視網膜神經節細胞（RGC）的原發性或繼發性死亡是臨床中多種視神經疾病的共同轉歸，常導致嚴重的視功能損害。RGC的內在特點是在細胞分化成熟過程中，細胞內在的生長抑制因子轉錄因子不斷上調，生長誘導轉錄因子不斷下調。同時，RGC受損后外在的抑制性微環境包括氧化應激、慢性炎癥、神經營養因子缺乏、髓鞘蛋白的高度表達和膠質瘢痕的形成均限制了軸突的再生。內在和外在因素共同導致受損后RGC的死亡并阻礙軸突再生。多種神經保護制劑及方法試圖從內在和外在兩方面促進神經保護及軸突再生，熟知這些神經保護策略對進一步拓展該領域的基礎研究及推動其向臨床轉化有著重要意義。
引用本文： 鐘勇, 盧玥竹. 重視視神經保護和再生基礎研究，推動其向臨床轉化. 中華眼底病雜志, 2023, 39(11): 883-886. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20231112-00454 復制
視網膜神經節細胞（RGC）的原發性或繼發性死亡是臨床中多種視神經疾病的共同轉歸，常導致嚴重的視功能損害。臨床常見的致病原因包括青光眼、外傷、缺血、遺傳等因素。RGC固有的特點是在細胞分化成熟過程中，細胞內在的生長抑制因子轉錄因子不斷上調，使細胞內程序轉向抑制增殖，同時生長誘導轉錄因子不斷下調[1]。基于此內在特點，視神經受損后軸突的再生存在諸多障礙。RGC受損后外在的抑制性微環境包括氧化應激、慢性炎癥、神經營養因子缺乏、髓鞘蛋白的高度表達和膠質瘢痕的形成均限制了軸突的再生。視神經是中樞神經系統的一部分，雖然中樞神經受損后的再生能力遠不如周圍神經，但損傷局部的微環境因素對其再生有著重要的影響。盡管神經保護的基礎研究結果鮮有成功的臨床轉化案例，但迄今為止，國內外研究者仍然在神經保護和再生領域，持續不斷進行著探索研究。
1 改善外在抑制性微環境
1.1 改善神經營養因子缺乏狀態
軸突損傷后會破壞神經營養因子的經軸漿逆行運輸，引起由神經營養因子缺乏所致的RGC凋亡。神經營養因子能與軸突末端的特應性受體相結合而被攝取，故通過外源性補充缺乏的神經營養因子或上調特異性受體的表達是神經保護領域早期就已使用的策略之一。神經生長因子（NGF）是神經保護領域最早期運用的神經營養因子，也最多的被應用于神經保護的基礎研究中，既往多項研究已證實NGF的視神經保護作用[2-4]，尤其是NGF滴眼液在青光眼動物模型及臨床患者的應用為神經營養因子的神經保護研究帶來了曙光，但該結論目前仍需更大規模的對照臨床試驗予以佐證。既往也有多項研究證實了腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子（CNTF）等不同種類神經營養因子的RGC保護及神經再生的作用[5-7]。但神經營養因子的臨床應用也面臨著種種困難，例如保護效用有限及維持時間較短，需頻繁玻璃體腔注射給藥等問題也亟待更多的研究來加以解決。
1.2 抗氧化應激損傷
氧化應激損傷也是RGC凋亡途中的重要始動因素，多種抗氧化藥物及制劑也被應用在神經保護和再生領域的研究中。多種維生素都被證實可以通過抗氧化作用減少氧化應激反應，Williams等[8]發現，給予轉基因年齡性青光眼小鼠模型口服維生素B3具有神經保護以及預防性作用。視神經內富含線粒體，而線粒體在缺氧情況下便會產生氧化應激損傷。該研究發現維生素B3具有維穩線粒體的功能，從而達到抗氧化應激的神經保護作用。關于抗氧化制劑，近期一項研究在視神經鉗夾模型中玻璃體腔注射多巴胺納米顆粒觀察到RGC保護及軸突再生作用[9]。該研究發現，多巴胺納米顆粒可以高效清除多種類型的活性氧物質，抑制視網膜中小膠質細胞的激活，減少炎癥并保持視網膜血管內皮屏障功能。盡管多種藥物及制劑都可通過抗氧化的途徑來發揮神經保護作用，但視神經受損后的氧化應激是一個級聯放大且長期的慢性過程，抗氧化藥物及相關制劑如何在眼內長期穩定存在并發揮功效也需要進一步的研究加以解決。
