引用本文： 邵永慧, 張婧, 郭思彤, 劉祎, 姜利斌. 視神經脊髓炎譜系疾病相關性視神經炎患者糖皮質激素沖擊治療前后血清細胞因子變化分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(12): 974-980. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20221111-00602 復制
視神經脊髓炎譜系疾病（NMOSD）是一種免疫介導的中樞神經系統炎癥性疾病，通常表現為急性視神經炎（ON）和（或）橫斷性脊髓炎[1]。與NMOSD相關的特發性ON稱為NMOSD相關ON（NMOSD-ON），是國內最常見的ON類型，大劑量靜脈注射甲潑尼龍沖擊（IVMP）治療是該病急性發作期的主要治療手段[2-3]。水通道蛋白4（AQP4）免疫球蛋白G（lg）抗體（AQP4-IgG）是NMOSD患者特異性自身抗體，但仍有10%～20%的NMOSD患者血清AQP4-IgG呈陰性[4]。近年研究發現，NMOSD中可能存在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白抗體（MOG-Ab）等其他類型的致病抗體[5]。MOG-Ab陽性NMOSD患者的發病機制、臨床表現與預后均不同于AQP4-IgG陽性或兩種抗體均陰性的患者[6]。目前認為NMOSD是T、B淋巴細胞聯合介導的免疫性疾病[7]。其中輔助性T（Th）細胞及其相關的促炎因子上調在其中發揮重要作用。Th細胞是淋巴細胞系CD4+T淋巴細胞的一個亞群，在接受抗原刺激后可分化為效應細胞分泌干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）等細胞因子和其他免疫調節因子。根據Th細胞表達的特異性轉錄因子可大致分為Th1、Th2、Th17、調節性T細胞（Treg）等亞群[8]。既往研究已證實糖皮質激素（以下簡稱為激素）可通過誘導細胞凋亡，細胞因子釋放在多種自身免疫炎性疾病中發揮作用[9]。目前激素治療對于NMOSD-ON發病有關的Th細胞相關因子是否發揮作用的研究較少。因此，本研究對比觀察了一組NMOSD-ON患者IVMP治療前后Th細胞相關因子IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23、IL-4、IL-31、IL- 33、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IFN-γ等的濃度變化。現將結果報道如下。
1 對象和方法
前瞻性臨床研究。本研究經首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會審核批準（批文號：TRECKY2020-0425）；所有患者均獲得知情并簽署書面知情同意書。
2020年11月至2021年12月于首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經眼科檢查確診的NMOSD-ON患者24例25只眼納入本研究。其中，男性9例9只眼；女性15例16只眼。根據中華醫學會眼科學分會神經眼科學組制定的《視神經炎診斷和治療專家共識（2014年）》[10]及《中國脫髓鞘性視神經炎診斷和治療循證指南（2021年）》[11]確立脫髓鞘性ON診斷標準：（1）急性視力下降、伴或不伴眼痛及視盤水腫；（2）至少合并以下2項異常視神經損害相關性視野異常：相對性傳入性瞳孔功能障礙、視覺誘發電位異常、色覺障礙。排除缺血性、外傷性、壓迫性及浸潤性、中毒性及營養代謝性視神經病變。NMOSD-ON診斷標準：ON伴AQP4-lgG抗體陽性或符合AQP4-lgG抗體陰性的NMOSD-ON。
納入標準：（1）符合NMOSD-ON診斷標準；（2）接受并耐受激素治療者。排除標準：（1）血清中含有其他自身抗體如MOG-Ab；（2）3個月內全身應用激素或免疫抑制劑治療者；（3）臨床資料不完整者。
患眼均行最佳矯正視力（BCVA）、視野、光相干斷層掃描檢查以及實驗室血清AQP4-IgG檢測。采用國際標準視力表行BCVA檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。數指、光感、無光感分別為1.85、2.70、3.00 logMAR[12]。采用德國Carl Zeiss公司Cirrus HD-OCT 5000儀測量視盤區視網膜神經纖維層（RNFL）、黃斑區神經節細胞-內叢狀層（GCIPL）厚度。采用德國Zeiss公司Humphrey 740i視野計行視野檢查，記錄平均缺損（MD）值。血清AQP4-IgG抗體檢測采用基于細胞檢測技術的間接免疫熒光法。
依據外周血AQP4-IgG檢測結果將患者分為AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組，分別為10例10只眼和14例15只眼。選取健康志愿者20名作為對照組。三組受檢者年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）；AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼BCVA、視野MD以及黃斑區GCIPL、RNFL厚度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。
