藍光照射對人視網膜色素上皮細胞鈣離子-蛋白激酶C信號通路的影響_《中華眼底病雜志》

作者：

武志鵬 ,  蔡善君 , 呂建平 , 李海輝 , 宮鑫 , 宿罡 , 汪利敏 , 王麗麗

563003 遵義醫學院附屬醫院眼科;

關鍵詞：

眼損傷/病理生理學視網膜色素上皮細胞凋亡光刺激

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.03.014

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的觀察藍光照射對人視網膜色素上皮細胞鈣離子(Ca²⁺)-蛋白激酶C(PKC)信號通路的影響。方法體外培養并鑒定人視網膜色素上皮(RPE)細胞,取第4代人RPE細胞隨機分組進行實驗。采用蛋白免疫印跡法測定培養細胞PKC蛋白表達,檢測佛波酯(PMA)和鈣磷酸結合蛋白(calphostin C)對PKC活性的影響,確定PMA與calphostin C影響PKC活性的最適宜濃度。采用非放射性核素法測定藍光照射處理對培養細胞PKC活性的影響。采用20 W,波長450~500 nm醫用藍光燈作為光源,光照強度(2000±500) Lux,照射6 h,24 h后終止培養,以此制造體外培養人RPE細胞光損傷。將培養細胞隨機分成5個組,即無光照、單純光照、光照聯合硝苯地平、光照聯合calphostin C、光照聯合PMA組。其中,無光照組不接受光照;單純光照組僅接受光照;光照聯合硝苯地平組接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照聯合calphostin C組接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照聯合PMA組接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺熒光探針標記各組培養細胞,激光掃描共焦顯微鏡測定各組細胞內Ca²⁺濃度。比較各組細胞內Ca²⁺濃度差異。結果經鑒定,體外培養人RPE細胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA處理的RPE細胞中PKC蛋白相對表達量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA處理的RPE細胞,差異有統計學意義(F=217.537,P<0.05),但100.0、200.0 nmol/L PMA處理組間PKC蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P=0.072)。100.0、200.0 nmol/L calphostin C處理的RPE細胞中PKC蛋白相對表達量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C處理的RPE細胞,差異有統計學意義(F=164.543,P<0.05),但100.0、200.0 nmol/L calphostin C處理組間PKC蛋白相對表達量比較,差異無統計學意義(P=0.385)。藍光照射處理后,RPE細胞的PKC活性顯著升高,與未接受藍光照射處理的RPE細胞的PKC活性比較,差異有統計學意義(t=-9.869,P<0.05)。單純光照、光照聯合硝苯地平、光照聯合Calphostin C、光照聯合PMA組的RPE細胞內Ca²⁺濃度均高于無光照組,差異有統計學意義(F=26 764.92,P<0.05);光照聯合PMA組RPE細胞內Ca²⁺濃度高于單純光照、光照聯合硝苯地平及光照聯合calphostin C組(P<0.05),單純光照組高于光照聯合硝苯地平和光照聯合calphostin C組(P<0.05)。結論藍光照射后人RPE細胞內PKC活性增高,Ca²⁺濃度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低藍光照射后人RPE細胞內Ca²⁺濃度,PMA增加細胞內Ca²⁺濃度。

引用本文： 武志鵬, 蔡善君, 呂建平, 李海輝, 宮鑫, 宿罡, 汪利敏, 王麗麗. 藍光照射對人視網膜色素上皮細胞鈣離子-蛋白激酶C信號通路的影響. 中華眼底病雜志, 2014, 30(3): 284-288. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.03.014 復制

