件(加拿大Glyko公司)測定條帶灰度值。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參照。將裂解的Caspase 8與β-actin的灰度比值作為裂解的Caspase 8蛋白相對表達水平。
參照文獻[5, 15, 16]的方法和免疫沉淀法說明書行對大鼠視網膜組織進行免疫沉淀檢測。建模后3 d，收集視網膜標本，1 mg視網膜組織中加入1 mg/ml的抗受體相互作用蛋白1(RIP1)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)1 μl和蛋白質A/G瓊脂糖膠粒40 μl(碧云天生物技術研究所)，Tris緩沖液洗滌沉淀5次。取部分或全部樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。將磷酸化RIP1(p-RIP1)與RIP1蛋白的灰度比值作為p-RIP1蛋白相對表達水平。
采用SPSS 17.0統計軟件行統計分析，實驗數據以均數±標準差(
2 結果
電子顯微鏡觀察發現，視網膜脫離后光感受器細胞的死亡方式主要為凋亡和壞死(圖 1，2)。同時還可觀察到光感受器細胞的壞死性凋亡，其形態學與壞死細胞類似，但染色質濃集和邊聚，且伴有明顯的自噬泡和空泡(圖 3)。
圖1
光感受器細胞凋亡電子顯微鏡像。細胞皺縮，染色質邊聚(白箭)標尺：1 μm??圖 2??光感受器細胞壞死電子顯微鏡像。細胞腫脹，質膜不完整、破裂(白箭)標尺：1 μm??圖 3??光感受器細胞壞死性凋亡電子顯微鏡像。細胞腫脹，質膜不完整、破裂，染色質濃集和邊聚(白箭)，且伴有明顯的自噬泡和空泡(白箭頭)標尺：1 μm??圖 4??實驗組與對照組裂解的Caspase 8和p-RIP1蛋白相對表達比較。*：與對照組比較，P<0.05
Western blot檢測結果顯示，實驗組、對照組裂解的Caspase 8蛋白相對表達分別為0.78±0.03、0.06±0.01，實驗組裂解的Caspase 8蛋白相對表達較對照組明顯增加。兩組裂解的Caspase 8蛋白相對表達比較，差異有統計學意義(F=4 023.21，P<0.05)(圖 4)。
免疫沉淀法檢測結果顯示，實驗組、對照組p-RIP1蛋白相對表達分別為0.23±0.03、0.14±0.02，實驗組p-RIP1蛋白相對表達較對照組明顯增加。兩組p-RIP1蛋白相對表達比較，差異有統計學意義(F=56.44，P<0.05)(圖 4)。
3 討論
死亡受體通路的激活，除引起細胞凋亡以外，還可以導致細胞發生壞死性凋亡[3]。本研究結果顯示，單純視網膜脫離后，光感受器細胞不僅出現了凋亡和壞死的病理學形態改變，同時部分細胞也表現為染色質濃集和邊聚，并且可以觀察到明顯的自噬泡和空泡，符合壞死性凋亡的表現[5]。說明在單純視網膜脫離中，沒有Caspase抑制劑的誘導下，光感受器細胞也會出現壞死性凋亡。
研究發現，實驗性視網膜脫離后3 d，光感受器細胞的原位末端標記陽性細胞數達到最高峰[6, 17]。因此，本研究也選用建模后3 d為實驗時間點，采用Western blot和免疫沉淀的方法進一步研究死亡受體通路的標記蛋白Caspase 8的表達情況。結果發現，視網膜脫離后3 d，實驗組裂解的Caspase 8蛋白相對表達較對照組明顯增加。進一步證明了視網膜脫離中有死亡受體通路的激活。
壞死性凋亡同樣也受死亡受體通路的激活，其主要通過死亡受體信號通路中RIP1蛋白來執行，當RIP1被磷酸化后，會傳遞壞死性凋亡信號，所以RIP1磷酸化水平增加是壞死性凋亡特異的生物學標記[3, 13, 14]。Degterev等[3]研究發現，程序性壞死特異性抑制劑Necrostatin-1可以特異性抑制壞死性凋亡，其靶點證實為RIP1的激酶活性，證實了在壞死性凋亡的發生中，RIP1的磷酸化是壞死性凋亡所必須的。本研究結果顯示，視網膜脫離后3 d，實驗組p-RIP1的蛋白相對表達較對照組明顯增加。進一步驗證了在單純視網膜脫離中存在光感受器細胞的壞死性凋亡。
本研究通過視網膜下注入透明質酸鈉成功建立視網膜脫離模型，證明單純視網膜脫離中，沒有外源性干預劑誘導的情況下光感受器細胞也會有壞死性凋亡的發生，其發生機制與RIP1磷酸化水平有關。但在單純視網膜脫離中壞死性凋亡在壞死性細胞中所占比重，以及壞死性凋亡特異性抑制劑干預是否也會有神經保護作用還有待深入研究，這或許可以為視網膜脫離患者臨床恢復和重建視功能提供新的治療思路。