表1
三組受檢者基線年齡、性別構成比比較
表2
AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼基線資料比較（
）
患者明確診斷后均給予IVMP治療，500 mg/d或1 000 mg/d，連續3～5 d；其后改為口服醋酸潑尼松1 mg/（kg·d）序貫減量（5 mg/周）。
采集患者空腹外周靜脈血4 ml，置于負壓真空采血管中，混勻靜置30 min。離心半徑15 cm，2 500 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，保存于－80°C低溫冰箱。檢測試劑盒MILLIPLEX?MAP購自德國Merck Milliplex公司，嚴格按照說明書進行操作。采用Luminex FLEX MAP 3D液相懸浮芯片檢測系統（MILLIPLEX Analyst.V5.1軟件）定量分析受檢者血清Th1細胞因子（IFN-γ）、Th2細胞因子（IL-4、IL-31、IL-33）、Th17細胞因子（IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23、TNF-α）、Treg因子（IL-10）水平。采用Cubic Spline曲線擬合方法保存和分析中值熒光強度數據，計算樣品中的分析物濃度。
IVMP治療后1周，采用治療前相同設備和方法行相關檢查。觀察BCVA、視野MD以及GCIPL、RNFL厚度和血清Th1、Th2、Th17、Treg因子濃度變化。
采用SPSS Statistics 26軟件進行統計學分析。呈正態分布的定量數據以均數±標準差（
）表示，治療前后BCVA、視野MD、GCIPL和RNFL厚度比較采用配對樣本t檢驗，三組之間年齡比較采用單因素方差分析；非正態分布定量數據以中位數（四分位間距）［M（P25，P75）］表示，采用Wilcoxon符號秩檢驗，非參數Kruskal-Wallis H檢驗。 Bonferroni 法校正事后兩兩比較的顯著性水平。分類數據采用計數和百分比（%）表示，采用Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
IVMP治療后1周，AQP4-IgG陰性組患眼BCVA、視野MD較治療前顯著改善，RNFL顯著降低，差異均有統計學意義（t=3.145、－2.190、2.495，P=0.004、0.045、0.002）；GCIPL厚度與治療前比較，差異無統計學意義（t=1.250，P=0.232）。AQP4-IgG陽性組患眼BCVA、視野MD以及 RNFL、GCIPL厚度與治療前比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。IVMP 治療后，AQP4- IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者BCVA、視野MD以及RNFL、GCIPL厚度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3）。
表3
IVMP治療后1周AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼logMAR BCVA、視野MD以及GCIPL、RNFL厚度比較（
）
IVMP治療前，與對照組比較，AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者血清IL-17A濃度升高，TNF-α濃度降低；AQP4-IgG陽性組IL-17A濃度、AQP4-IgG陰性組TNF-α濃度差異有統計學意義（H=12.720、10.900，P=0.040、0.039），AQP4- IgG 陰性組IL-17A濃度、AQP4-IgG陽性組TNF-α濃度差異無統計學意義（H=－5.720、－1.878，P=0.575、1.000）。AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者血清IL-17A、TNF-α濃度比較，差異無統計學意義（H=7.000、9.022，P=0.586、0.286）（表4，圖1）。AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者與對照組受檢者之間血清IFN-γ、IL-33、IL-23、IL-31、IL-6、IL‐10、IL-4、IL-21、IFN-γ/IL-4、IL17A/IL-10濃度差異均無統計學意義（H=2.928、4.254、2.564、5.004、0.372、0.675、0.687、1.343、1.318、0.812，P=0.227、0.119、0.277、0.082、0.830、0.709、0.511、0.517、0.666）。