視網膜光損傷是多種玻璃體視網膜病變發生與發展的基礎^[1]。近年來研究證實，視網膜色素上皮(RPE)細胞凋亡是視網膜光損傷的最重要機制^{[2, 3]}。藍光誘導的RPE細胞光損傷即是通過細胞凋亡的機制發生的^[2]。鈣離子(Ca²⁺)作為細胞內最重要的第二信使之一，可以激活細胞內的多種酶類，消耗堿性磷酸酶，產生氧自由基從而誘發細胞凋亡^[4]。蛋白激酶C(PKC)是細胞信號轉導過程中的重要調節酶，它可以通過對氨基酸的磷酸化作用來介導細胞的增生或凋亡過程。項目組前期研究發現，藍光照射體外培養的人RPE細胞后，出現典型細胞凋亡形態變化，線粒體腫脹，內膜嵴消失，照射早期出現線粒體膜電位降低，細胞色素C釋放^{[2, 3]}；藍光照射誘導人RPE細胞凋亡與細胞內游離Ca²⁺濃度增加有關^[5]。但在此過程中PKC活性是否發生變化，這種變化與Ca²⁺濃度增加之間的關系，目前仍不清楚。因此，我們觀察了藍光照射后RPE細胞內PKC活性和Ca²⁺濃度變化，旨在探討Ca²⁺-PKC信號通路在RPE細胞光損傷過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人RPE細胞來源于意外死亡的2名健康成年男性，年齡分別為25、35歲，死亡12 h內取材。實驗程序符合我院人體試驗委員會制定的倫理道德標準，并通過倫理委員會審查。

藍光光源采用天津英澤科技有限公司生產的20 W醫用藍光燈管，光照度儀采用臺灣泰仕光學儀器股份有限公司TES1330A型，Gel-pro凝膠電泳分析系統購自美國Media Cybernetics公司，激光掃描共焦顯微鏡(LSCM)采用德國Leica公司TCS-SP5型。Dulbecco改良Eagle培養基／F12培養基購自美國Hyclone公司，非放射性PKC活性檢測試劑盒購自美國Promega公司，乙酰氧基甲基酯Ca²⁺熒光探針(Fluo 3-AM)購自碧云天生物技術公司，佛波酯(PMA)和鈣磷酸結合蛋白(calphostin C)購自德國Sigma公司。

1.2 細胞培養和鑒定

RPE細胞原代培養、傳代參照蔡善君等^[2]的方法，第4代細胞用于實驗。每組平行對照實驗均在同一個體同一代細胞中進行，用于實驗的RPE細胞，以錐蟲藍染色進行活力測定，RPE細胞的活力均在90%以上。參照文獻[3]的方法，對培養細胞行角蛋白免疫組織化學染色鑒定。

1.3 實驗方法

參照文獻[6, 7]的方法，采用蛋白免疫印跡法測定培養細胞PKC蛋白表達，檢測PMA和calphostin C對PKC活性的影響；確定PMA與calphostin C影響PKC活性的最適宜濃度。將PMA及calphostin C溶于二甲基亞砜(DMSO)制成不同濃度稀釋液。其中，PMA組終濃度分別為0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L；calphostin C組終濃度分別為5.0、25.0、50.0、75.0、100.0、200.0 nmol/L。將人RPE細胞傳至第4代，加入含不同濃度PMA及calphostin C的培養基制作細胞標本，將不同濃度組細胞標本置于37 ℃培養箱中避光孵育12 h。采用0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，加入放射免疫沉淀測定強效裂解液充分裂解，提取各組RPE細胞總蛋白。按雙金雞寧酸法蛋白定量試劑盒說明操作，測定各組RPE細胞蛋白濃度，以20 μg／10 μl進行分裝，依次上樣、電泳、轉膜、封閉、加一抗及二抗孵育后上機檢測。計算PKC條帶與甘油醛-3-磷酸脫氫酶條帶積分吸光度(IA)值的比值并記為細胞膜PKC蛋白相對表達量，以此作為衡量PKC蛋白表達的依據。

采用非放射性核素法測定藍光照射處理對培養細胞PKC活性的影響。將培養細胞隨機分成光照組與對照組。將細胞培養于6孔板中，當細胞近鋪滿時，在37 ℃、5% CO₂培養箱中進行藍光照射。參照文獻[2, 8]的方法，采用20 W醫用藍光燈作為光源，波長為450～500 nm，光照強度為(2000±500) Lux，照射6 h。24 h后終止培養，采用非放射性PKC活性檢測試劑盒測定2組細胞PKC活性變化。按試劑盒說明操作，將所得PKC瓊脂糖凝膠條帶放入Gel-pro凝膠光密度分析儀進行分析，以試劑盒自帶的陽性對照(PC)及陰性對照(NC)組作為參考，以磷酸化PKC與非磷酸化PKC的IA值的比值反映PKC活性，即PKC活化度。所有測量均重復3次，取平均值。

