引用本文： 楊華偉, 雷寧玉, 王麗君, 薛有余, 張翠芳. CD147、基質金屬蛋白酶-2和血管內皮生長因子在氧誘導視網膜病變大鼠中的表達. 中華眼底病雜志, 2014, 30(1): 71-74. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.01.018 復制
視網膜新生血管形成及視網膜增生在早產兒視網膜病變(ROP)的發生機制中起主導作用[1]。大量研究證實，血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2在ROP發生過程中降解基底膜，刺激內皮細胞增生，促進血管生成，增加微血管通透性，從而為ROP新生血管的形成提供條件[2-4]。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子CD147在多種疾病的血管病變中發揮重要作用[5-9]。有研究表明，CD147與腫瘤的血管生成關系緊密，可通過誘導MMP和VEGF的表達而促進腫瘤的血管生成，為腫瘤生長、侵襲和轉移提供條件[5, 6]。但目前有關CD147在ROP發生機制中的具體作用還不完全明確。為此，我們通過高氧誘導視網膜病變模型，觀察了CD147、MMP-2、VEGF在大鼠視網膜中的表達，以期進一步探討其在ROP發病機制中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
新生Wistar大鼠84只，山東中醫藥大學動物中心提供。新生鼠自出生后每天更換墊料，并記錄體重變化、睜眼時間和毛發發育情況等。采用隨機數字表法將小鼠分為對照組和高氧組，每組42只。參照文獻[10-12]的方法建立氧誘導視網膜病變大鼠模型，將高氧組大鼠與哺乳母鼠置入接通100%濕潤醫用純氧的密閉透明箱內，流量范圍0.50~0.75 L/min，箱內含氧體積分數為(75±2)%，溫度維持在(23±2)℃，用氧氣分析儀監測并調控箱內氧氣含量。每日將籠盒取出，更換飼料、加食水。連續吸高濃度氧氣飼養7 d后，再置于正常空氣中飼養7 d。建模過程中新生大鼠平均體重變化量相當，平均5~7 d皮膚毛發發育，13~14 d睜眼。對照組大鼠置于正常空氣中飼養14 d，不做任何處理。
大鼠7、14日齡時，每組隨機選取10只大鼠，取1只眼作視網膜鋪片。以0.3 ml/100 g的劑量腹腔注射10％水合氯醛過量麻醉大鼠，立即摘除眼球、固定，去除角膜、晶狀體，放射狀切開4～5片，完整游離視網膜組織。經過漂洗、孵育、脂聯素酶(ADP)染色、甘油明膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜血管形態。大鼠14日齡時，將行視網膜鋪片實驗的大鼠對側眼眼球立即置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常規脫水、石蠟包埋，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位，連續4 μm切片，蘇木精伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察。每只眼球取20張切片，相鄰2張切片間隔30 μm；用雙盲法計數血管內皮細胞核，統計平均每只眼球每張切片突破內界膜的內皮細胞核數。選取切片時避開視盤周圍；計數血管內皮細胞核時僅計數與內界膜有聯系的血管內皮細胞核。
大鼠12、14、16日齡時，每組隨機選取8只大鼠處死，立即摘除眼球置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常規脫水、石蠟包埋，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位，連續4 μm切片。隨機選取20張切片，經常規脫蠟、水化后行免疫組織化學染色。洗去一抗，滴加二抗，二氨基聯苯胺(DAB)染色、脫水透明、中性樹膠封片。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。以細胞棕色染色為陽性反應。采用雙盲法，于400倍光學顯微鏡下，每個樣本的CD147、MMP-2、VEGF切片圖像隨機采集7幅，經Image-pro Plus 6.0軟件對圖像中陽性反應部位進行吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值進行分析。
采用 SPSS 13.0 統計軟件對數據進行統計分析，實驗數據均以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，大鼠7日齡時，對照組大鼠視網膜血管呈放射狀分布，血管徑較粗(圖 1A)；高氧組大鼠視網膜血管收縮，大面積無血管區，僅見少量小面積的血管網(圖 1B)。大鼠14日齡時，對照組大鼠視網膜血管發育較好，網格規整(圖 2A)；高氧組大鼠視網膜血管增生、紆曲、擴張，并在灌注區與非灌注區交界處形成新生血管叢、滲出、出血(圖 2B)。