表4
AQP4-IgG陽性組、AQP-IgG4陰性組、對照組受檢者IVMP治療前Th細胞因子水平[pg/ml，M（P25，P75）]
圖1
AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組、對照組受檢者IVMP治療前血清IL-17A、TNF-α濃度比較（n=10、14、20）。1A、1B分別示IL-17A、TNF-α，*P＜0.05。AQP4-IgG：水通道蛋白4免疫球蛋白抗體；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子
與治療前比較，IVMP治療后1周，AQP4-IgG陽性組患者血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-31、IL-17A濃度降低；IL-33、IL-23、IL-21、IL-4濃度升高。IFN-γ、IL-6、TNF-α，差異有統計學意義（Z=－2.201、－2.668、－2.547，P=0.028、0.008、0.011）（表5，圖2A～2C）；IL-10、IL-31、IL-17A，差異無統計學意義（Z=－1.067、－1.000、－1.820，P=0.268、0.317、0.772）；IL-33、IL-23、IL-21、IL-4，差異無統計學意義（Z=－0.840、－0.356、－0.980、－0.677，P=0.401、0.722、0.327、0.498）。IFN-γ/IL-4，IL-17A/IL-10中位值分別為0.106，3.231，較治療前降低，但差異無統計學意義（Z=－0.840、1.362，P=0.401、0.173）。
表5
AQP4-IgG 陽性組、AQP4-IgG 陰性組患者IVMP治療后1周血清Th細胞因子水平[pg/ml，M（P25，P75）]
圖2
AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者IVMP治療前及治療后1周血清IFN-γ、IL-6、TNF-α濃度比較（n=10、14、20）。2A～2C分別示AQP4-lgG陽性組血清IFN-γ、IL-6、TNF-α；2D、2E分別示AQP4-lgG陰性組血清IL-6、TNF-α。*P＜0.05，** P＜0.01。AQP4-IgG：水通道蛋白4免疫球蛋白G抗體；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子
與治療前比較，AQP4-IgG陰性組患者血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-33濃度降低；IL-10、IL-17A、IL-21濃度升高。IL-6、TNF-α，差異有統計學意義（Z=－2.501、－1.978，P=0.012、0.048）（表5；圖2D，2E）；IFN-γ、IL-33，差異無統計學意義（Z=－0.378、－0.910，P=0.706、0.363）；IL-10、IL-17A、IL-21，差異無統計學意義（Z=－0.995，－0.398，－1.224，P=0.320、0.691、0.221）。血清IL-4、IL-23、IL-31濃度與治療前比較無變化，差異無統計學意義（Z=－1.841、－1.133、－0.816，P=0.066、0.257、0.414）。IFN-γ/IL-4、IL-17A/IL-10中位值分別為0.23，2.96，較治療前升高，但差異無統計學意義（Z=－0.785、－0.568，P=0.433、0.570）。
3 討論
NMOSD是病理過程涉及多種免疫細胞及其相關因子的復雜免疫病理過程。其中Th細胞在接受抗原刺激后可分化為效應細胞，分泌IFN、IL等細胞因子。細胞因子通過促進免疫細胞增生，激活免疫系統，參與炎癥反應的發生和發展[8]。NMOSD患者IL-17、IL-6等多種促炎細胞因子表達水平存在異常，但現有研究結果尚不統一。此外，激素治療對于NMOSD-ON發病有關的Th細胞相關因子是否發揮作用，目前缺乏研究證據支持，均需進一步研究證實。
IFN-γ是Th1細胞的主要效應分子，可通過誘導高遷移率族蛋白1激活中性粒細胞參與炎癥反應的發生發展[13]。既往研究表明，NMOSD患者血清IFN-γ水平高于多發性硬化（MS）患者及健康對照者[14]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IFN-γ均高于對照組，但差異無統計學意義，需進一步明確血清IFN-γ在NMOSD中的變化趨勢；IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組患者血清IFN-γ顯著降低，而AQP4-lgG陰性組患者血清IFN-γ水平無明顯變化。既往研究發現，AQP4特異性T細胞以共表達大量Th1和Th2相關細胞因子為特征[15]。該結果提示影響AQP4特異性T細胞功能，可能是激素發揮治療作用的一個途徑。