1.3 干細胞及其衍生物移植
近年來關于干細胞移植療法在多個領域被廣泛應用，這使得研究者們產生了使用干細胞及其衍生物作為移植物治療視神經病變的新思路。自1946年Tansley[10]首次在哺乳動物中進行了視網膜移植以來，各種使用不同細胞來源的體內外研究相繼開展，目的均是為了尋找適宜的干細胞移植以達到神經保護的作用。胚胎干細胞（ESC）是從哺乳動物著床前胚胎的內細胞團中分離出的一類干細胞，具有極強的增殖能力和發育分化潛能。將小鼠來源ESC衍生的RGC祖細胞移植到青光眼小鼠模型的視網膜中，成功率超過65%，供體細胞存活期長達12個月，甚至形成軸突[11]。同樣將鼠來源ESC衍生的RGC祖細胞移植入N-甲基-D-天冬氨酸誘導RGC丟失的小鼠模型中，可觀察到細胞成功植入神經節細胞復合體，在移植后2個月可觀察到視功能改善，但未觀察到軸突的形成[12]。同一研究中，研究者們將同樣的細胞移植入鼠臨床前期高眼壓模型中卻未得到理想結果。在另一項研究中，Chao等[13]將人源ESC衍生的視網膜神經元祖細胞經視網膜下移植入松鼠猴，發現細胞存活時間達到3個月，形成軸突并有部分生長入視神經中。然而，全細胞植入療法也存在著一些不可避免的問題，如細胞滯留、植入率有限、免疫排斥以及潛在的致瘤作用。近年來的研究表明，干細胞的作用很大程度上是依賴細胞旁分泌途徑實現，特別是依賴細胞外囊泡（EV）[14]。EV是從細胞膜上脫落或由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，它們作為細胞間轉運膜和可溶性蛋白、脂質、RNA的載體，是一種重要的細胞間通訊方式。多項研究證實了間充質干細胞來源EV的神經保護作用。向玻璃體腔內注射鼠源和人源骨髓間充質干細胞來源的EV都在視神經損傷模型中被證實了顯著的神經保護作用[15-16]。但與其他神經保護制劑類似，細胞外囊泡在玻璃體腔內的駐留時間有限，當被吸收代謝后亦難以長期發揮神經保護作用。
2 促進內在再生能力
盡管學者們已通過多種途徑來改善受損后RGC及軸突的抑制性微環境，但由于RGC分化成熟過程中其內在程序不斷轉向抑制增殖方向，并且當RGC及軸突受到損傷時，逆行生存信號阻斷及逆行死亡信號的產生等因素均不斷地從內在阻礙RGC存活及軸突再生。隨著小鼠遺傳學、轉錄組學的進一步發展及腺病毒載體（AAV）技術的進步，過去十余年的研究確定了與提高RGC及其軸突再生等與存活能力相關的一些內在關鍵性基因，并試圖通過基因治療來為視神經保護領域進一步開辟空間。
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，mTOR通路在調控合成代謝方面發揮功能，與多種細胞的增殖分化有著密不可分的關系。既往mTOR信號傳導通路的失調在多種癌癥相關疾病中被發現。磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）是磷脂酰肌醇-3-羥激酶/mTOR信號通路上游的負調控因子，為了驗證有些腫瘤抑制因子可能會限制神經元再生能力的假設，Park等[17]通過向小鼠玻璃體腔內注射腺病毒，選擇性敲除了PTEN，激活了mTOR通路，首次發現敲除PTEN基因可促進視神經損傷后的軸突再生。隨后，Smith等[18]發現了對Janus激酶/信號傳導和轉錄激活因子通路的負調控因子細胞因子信號轉導抑制分子3（SOCS3）進行敲除也可誘導軸突再生，敲除SOCS3可增強外源性的CNTF。在此重要發現的基礎之上，多名學者進一步探索了PTEN敲除同時聯合調控其他神經再生調節因子的疊加效果。例如，Sun等[19]發現同時敲除PTEN和SOCS3可促進RGC軸突的顯著再生。將PTEN敲除、環磷酸腺苷過表達及玻璃體腔注射癌調蛋白三種方法結合后，也發現了RGC軸突的明顯再生[20]。