光學顯微鏡觀察發現，大鼠14日齡時，對照組僅在極少數切片中見到突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核，高氧組可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(圖 3)。對照組、高氧組突破內界膜的內皮細胞核數分別為(1.30±1.26)、(19.70±3.56)個；兩組比較，差異有統計學意義(t=21.813，P<0.01)。
光學顯微鏡觀察發現，對照組大鼠視網膜各層可見CD147、MMP-2、VEGF有少量表達；高氧組大鼠視網膜各層可見CD147、VEGF、MMP-2表達明顯增多，CD147在視網膜色素上皮層的表達也較明顯(圖 4~6)。大鼠12日齡時，CD147即有較強表達，早于VEGF與MMP-2；隨后三者過表達持續至大鼠16日齡。大鼠12、14、16日齡時，兩組大鼠視網膜各層中CD147(t=5.612、11.390、6.355)、MMP-2(t=4.122、8.047、4.422)、VEGF(t=4.955、12.176、5.110)表達比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。相關性分析發現，CD147的表達與MMP-2、VEGF的表達均呈正相關(r=0.755、0.820，P<0.01)。
圖1
大鼠7日齡時光學顯微鏡像。1A. 對照組，視網膜血管呈放射狀分布，血管徑較粗；1B. 高氧組，視網膜血管收縮，大面積無血管區，僅見少量小面積的血管網 ADP ×100 ? ?圖 2 大鼠14日齡時光學顯微鏡像。2A. 對照組，視網膜血管發育較好，網格規整；2B. 高氧組，視網膜血管增生、紆曲、擴張，并在灌注區與非灌注區交界處形成新生血管叢、滲出、出血 ADP ×100 ? ?圖 3 大鼠14日齡時光學顯微鏡像。3A. 對照組，少見突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核；3B. 高氧組，可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(黑箭) HE ×400 ? ?圖 4 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。4A. 對照組，視網膜各層可見少量CD147表達；4B. 高氧組，視網膜色素上皮層可見大量CD147表達 DAB ×400 ? ?圖 5 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。5A. 對照組，視網膜各層可見少量MMP-2表達；5B. 高氧組，視網膜各層可見大量MMP-2表達 DAB ×400 ? ?圖 6 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。6A. 對照組，視網膜各層可見少量VEGF表達；6B. 高氧組，視網膜各層可見大量VEGF表達 DAB ×400
3 討論
探索并阻斷ROP發生發展過程是臨床關注的一個熱點問題[13-16]。高氧誘導Wistar新生大鼠制備氧誘導視網膜病變是一個成熟并被廣泛使用的疾病模型[10-12]。本研究也采用這種方法建立了氧誘導視網膜病變模型，并通過視網膜鋪片和石蠟切片觀察發現，高氧組大鼠視網膜可見大面積無灌注區、新生血管及突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核，證實模型制備成功。
本研究結果顯示，CD147在大鼠12日齡時即有強表達，且持續至大鼠16日齡。說明CD147在早期表達，持續時間長，可以推測在ROP發生的早期即有CD147的表達，并發揮其促進疾病發生發展的作用。有研究表明，MMP-2、VEGF的明顯表達與ROP的發生發展密切相關[17-19]。但到目前為止，有關CD147在ROP發生機制中的作用及其與MMP-2、VEGF的相關性還少見報道。我們發現，在正常大鼠視網膜各層組織中，CD147呈低表達，符合它存在于正常視網膜，但處于較低水平的特點。而在ROP大鼠中，CD147在各層表達明顯增加，其間接導致血管內皮基質溶解，內皮細胞遷移，新生血管生成。MMP-2是主要參與降解的酶類,VEGF被認為是最主要襲擊視網膜血管生成的因子。本研究結果還顯示，CD147的表達與MMP-2、VEGF表達呈正相關。提示過表達的CD147、MMP-2、VEGF增強視網膜血管生成，導致較差的預后。據此我們推測，CD147、MMP-2、VEGF的相關表達在視網膜血管增生的過程中可看做具有價值的預后評估、干預防治手段。但有關CD147在ROP中促進MMP -2和 VEGF的表達的機制尚需進一步研究。