Th2細胞相關因子包括細胞因子IL-4、IL-31和IL-33。IL-4可直接抑制Th1細胞，抑制幾種有效的促炎癥介質的分泌，包括IL- 1β、TNF-α和活性氧或活性氮等[16]，同時可誘導抗原特異性Treg，促進其增生和擴張以發揮免疫保護作用[17]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-4水平與對照組受檢者差異無統計學意義；IVMP治療后兩組患者血清IL-4水平均無明顯變化。這提示IL‐4可能與NMOSD-ON的免疫過程無關。IL-25、IL-31、IL-33是新發現的Th2相關細胞因子，目前研究相對較少，但被認為可以調節Th2/Th17協同介導的炎癥反應[18]。Zhang等[19]研究表明，NMOSD患者急性期血清IL-31、IL-33水平顯著升高。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組、對照組受檢者血清IL-31、IL-33水平差異無統計學意義；IVMP治療后也無明顯改變。這與上述研究結果不符。其原因可能與樣本量較小有關，需擴大樣本量研究驗證。
Th17細胞相關因子包括IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23和TNF-α等。其中IL-6是一種重要的促炎細胞因子，可促進原始T細胞分化為細胞毒性T細胞或Th17細胞，并激活B細胞合成免疫球蛋白[20]。既往研究表明，NMOSD患者血清及腦脊液中IL-6水平均高于MS患者及健康對照者，且血清IL-6水平與NMOSD患者擴展殘疾狀況評分相關[21-22]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-6水平均較對照組升高，但差異無統計學意義。此與既往研究結果不一致。其原因一方面可能與樣本量受限有關，另一個方面可能提示急性期NMOSD與ON涉及不同的炎癥過程。既往研究發現，在疾病高峰期，實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓以巨噬細胞浸潤為主，大腦和視神經以Ly6G+粒細胞浸潤為主，表明視神經的炎癥與脊髓炎癥損傷機制存在著不同[23]。本研究中AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者IVMP治療后血清IL-6水平均較治療前降低，提示激素可通過影響血清IL-6減輕AQP4-lgG陽性和陰性NMOSD-ON的炎性反應。
IL-17A是Th17細胞的主要效應細胞因子，能誘導巨噬細胞分泌IL-8，吸引中性粒細胞浸潤，并協同IL-22等共同引起血腦屏障的損傷參與NMOSD的發病[24]。目前普遍認為NMOSD患者血清及腦脊液中IL-17A較健康對照者高[25]。本研究結果顯示，在AQP4-lgG陽性組患者血清IL-17A水平顯著升高，而AQP4-lgG陰性組患者、對照組受檢者血清IL-17A水平差異無統計學意義。這與既往研究結果一致[26]，表明IL-17A可能在AQP4-lgG陽性 NMOSD-ON的發病中發揮作用。IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-17A水平均無顯著變化。IL-17A被認為具有激素抵抗性[27]，本研究結果也證實這一點。此外，本研究結果顯示，與Th17細胞增生分化相關的IL-21和IL-23等細胞因子在AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者以及對照組受檢者之間差異均無統計學意義；與IVMP治療前比較，治療后IL-21、IL-23水平亦無明顯改變。這可能提示NMOSD-ON患者血清IL-17A水平上調與IL-21和IL-23水平均不相關。
TNF-α是一種功能多向性細胞因子，一方面可作為促炎介質，在啟動早期炎癥及放大炎癥反應中發揮重要作用；另一方面，也可作為免疫抑制介質，通過限制炎癥過程的程度和持續時間，維持免疫穩態[28]。目前對于血清TNF-α水平在NMOSD患者的變化趨勢仍不清楚，Li等[29]研究發現NMOSD患者血清TNF-α明顯高于健康對照者，而Pento?n-Rol等[30]研究則發現NMOSD患者血清TNF-α水平較健康對照者低。本研究結果顯示，IVMP治療前，AQP4-lgG陰性組患者血清TNF-α水平明顯低于對照組受檢者，而AQP4-lgG陽性組患者與對照組受檢者之間差異無統計學意義；IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清TNF-α水平均顯著降低。這提示激素可通過影響血清TNF-α減輕AQP4-lgG陽性和陰性NMOSD-ON的炎性反應。
Treg主要通過分泌IL-10和轉化生長因子-β，維持免疫耐受。其中IL-10是一種重要的抗炎因子，能直接抑制記憶Th17細胞及Th1類淋巴因子如IL-2、IFN-γ等合成及其活性，此外可正反饋調節叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子+Treg存活[31]。既往研究發現NMOSD患者血清IL-10水平較健康對照者明顯下降[29-30]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者與對照組受檢者之間血清IL-10水平差異無統計學意義，IVMP治療后也無明顯改變。這與上述研究結果不一致，血清IL-10水平是否與NMOSD-ON發病過程相關仍需進一步驗證。