既然RGC在細胞分化成熟的過程中內在程序不斷向抑制增殖轉化，有學者對發育期和成熟期的RGC基因表達分別進行鑒定以篩選神經再生的候選靶點，利用胚胎晚期和出生后早期RGC的基因轉錄組學的差異進行篩選，Moore等[1]和Apara等[21]發現了Kruppel樣因子（KLF）轉錄因子家族的成員KLF4和KLF9，并在動物模型中進行了敲除驗證其誘導軸突再生的作用。除了通過運用基因敲除，通過正向刺激發育相關的信號通路產生級聯反應也可促進神經保護和再生，如通過AAV2在視網膜中過表達Lin28這一再生因子也可改善RGC的存活并誘導軸突再生[22]。
當RGC及軸突受到損傷時，損傷會誘導一些內在程序性的改變，如觸發細胞和分子反應，從而阻礙神經再生。一些研究對受損前后RGC的轉錄組學的差異進行研究，揭示了損傷反應和軸突再生的特定信號[19, 23]。近年來，多種新型細胞死亡機制被提出，如Dixon等[24]在2012年首次提出了鐵死亡的概念，它是一種依賴鐵、非凋亡模式的新型細胞死亡方式，主要特征是細胞內脂質過氧化物的堆積。有研究證明，在動物青光眼和視神經鉗夾模型中，鐵死亡是RGC死亡的主要形式，并發現鐵死亡抑制劑可以顯著促進RGC的存活，從而實現神經保護作用[25]。另一項研究表征了小鼠RGC在視神經受損后的11種細胞死亡方式，發現視神經受損后RGC凋亡、自溶、焦亡和鐵死亡途徑的激活，以及受損后早期自噬和吞噬作用的下調，是導致RGC死亡的主要細胞死亡方式[26]。該研究結果通過揭示視神經受損后不同時間點RGC的多種細胞死亡方式，為后續的神經保護提供了潛在的突破口。另外，既然大量的基因表達變化已在受損的RGC中發現，那么關于表觀遺傳重編程在這一過程中的作用也亟待研究者們進行進一步拓展。
盡管在動物實驗中我們已經發現了諸多從增強RGC內在增殖能力角度促進神經保護和再生的方法，但目前仍存在諸多局限性，包括基因敲除技術難以運用到臨床、軸突再生難以與腦中靶目標產生連接、軸突容易停頓生長甚至折返，以及與腦靶目標產生的連接是否是功能性連接以有效恢復視功能等。
雖然基于各種神經受損學說的相關基礎研究在動物實驗中都獲得了令人滿意的神經保護結果，但鑒于實驗研究中出現的免疫排斥、倫理糾紛、可能的腫瘤發生、動物疾病模型和人類疾病的差異以及給藥時間窗控制等等原因，導致在臨床試驗中無法展現出基礎研究獲得的有效神經保護效果，從而無法轉化臨床。盡管如此，堅持不懈的探索有效的視神經保護方法仍然是目前神經眼科和視覺康復領域的研究熱點。
視網膜神經節細胞（RGC）的原發性或繼發性死亡是臨床中多種視神經疾病的共同轉歸，常導致嚴重的視功能損害。臨床常見的致病原因包括青光眼、外傷、缺血、遺傳等因素。RGC固有的特點是在細胞分化成熟過程中，細胞內在的生長抑制因子轉錄因子不斷上調，使細胞內程序轉向抑制增殖，同時生長誘導轉錄因子不斷下調[1]。基于此內在特點，視神經受損后軸突的再生存在諸多障礙。RGC受損后外在的抑制性微環境包括氧化應激、慢性炎癥、神經營養因子缺乏、髓鞘蛋白的高度表達和膠質瘢痕的形成均限制了軸突的再生。視神經是中樞神經系統的一部分，雖然中樞神經受損后的再生能力遠不如周圍神經，但損傷局部的微環境因素對其再生有著重要的影響。盡管神經保護的基礎研究結果鮮有成功的臨床轉化案例，但迄今為止，國內外研究者仍然在神經保護和再生領域，持續不斷進行著探索研究。
1 改善外在抑制性微環境
1.1 改善神經營養因子缺乏狀態