本研究結果表明，過表達的CD147可能在ROP的發生中扮演重要角色。CD147、MMP-2及VEGF的表達與 ROP的血管增生遷移密切相關，可作為 ROP新生血管發生生物學行為的參考指標。檢測三者的表達有助于對ROP進行早期干預預防，具有重要臨床意義。作為上游分子的CD147，阻斷其表達和活性可能成為 ROP治療的新靶點。今后需進一步從信號通路及基因角度進行深一步的研究。
視網膜新生血管形成及視網膜增生在早產兒視網膜病變(ROP)的發生機制中起主導作用[1]。大量研究證實，血管內皮生長因子(VEGF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2在ROP發生過程中降解基底膜，刺激內皮細胞增生，促進血管生成，增加微血管通透性，從而為ROP新生血管的形成提供條件[2-4]。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子CD147在多種疾病的血管病變中發揮重要作用[5-9]。有研究表明，CD147與腫瘤的血管生成關系緊密，可通過誘導MMP和VEGF的表達而促進腫瘤的血管生成，為腫瘤生長、侵襲和轉移提供條件[5, 6]。但目前有關CD147在ROP發生機制中的具體作用還不完全明確。為此，我們通過高氧誘導視網膜病變模型，觀察了CD147、MMP-2、VEGF在大鼠視網膜中的表達，以期進一步探討其在ROP發病機制中的作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
新生Wistar大鼠84只，山東中醫藥大學動物中心提供。新生鼠自出生后每天更換墊料，并記錄體重變化、睜眼時間和毛發發育情況等。采用隨機數字表法將小鼠分為對照組和高氧組，每組42只。參照文獻[10-12]的方法建立氧誘導視網膜病變大鼠模型，將高氧組大鼠與哺乳母鼠置入接通100%濕潤醫用純氧的密閉透明箱內，流量范圍0.50~0.75 L/min，箱內含氧體積分數為(75±2)%，溫度維持在(23±2)℃，用氧氣分析儀監測并調控箱內氧氣含量。每日將籠盒取出，更換飼料、加食水。連續吸高濃度氧氣飼養7 d后，再置于正常空氣中飼養7 d。建模過程中新生大鼠平均體重變化量相當，平均5~7 d皮膚毛發發育，13~14 d睜眼。對照組大鼠置于正常空氣中飼養14 d，不做任何處理。
大鼠7、14日齡時，每組隨機選取10只大鼠，取1只眼作視網膜鋪片。以0.3 ml/100 g的劑量腹腔注射10％水合氯醛過量麻醉大鼠，立即摘除眼球、固定，去除角膜、晶狀體，放射狀切開4～5片，完整游離視網膜組織。經過漂洗、孵育、脂聯素酶(ADP)染色、甘油明膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜血管形態。大鼠14日齡時，將行視網膜鋪片實驗的大鼠對側眼眼球立即置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常規脫水、石蠟包埋，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位，連續4 μm切片，蘇木精伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察。每只眼球取20張切片，相鄰2張切片間隔30 μm；用雙盲法計數血管內皮細胞核，統計平均每只眼球每張切片突破內界膜的內皮細胞核數。選取切片時避開視盤周圍；計數血管內皮細胞核時僅計數與內界膜有聯系的血管內皮細胞核。
大鼠12、14、16日齡時，每組隨機選取8只大鼠處死，立即摘除眼球置入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h。常規脫水、石蠟包埋，切片方向平行于角膜至視盤的矢狀位，連續4 μm切片。隨機選取20張切片，經常規脫蠟、水化后行免疫組織化學染色。洗去一抗，滴加二抗，二氨基聯苯胺(DAB)染色、脫水透明、中性樹膠封片。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。以細胞棕色染色為陽性反應。采用雙盲法，于400倍光學顯微鏡下，每個樣本的CD147、MMP-2、VEGF切片圖像隨機采集7幅，經Image-pro Plus 6.0軟件對圖像中陽性反應部位進行吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值進行分析。
采用 SPSS 13.0 統計軟件對數據進行統計分析，實驗數據均以均數±標準差(
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，大鼠7日齡時，對照組大鼠視網膜血管呈放射狀分布，血管徑較粗(圖 1A)；高氧組大鼠視網膜血管收縮，大面積無血管區，僅見少量小面積的血管網(圖 1B)。大鼠14日齡時，對照組大鼠視網膜血管發育較好，網格規整(圖 2A)；高氧組大鼠視網膜血管增生、紆曲、擴張，并在灌注區與非灌注區交界處形成新生血管叢、滲出、出血(圖 2B)。