本研究因樣本量限制未將MOG-Ab陽性的ON納入分析。激素對AQP4-lgG陽性和陰性患者血清細胞因子水平產生不同影響，推測在MOG-Ab陽性的ON患者中也會有不同的發現。
視神經脊髓炎譜系疾病（NMOSD）是一種免疫介導的中樞神經系統炎癥性疾病，通常表現為急性視神經炎（ON）和（或）橫斷性脊髓炎[1]。與NMOSD相關的特發性ON稱為NMOSD相關ON（NMOSD-ON），是國內最常見的ON類型，大劑量靜脈注射甲潑尼龍沖擊（IVMP）治療是該病急性發作期的主要治療手段[2-3]。水通道蛋白4（AQP4）免疫球蛋白G（lg）抗體（AQP4-IgG）是NMOSD患者特異性自身抗體，但仍有10%～20%的NMOSD患者血清AQP4-IgG呈陰性[4]。近年研究發現，NMOSD中可能存在髓鞘少突膠質細胞糖蛋白抗體（MOG-Ab）等其他類型的致病抗體[5]。MOG-Ab陽性NMOSD患者的發病機制、臨床表現與預后均不同于AQP4-IgG陽性或兩種抗體均陰性的患者[6]。目前認為NMOSD是T、B淋巴細胞聯合介導的免疫性疾病[7]。其中輔助性T（Th）細胞及其相關的促炎因子上調在其中發揮重要作用。Th細胞是淋巴細胞系CD4+T淋巴細胞的一個亞群，在接受抗原刺激后可分化為效應細胞分泌干擾素（IFN）、白細胞介素（IL）等細胞因子和其他免疫調節因子。根據Th細胞表達的特異性轉錄因子可大致分為Th1、Th2、Th17、調節性T細胞（Treg）等亞群[8]。既往研究已證實糖皮質激素（以下簡稱為激素）可通過誘導細胞凋亡，細胞因子釋放在多種自身免疫炎性疾病中發揮作用[9]。目前激素治療對于NMOSD-ON發病有關的Th細胞相關因子是否發揮作用的研究較少。因此，本研究對比觀察了一組NMOSD-ON患者IVMP治療前后Th細胞相關因子IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23、IL-4、IL-31、IL- 33、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IFN-γ等的濃度變化。現將結果報道如下。
1 對象和方法
前瞻性臨床研究。本研究經首都醫科大學附屬北京同仁醫院倫理委員會審核批準（批文號：TRECKY2020-0425）；所有患者均獲得知情并簽署書面知情同意書。
2020年11月至2021年12月于首都醫科大學附屬北京同仁醫院神經眼科檢查確診的NMOSD-ON患者24例25只眼納入本研究。其中，男性9例9只眼；女性15例16只眼。根據中華醫學會眼科學分會神經眼科學組制定的《視神經炎診斷和治療專家共識（2014年）》[10]及《中國脫髓鞘性視神經炎診斷和治療循證指南（2021年）》[11]確立脫髓鞘性ON診斷標準：（1）急性視力下降、伴或不伴眼痛及視盤水腫；（2）至少合并以下2項異常視神經損害相關性視野異常：相對性傳入性瞳孔功能障礙、視覺誘發電位異常、色覺障礙。排除缺血性、外傷性、壓迫性及浸潤性、中毒性及營養代謝性視神經病變。NMOSD-ON診斷標準：ON伴AQP4-lgG抗體陽性或符合AQP4-lgG抗體陰性的NMOSD-ON。
納入標準：（1）符合NMOSD-ON診斷標準；（2）接受并耐受激素治療者。排除標準：（1）血清中含有其他自身抗體如MOG-Ab；（2）3個月內全身應用激素或免疫抑制劑治療者；（3）臨床資料不完整者。
患眼均行最佳矯正視力（BCVA）、視野、光相干斷層掃描檢查以及實驗室血清AQP4-IgG檢測。采用國際標準視力表行BCVA檢查，統計時換算為最小分辨角對數（logMAR）視力。數指、光感、無光感分別為1.85、2.70、3.00 logMAR[12]。采用德國Carl Zeiss公司Cirrus HD-OCT 5000儀測量視盤區視網膜神經纖維層（RNFL）、黃斑區神經節細胞-內叢狀層（GCIPL）厚度。采用德國Zeiss公司Humphrey 740i視野計行視野檢查，記錄平均缺損（MD）值。血清AQP4-IgG抗體檢測采用基于細胞檢測技術的間接免疫熒光法。
依據外周血AQP4-IgG檢測結果將患者分為AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組，分別為10例10只眼和14例15只眼。選取健康志愿者20名作為對照組。三組受檢者年齡、性別構成比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）；AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼BCVA、視野MD以及黃斑區GCIPL、RNFL厚度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。
表1
三組受檢者基線年齡、性別構成比比較
表2
AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼基線資料比較（）
患者明確診斷后均給予IVMP治療，500 mg/d或1 000 mg/d，連續3～5 d；其后改為口服醋酸潑尼松1 mg/（kg·d）序貫減量（5 mg/周）。
采集患者空腹外周靜脈血4 ml，置于負壓真空采血管中，混勻靜置30 min。離心半徑15 cm，2 500 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，保存于－80°C低溫冰箱。檢測試劑盒MILLIPLEX?MAP購自德國Merck Milliplex公司，嚴格按照說明書進行操作。采用Luminex FLEX MAP 3D液相懸浮芯片檢測系統（MILLIPLEX Analyst.V5.1軟件）定量分析受檢者血清Th1細胞因子（IFN-γ）、Th2細胞因子（IL-4、IL-31、IL-33）、Th17細胞因子（IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23、TNF-α）、Treg因子（IL-10）水平。采用Cubic Spline曲線擬合方法保存和分析中值熒光強度數據，計算樣品中的分析物濃度。
IVMP治療后1周，采用治療前相同設備和方法行相關檢查。觀察BCVA、視野MD以及GCIPL、RNFL厚度和血清Th1、Th2、Th17、Treg因子濃度變化。
采用SPSS Statistics 26軟件進行統計學分析。呈正態分布的定量數據以均數±標準差（）表示，治療前后BCVA、視野MD、GCIPL和RNFL厚度比較采用配對樣本t檢驗，三組之間年齡比較采用單因素方差分析；非正態分布定量數據以中位數（四分位間距）［M（P25，P75）］表示，采用Wilcoxon符號秩檢驗，非參數Kruskal-Wallis H檢驗。 Bonferroni 法校正事后兩兩比較的顯著性水平。分類數據采用計數和百分比（%）表示，采用Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
IVMP治療后1周，AQP4-IgG陰性組患眼BCVA、視野MD較治療前顯著改善，RNFL顯著降低，差異均有統計學意義（t=3.145、－2.190、2.495，P=0.004、0.045、0.002）；GCIPL厚度與治療前比較，差異無統計學意義（t=1.250，P=0.232）。AQP4-IgG陽性組患眼BCVA、視野MD以及 RNFL、GCIPL厚度與治療前比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。IVMP 治療后，AQP4- IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者BCVA、視野MD以及RNFL、GCIPL厚度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表3）。
表3
IVMP治療后1周AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患眼logMAR BCVA、視野MD以及GCIPL、RNFL厚度比較（）
IVMP治療前，與對照組比較，AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者血清IL-17A濃度升高，TNF-α濃度降低；AQP4-IgG陽性組IL-17A濃度、AQP4-IgG陰性組TNF-α濃度差異有統計學意義（H=12.720、10.900，P=0.040、0.039），AQP4- IgG 陰性組IL-17A濃度、AQP4-IgG陽性組TNF-α濃度差異無統計學意義（H=－5.720、－1.878，P=0.575、1.000）。AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組患者血清IL-17A、TNF-α濃度比較，差異無統計學意義（H=7.000、9.022，P=0.586、0.286）（表4，圖1）。AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者與對照組受檢者之間血清IFN-γ、IL-33、IL-23、IL-31、IL-6、IL‐10、IL-4、IL-21、IFN-γ/IL-4、IL17A/IL-10濃度差異均無統計學意義（H=2.928、4.254、2.564、5.004、0.372、0.675、0.687、1.343、1.318、0.812，P=0.227、0.119、0.277、0.082、0.830、0.709、0.511、0.517、0.666）。
表4
AQP4-IgG陽性組、AQP-IgG4陰性組、對照組受檢者IVMP治療前Th細胞因子水平[pg/ml，M（P25，P75）]
圖1