軸突損傷后會破壞神經營養因子的經軸漿逆行運輸，引起由神經營養因子缺乏所致的RGC凋亡。神經營養因子能與軸突末端的特應性受體相結合而被攝取，故通過外源性補充缺乏的神經營養因子或上調特異性受體的表達是神經保護領域早期就已使用的策略之一。神經生長因子（NGF）是神經保護領域最早期運用的神經營養因子，也最多的被應用于神經保護的基礎研究中，既往多項研究已證實NGF的視神經保護作用[2-4]，尤其是NGF滴眼液在青光眼動物模型及臨床患者的應用為神經營養因子的神經保護研究帶來了曙光，但該結論目前仍需更大規模的對照臨床試驗予以佐證。既往也有多項研究證實了腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子（CNTF）等不同種類神經營養因子的RGC保護及神經再生的作用[5-7]。但神經營養因子的臨床應用也面臨著種種困難，例如保護效用有限及維持時間較短，需頻繁玻璃體腔注射給藥等問題也亟待更多的研究來加以解決。
1.2 抗氧化應激損傷
氧化應激損傷也是RGC凋亡途中的重要始動因素，多種抗氧化藥物及制劑也被應用在神經保護和再生領域的研究中。多種維生素都被證實可以通過抗氧化作用減少氧化應激反應，Williams等[8]發現，給予轉基因年齡性青光眼小鼠模型口服維生素B3具有神經保護以及預防性作用。視神經內富含線粒體，而線粒體在缺氧情況下便會產生氧化應激損傷。該研究發現維生素B3具有維穩線粒體的功能，從而達到抗氧化應激的神經保護作用。關于抗氧化制劑，近期一項研究在視神經鉗夾模型中玻璃體腔注射多巴胺納米顆粒觀察到RGC保護及軸突再生作用[9]。該研究發現，多巴胺納米顆粒可以高效清除多種類型的活性氧物質，抑制視網膜中小膠質細胞的激活，減少炎癥并保持視網膜血管內皮屏障功能。盡管多種藥物及制劑都可通過抗氧化的途徑來發揮神經保護作用，但視神經受損后的氧化應激是一個級聯放大且長期的慢性過程，抗氧化藥物及相關制劑如何在眼內長期穩定存在并發揮功效也需要進一步的研究加以解決。
1.3 干細胞及其衍生物移植
近年來關于干細胞移植療法在多個領域被廣泛應用，這使得研究者們產生了使用干細胞及其衍生物作為移植物治療視神經病變的新思路。自1946年Tansley[10]首次在哺乳動物中進行了視網膜移植以來，各種使用不同細胞來源的體內外研究相繼開展，目的均是為了尋找適宜的干細胞移植以達到神經保護的作用。胚胎干細胞（ESC）是從哺乳動物著床前胚胎的內細胞團中分離出的一類干細胞，具有極強的增殖能力和發育分化潛能。將小鼠來源ESC衍生的RGC祖細胞移植到青光眼小鼠模型的視網膜中，成功率超過65%，供體細胞存活期長達12個月，甚至形成軸突[11]。同樣將鼠來源ESC衍生的RGC祖細胞移植入N-甲基-D-天冬氨酸誘導RGC丟失的小鼠模型中，可觀察到細胞成功植入神經節細胞復合體，在移植后2個月可觀察到視功能改善，但未觀察到軸突的形成[12]。同一研究中，研究者們將同樣的細胞移植入鼠臨床前期高眼壓模型中卻未得到理想結果。在另一項研究中，Chao等[13]將人源ESC衍生的視網膜神經元祖細胞經視網膜下移植入松鼠猴，發現細胞存活時間達到3個月，形成軸突并有部分生長入視神經中。然而，全細胞植入療法也存在著一些不可避免的問題，如細胞滯留、植入率有限、免疫排斥以及潛在的致瘤作用。近年來的研究表明，干細胞的作用很大程度上是依賴細胞旁分泌途徑實現，特別是依賴細胞外囊泡（EV）[14]。EV是從細胞膜上脫落或由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，它們作為細胞間轉運膜和可溶性蛋白、脂質、RNA的載體，是一種重要的細胞間通訊方式。多項研究證實了間充質干細胞來源EV的神經保護作用。向玻璃體腔內注射鼠源和人源骨髓間充質干細胞來源的EV都在視神經損傷模型中被證實了顯著的神經保護作用[15-16]。但與其他神經保護制劑類似，細胞外囊泡在玻璃體腔內的駐留時間有限，當被吸收代謝后亦難以長期發揮神經保護作用。
2 促進內在再生能力
盡管學者們已通過多種途徑來改善受損后RGC及軸突的抑制性微環境，但由于RGC分化成熟過程中其內在程序不斷轉向抑制增殖方向，并且當RGC及軸突受到損傷時，逆行生存信號阻斷及逆行死亡信號的產生等因素均不斷地從內在阻礙RGC存活及軸突再生。隨著小鼠遺傳學、轉錄組學的進一步發展及腺病毒載體（AAV）技術的進步，過去十余年的研究確定了與提高RGC及其軸突再生等與存活能力相關的一些內在關鍵性基因，并試圖通過基因治療來為視神經保護領域進一步開辟空間。
雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，mTOR通路在調控合成代謝方面發揮功能，與多種細胞的增殖分化有著密不可分的關系。既往mTOR信號傳導通路的失調在多種癌癥相關疾病中被發現。磷酸酶張力蛋白同源物（PTEN）是磷脂酰肌醇-3-羥激酶/mTOR信號通路上游的負調控因子，為了驗證有些腫瘤抑制因子可能會限制神經元再生能力的假設，Park等[17]通過向小鼠玻璃體腔內注射腺病毒，選擇性敲除了PTEN，激活了mTOR通路，首次發現敲除PTEN基因可促進視神經損傷后的軸突再生。隨后，Smith等[18]發現了對Janus激酶/信號傳導和轉錄激活因子通路的負調控因子細胞因子信號轉導抑制分子3（SOCS3）進行敲除也可誘導軸突再生，敲除SOCS3可增強外源性的CNTF。在此重要發現的基礎之上，多名學者進一步探索了PTEN敲除同時聯合調控其他神經再生調節因子的疊加效果。例如，Sun等[19]發現同時敲除PTEN和SOCS3可促進RGC軸突的顯著再生。將PTEN敲除、環磷酸腺苷過表達及玻璃體腔注射癌調蛋白三種方法結合后，也發現了RGC軸突的明顯再生[20]。
既然RGC在細胞分化成熟的過程中內在程序不斷向抑制增殖轉化，有學者對發育期和成熟期的RGC基因表達分別進行鑒定以篩選神經再生的候選靶點，利用胚胎晚期和出生后早期RGC的基因轉錄組學的差異進行篩選，Moore等[1]和Apara等[21]發現了Kruppel樣因子（KLF）轉錄因子家族的成員KLF4和KLF9，并在動物模型中進行了敲除驗證其誘導軸突再生的作用。除了通過運用基因敲除，通過正向刺激發育相關的信號通路產生級聯反應也可促進神經保護和再生，如通過AAV2在視網膜中過表達Lin28這一再生因子也可改善RGC的存活并誘導軸突再生[22]。
當RGC及軸突受到損傷時，損傷會誘導一些內在程序性的改變，如觸發細胞和分子反應，從而阻礙神經再生。一些研究對受損前后RGC的轉錄組學的差異進行研究，揭示了損傷反應和軸突再生的特定信號[19, 23]。近年來，多種新型細胞死亡機制被提出，如Dixon等[24]在2012年首次提出了鐵死亡的概念，它是一種依賴鐵、非凋亡模式的新型細胞死亡方式，主要特征是細胞內脂質過氧化物的堆積。有研究證明，在動物青光眼和視神經鉗夾模型中，鐵死亡是RGC死亡的主要形式，并發現鐵死亡抑制劑可以顯著促進RGC的存活，從而實現神經保護作用[25]。另一項研究表征了小鼠RGC在視神經受損后的11種細胞死亡方式，發現視神經受損后RGC凋亡、自溶、焦亡和鐵死亡途徑的激活，以及受損后早期自噬和吞噬作用的下調，是導致RGC死亡的主要細胞死亡方式[26]。該研究結果通過揭示視神經受損后不同時間點RGC的多種細胞死亡方式，為后續的神經保護提供了潛在的突破口。另外，既然大量的基因表達變化已在受損的RGC中發現，那么關于表觀遺傳重編程在這一過程中的作用也亟待研究者們進行進一步拓展。
盡管在動物實驗中我們已經發現了諸多從增強RGC內在增殖能力角度促進神經保護和再生的方法，但目前仍存在諸多局限性，包括基因敲除技術難以運用到臨床、軸突再生難以與腦中靶目標產生連接、軸突容易停頓生長甚至折返，以及與腦靶目標產生的連接是否是功能性連接以有效恢復視功能等。
雖然基于各種神經受損學說的相關基礎研究在動物實驗中都獲得了令人滿意的神經保護結果，但鑒于實驗研究中出現的免疫排斥、倫理糾紛、可能的腫瘤發生、動物疾病模型和人類疾病的差異以及給藥時間窗控制等等原因，導致在臨床試驗中無法展現出基礎研究獲得的有效神經保護效果，從而無法轉化臨床。盡管如此，堅持不懈的探索有效的視神經保護方法仍然是目前神經眼科和視覺康復領域的研究熱點。