參照文獻[5]的方法，采用Fluo 3-AM Ca²⁺熒光探針檢測不同干預狀態下培養細胞內Ca²⁺濃度，以熒光強度反映Ca²⁺濃度。將培養細胞隨機分成無光照、單純光照、光照聯合硝苯地平、光照聯合calphostin C、光照聯合PMA 5個組。其中，無光照組不接受光照，細胞培養瓶用錫箔紙完全包裹；單純光照組僅接受光照；光照聯合硝苯地平組，在光照前1 h加入濃度為0.1 mmol/L的硝苯地平；光照聯合calphostin C組，在光照前12 h加入濃度為100.0 nmol/L的calphostin C；光照聯合PMA組，在光照前12 h加入濃度為100.0 nmol/L的PMA。采用20 W醫用藍光燈作為光源，波長為450～500 nm，光照強度為(2000±500) Lux，照射6 h，24 h終止培養，檢測各組培養細胞內Ca²⁺濃度。所有測量均重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理。計數資料以均數±標準差(x±s)表示。光照組與對照組PKC活性比較采用獨立樣本t檢驗。不同濃度PMA、calphostin C處理后培養細胞PKC蛋白相對表達量比較及各組細胞內Ca²⁺濃度比較，經方差齊性檢驗方差齊，采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法，行雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

體外培養的細胞經角蛋白免疫組織化學染色后，其細胞質呈棕褐色的陽性反應，證明培養細胞為人RPE細胞(圖 1)。

圖1 體外培養細胞光學顯微鏡像。細胞質呈棕褐色的陽性反應蘇木素 ×200

圖選項

1.	?Organisciak DT, Darrow RM, Barsalou L, et al. Light history and age-related changes in retinal light damage[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39:1107-1116.
2.	蔡善君,嚴密,張軍軍.藍光誘導體外培養的人視網膜色素上皮細胞凋亡[J].中華眼底病志,2005,21:384-387.
3.	蔡善君,嚴密,毛詠秋.藍光致人視網膜色素上皮細胞凋亡與線立體膜電位和細胞色素C的關系[J].中華眼科雜志,2006,42:1095-1102.
4.	Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels[J]. Physiol Rev,2005,85:757-810.
5.	宿罡,宮鑫,蔡善君,等.藍光所致人視網膜色素上皮細胞損傷與細胞內鈣離子含量變化的關系[J].中華實驗眼科雜志,2013,31:734-738.
6.	毛俊峰,劉雙珍,秦文娟,等.蛋白激酶C活性調節劑對豚鼠近視眼視網膜Müller細胞的作用及意義[J].眼科研究,2009,27:5-9.
7.	王中群,李麗華,趙衛星,等.蛋白激酶C活性變化影響內皮-單核細胞黏附[J].中華老年心腦血管病雜志,2008,10:529-532.
8.	宮鑫,蔡善君,李海輝,等.藍光照射對人視網膜色素上皮細胞L-型鈣通道mRNA表達的影響[J].中華眼底病雜志,2013,29:411-415.
9.	Lucas M, Sánchez-Margalet V. Protein kinase C involvement in apoptosis[J]. Gen Pharmacol,1995,26:881-887.
10.	Westlund BS, Cai BL, Zhou JL, et al. Involvement of c-Abl, p53 and the MAP kinase JNK in the cell death program initiated in A2E-laden ARPE-19 cells by exposure to blue light[J]. Apoptosis,2009,14:31-41.
11.	Kumar S, Kain V, Sitasawad SL. High glucose-induced Ca²⁺ overload and oxidative stress contribute to apoptosis of cardiac cells through mitochondrial dependent and independent pathways[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1820:907-920.
12.	Pang DB, Hong J.[Ca²⁺]i homeostasis and caspase-3 gene expression in verapamil-induced retinal pigment epithelium cells apoptosis in vitro[J]. Int J Ophthalmol,2010,3:288-290.

《中華眼底病雜志》

藍光照射對人視網膜色素上皮細胞鈣離子-蛋白激酶C信號通路的影響

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 細胞培養和鑒定

1.3 實驗方法

1.4 統計學方法

2 結果

3 討論

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 細胞培養和鑒定

1.3 實驗方法

1.4 統計學方法

2 結果

3 討論

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