AQP4-IgG陽性組、AQP4-IgG陰性組、對照組受檢者IVMP治療前血清IL-17A、TNF-α濃度比較（n=10、14、20）。1A、1B分別示IL-17A、TNF-α，*P＜0.05。AQP4-IgG：水通道蛋白4免疫球蛋白抗體；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子
與治療前比較，IVMP治療后1周，AQP4-IgG陽性組患者血清IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-31、IL-17A濃度降低；IL-33、IL-23、IL-21、IL-4濃度升高。IFN-γ、IL-6、TNF-α，差異有統計學意義（Z=－2.201、－2.668、－2.547，P=0.028、0.008、0.011）（表5，圖2A～2C）；IL-10、IL-31、IL-17A，差異無統計學意義（Z=－1.067、－1.000、－1.820，P=0.268、0.317、0.772）；IL-33、IL-23、IL-21、IL-4，差異無統計學意義（Z=－0.840、－0.356、－0.980、－0.677，P=0.401、0.722、0.327、0.498）。IFN-γ/IL-4，IL-17A/IL-10中位值分別為0.106，3.231，較治療前降低，但差異無統計學意義（Z=－0.840、1.362，P=0.401、0.173）。
表5
AQP4-IgG 陽性組、AQP4-IgG 陰性組患者IVMP治療后1周血清Th細胞因子水平[pg/ml，M（P25，P75）]
圖2
AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者IVMP治療前及治療后1周血清IFN-γ、IL-6、TNF-α濃度比較（n=10、14、20）。2A～2C分別示AQP4-lgG陽性組血清IFN-γ、IL-6、TNF-α；2D、2E分別示AQP4-lgG陰性組血清IL-6、TNF-α。*P＜0.05，** P＜0.01。AQP4-IgG：水通道蛋白4免疫球蛋白G抗體；IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子
與治療前比較，AQP4-IgG陰性組患者血清IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-33濃度降低；IL-10、IL-17A、IL-21濃度升高。IL-6、TNF-α，差異有統計學意義（Z=－2.501、－1.978，P=0.012、0.048）（表5；圖2D，2E）；IFN-γ、IL-33，差異無統計學意義（Z=－0.378、－0.910，P=0.706、0.363）；IL-10、IL-17A、IL-21，差異無統計學意義（Z=－0.995，－0.398，－1.224，P=0.320、0.691、0.221）。血清IL-4、IL-23、IL-31濃度與治療前比較無變化，差異無統計學意義（Z=－1.841、－1.133、－0.816，P=0.066、0.257、0.414）。IFN-γ/IL-4、IL-17A/IL-10中位值分別為0.23，2.96，較治療前升高，但差異無統計學意義（Z=－0.785、－0.568，P=0.433、0.570）。
3 討論
NMOSD是病理過程涉及多種免疫細胞及其相關因子的復雜免疫病理過程。其中Th細胞在接受抗原刺激后可分化為效應細胞，分泌IFN、IL等細胞因子。細胞因子通過促進免疫細胞增生，激活免疫系統，參與炎癥反應的發生和發展[8]。NMOSD患者IL-17、IL-6等多種促炎細胞因子表達水平存在異常，但現有研究結果尚不統一。此外，激素治療對于NMOSD-ON發病有關的Th細胞相關因子是否發揮作用，目前缺乏研究證據支持，均需進一步研究證實。
IFN-γ是Th1細胞的主要效應分子，可通過誘導高遷移率族蛋白1激活中性粒細胞參與炎癥反應的發生發展[13]。既往研究表明，NMOSD患者血清IFN-γ水平高于多發性硬化（MS）患者及健康對照者[14]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IFN-γ均高于對照組，但差異無統計學意義，需進一步明確血清IFN-γ在NMOSD中的變化趨勢；IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組患者血清IFN-γ顯著降低，而AQP4-lgG陰性組患者血清IFN-γ水平無明顯變化。既往研究發現，AQP4特異性T細胞以共表達大量Th1和Th2相關細胞因子為特征[15]。該結果提示影響AQP4特異性T細胞功能，可能是激素發揮治療作用的一個途徑。