光學顯微鏡觀察發現，大鼠14日齡時，對照組僅在極少數切片中見到突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核，高氧組可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(圖 3)。對照組、高氧組突破內界膜的內皮細胞核數分別為(1.30±1.26)、(19.70±3.56)個；兩組比較，差異有統計學意義(t=21.813，P<0.01)。
光學顯微鏡觀察發現，對照組大鼠視網膜各層可見CD147、MMP-2、VEGF有少量表達；高氧組大鼠視網膜各層可見CD147、VEGF、MMP-2表達明顯增多，CD147在視網膜色素上皮層的表達也較明顯(圖 4~6)。大鼠12日齡時，CD147即有較強表達，早于VEGF與MMP-2；隨后三者過表達持續至大鼠16日齡。大鼠12、14、16日齡時，兩組大鼠視網膜各層中CD147(t=5.612、11.390、6.355)、MMP-2(t=4.122、8.047、4.422)、VEGF(t=4.955、12.176、5.110)表達比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。相關性分析發現，CD147的表達與MMP-2、VEGF的表達均呈正相關(r=0.755、0.820，P<0.01)。
圖1
大鼠7日齡時光學顯微鏡像。1A. 對照組，視網膜血管呈放射狀分布，血管徑較粗；1B. 高氧組，視網膜血管收縮，大面積無血管區，僅見少量小面積的血管網 ADP ×100 ? ?圖 2 大鼠14日齡時光學顯微鏡像。2A. 對照組，視網膜血管發育較好，網格規整；2B. 高氧組，視網膜血管增生、紆曲、擴張，并在灌注區與非灌注區交界處形成新生血管叢、滲出、出血 ADP ×100 ? ?圖 3 大鼠14日齡時光學顯微鏡像。3A. 對照組，少見突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核；3B. 高氧組，可見較多突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核(黑箭) HE ×400 ? ?圖 4 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。4A. 對照組，視網膜各層可見少量CD147表達；4B. 高氧組，視網膜色素上皮層可見大量CD147表達 DAB ×400 ? ?圖 5 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。5A. 對照組，視網膜各層可見少量MMP-2表達；5B. 高氧組，視網膜各層可見大量MMP-2表達 DAB ×400 ? ?圖 6 大鼠14日齡時免疫組織化學染色像。6A. 對照組，視網膜各層可見少量VEGF表達；6B. 高氧組，視網膜各層可見大量VEGF表達 DAB ×400
3 討論
探索并阻斷ROP發生發展過程是臨床關注的一個熱點問題[13-16]。高氧誘導Wistar新生大鼠制備氧誘導視網膜病變是一個成熟并被廣泛使用的疾病模型[10-12]。本研究也采用這種方法建立了氧誘導視網膜病變模型，并通過視網膜鋪片和石蠟切片觀察發現，高氧組大鼠視網膜可見大面積無灌注區、新生血管及突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核，證實模型制備成功。
本研究結果顯示，CD147在大鼠12日齡時即有強表達，且持續至大鼠16日齡。說明CD147在早期表達，持續時間長，可以推測在ROP發生的早期即有CD147的表達，并發揮其促進疾病發生發展的作用。有研究表明，MMP-2、VEGF的明顯表達與ROP的發生發展密切相關[17-19]。但到目前為止，有關CD147在ROP發生機制中的作用及其與MMP-2、VEGF的相關性還少見報道。我們發現，在正常大鼠視網膜各層組織中，CD147呈低表達，符合它存在于正常視網膜，但處于較低水平的特點。而在ROP大鼠中，CD147在各層表達明顯增加，其間接導致血管內皮基質溶解，內皮細胞遷移，新生血管生成。MMP-2是主要參與降解的酶類,VEGF被認為是最主要襲擊視網膜血管生成的因子。本研究結果還顯示，CD147的表達與MMP-2、VEGF表達呈正相關。提示過表達的CD147、MMP-2、VEGF增強視網膜血管生成，導致較差的預后。據此我們推測，CD147、MMP-2、VEGF的相關表達在視網膜血管增生的過程中可看做具有價值的預后評估、干預防治手段。但有關CD147在ROP中促進MMP -2和 VEGF的表達的機制尚需進一步研究。
本研究結果表明，過表達的CD147可能在ROP的發生中扮演重要角色。CD147、MMP-2及VEGF的表達與 ROP的血管增生遷移密切相關，可作為 ROP新生血管發生生物學行為的參考指標。檢測三者的表達有助于對ROP進行早期干預預防，具有重要臨床意義。作為上游分子的CD147，阻斷其表達和活性可能成為 ROP治療的新靶點。今后需進一步從信號通路及基因角度進行深一步的研究。