Th2細胞相關因子包括細胞因子IL-4、IL-31和IL-33。IL-4可直接抑制Th1細胞，抑制幾種有效的促炎癥介質的分泌，包括IL- 1β、TNF-α和活性氧或活性氮等[16]，同時可誘導抗原特異性Treg，促進其增生和擴張以發揮免疫保護作用[17]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-4水平與對照組受檢者差異無統計學意義；IVMP治療后兩組患者血清IL-4水平均無明顯變化。這提示IL‐4可能與NMOSD-ON的免疫過程無關。IL-25、IL-31、IL-33是新發現的Th2相關細胞因子，目前研究相對較少，但被認為可以調節Th2/Th17協同介導的炎癥反應[18]。Zhang等[19]研究表明，NMOSD患者急性期血清IL-31、IL-33水平顯著升高。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組、對照組受檢者血清IL-31、IL-33水平差異無統計學意義；IVMP治療后也無明顯改變。這與上述研究結果不符。其原因可能與樣本量較小有關，需擴大樣本量研究驗證。
Th17細胞相關因子包括IL-17A、IL-6、IL-21、IL-23和TNF-α等。其中IL-6是一種重要的促炎細胞因子，可促進原始T細胞分化為細胞毒性T細胞或Th17細胞，并激活B細胞合成免疫球蛋白[20]。既往研究表明，NMOSD患者血清及腦脊液中IL-6水平均高于MS患者及健康對照者，且血清IL-6水平與NMOSD患者擴展殘疾狀況評分相關[21-22]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-6水平均較對照組升高，但差異無統計學意義。此與既往研究結果不一致。其原因一方面可能與樣本量受限有關，另一個方面可能提示急性期NMOSD與ON涉及不同的炎癥過程。既往研究發現，在疾病高峰期，實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓以巨噬細胞浸潤為主，大腦和視神經以Ly6G+粒細胞浸潤為主，表明視神經的炎癥與脊髓炎癥損傷機制存在著不同[23]。本研究中AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者IVMP治療后血清IL-6水平均較治療前降低，提示激素可通過影響血清IL-6減輕AQP4-lgG陽性和陰性NMOSD-ON的炎性反應。
IL-17A是Th17細胞的主要效應細胞因子，能誘導巨噬細胞分泌IL-8，吸引中性粒細胞浸潤，并協同IL-22等共同引起血腦屏障的損傷參與NMOSD的發病[24]。目前普遍認為NMOSD患者血清及腦脊液中IL-17A較健康對照者高[25]。本研究結果顯示，在AQP4-lgG陽性組患者血清IL-17A水平顯著升高，而AQP4-lgG陰性組患者、對照組受檢者血清IL-17A水平差異無統計學意義。這與既往研究結果一致[26]，表明IL-17A可能在AQP4-lgG陽性 NMOSD-ON的發病中發揮作用。IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清IL-17A水平均無顯著變化。IL-17A被認為具有激素抵抗性[27]，本研究結果也證實這一點。此外，本研究結果顯示，與Th17細胞增生分化相關的IL-21和IL-23等細胞因子在AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者以及對照組受檢者之間差異均無統計學意義；與IVMP治療前比較，治療后IL-21、IL-23水平亦無明顯改變。這可能提示NMOSD-ON患者血清IL-17A水平上調與IL-21和IL-23水平均不相關。
TNF-α是一種功能多向性細胞因子，一方面可作為促炎介質，在啟動早期炎癥及放大炎癥反應中發揮重要作用；另一方面，也可作為免疫抑制介質，通過限制炎癥過程的程度和持續時間，維持免疫穩態[28]。目前對于血清TNF-α水平在NMOSD患者的變化趨勢仍不清楚，Li等[29]研究發現NMOSD患者血清TNF-α明顯高于健康對照者，而Pento?n-Rol等[30]研究則發現NMOSD患者血清TNF-α水平較健康對照者低。本研究結果顯示，IVMP治療前，AQP4-lgG陰性組患者血清TNF-α水平明顯低于對照組受檢者，而AQP4-lgG陽性組患者與對照組受檢者之間差異無統計學意義；IVMP治療后，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者血清TNF-α水平均顯著降低。這提示激素可通過影響血清TNF-α減輕AQP4-lgG陽性和陰性NMOSD-ON的炎性反應。
Treg主要通過分泌IL-10和轉化生長因子-β，維持免疫耐受。其中IL-10是一種重要的抗炎因子，能直接抑制記憶Th17細胞及Th1類淋巴因子如IL-2、IFN-γ等合成及其活性，此外可正反饋調節叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子+Treg存活[31]。既往研究發現NMOSD患者血清IL-10水平較健康對照者明顯下降[29-30]。本研究結果顯示，AQP4-lgG陽性組、AQP4-lgG陰性組患者與對照組受檢者之間血清IL-10水平差異無統計學意義，IVMP治療后也無明顯改變。這與上述研究結果不一致，血清IL-10水平是否與NMOSD-ON發病過程相關仍需進一步驗證。
本研究因樣本量限制未將MOG-Ab陽性的ON納入分析。激素對AQP4-lgG陽性和陰性患者血清細胞因子水平產生不同影響，推測在MOG-Ab陽性的ON患者中也會有不同的發現。
