糖尿病視網膜病變（DR）眼底表現復雜多樣，包括神經膠原細胞損傷、血管內皮細胞破壞、新生血管形成和細胞外纖維成分聚集等[1]。Müller細胞是眼內最豐富的視網膜膠質細胞，貫穿視網膜全層，是神經血管單元核心[2-3]。由于其介于視網膜神經元和血管之間，具有獨特的形態和定位，其不僅為周圍神經元提供營養和代謝支持，而且可以重新分配和緩沖代謝廢物、鉀和神經遞質[4]。體外研究表明，Müller細胞激活后會釋放生長因子、趨化因子等細胞因子[5-6]，其中多數對視網膜細胞產生不利影響。Müller細胞可能參與DR血視網膜屏障完整性的改變、新血管形成、視網膜神經膠質增生及慢性炎癥等過程。骨形成蛋白4（BMP4）是一組參與各種細胞過程的骨形態發生蛋白[7]。其在黑色素瘤中上調并促進平滑肌細胞的侵襲和遷移[8]。在斑馬魚胚胎中，BMP4可通過與SMAD元件結合進而增加血管內皮生長因子（VEGF）的釋放，從而促進腎纖維化和血管生成細胞增生[9]。近年有研究報道，BMP4在DR或DR相關疾病的病理生理學中發揮重要功能[10]。我們前期研究發現，高糖誘導下，視網膜血管內皮細胞中BMP4表達有明顯差異，可促進內皮細胞增生和遷移以促進血管生成[11]。BMP4可刺激視網膜色素上皮（RPE）細胞中VEGF分泌進而調節DR患者眼部血管生成[12]。此外，BMP4在高糖刺激的Müller細胞中過表達，進而上調Müller細胞中膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和促炎細胞因子的水平[13]。然而，BMP4如何通過影響Müller細胞的功能進而影響DR的發生發展仍不清楚。本研究初步探討Müller細胞中BMP4的表達水平及BMP4靶向調控其潛在下游分子SMAD同源物9（SMAD9）對Müller細胞增生遷移的作用機制。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人Müller細胞（MIO-M1）由天津醫科大學眼科醫院自行保存。BMP4（ab238298）、SMAD9（ab262940）、VEGF（ab32152）、GFAP（ab7260）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，ab8245）（英國Abcam公司）；谷氨酰胺合成酶（GS）（DF7341，美國Affnity公司）；2'，7'-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽（DCFH-DA）、辣根過氧化物（HRP）偶聯的二抗（美國Sigma公司）；siRNA/miRNA體外轉染試劑（40806ES02，中國Yeasan公司）。
1.2 方法
細胞培養與分組。Müller細胞置于含10％胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）中常規培養。細胞密度達70%～80%時傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。細胞分為分為正常對照組、BMP4組、BMP4+空載質粒組（BMP4+NC組）、BMP4+SMAD9小干擾質粒組（BMP4+siSMAD9）。BMP4組、BMP4+NC組、BMP4+siSMAD9組細胞培養基加入100 ng/ml BMP4誘導細胞24 h[14]。其后，BMP4+NC組轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9組轉染SMAD9小干擾質粒48 h。正常對照組細胞置于DMEM完全培養基培養。siRNA設計：SMAD9正向引物：GGAUUUACAGAUCCUUCAATT，反向引物：UGAAGGAUCUGUAAAUCCTT；NC-siRNA正向引物：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向引物：ACGU GAGUU CGG AGAATT。
細胞劃痕實驗測定BMP4對Müller細胞遷移的影響。細胞密度達到70%～80%時，對細胞進行消化并且以6×105的細胞密度接種于6孔板中。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用ImageJ軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
DCFH-DA探針檢測BMP4對Müller細胞內ROS生成的影響。各組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的50 μl PBS于37 °C下孵育20 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測ROS表達情況。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測Müller細胞內SMAD9、谷氨酰胺合成酶（GS）、GFAP、VEGF蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入40 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。牛血清白蛋白封閉，與一抗BMP4、SMAD9、VEGF、GS、GFAP 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入HRP偶聯的二抗，37 ℃孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以GAPDH為內參，全自動化學發光圖像分析儀曝光。應用Bio-Rad軟件進行半定量分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測Müller細胞內GS、GFAP、SMAD9、VEGF mRNA相對表達量。按照試劑盒說明提取細胞總RNA（6 μg）。DNase I消化清除總RNA中殘留的DNA雜質，將總RNA逆轉錄成cDNA。應用RevertAid cDNA合成試劑盒在20 μl反應混合物中對1 μg總RNA進行逆轉錄。SYBR Green qPCR Master Mix和Roche LC 480 qPCR系統進行qPCR。反應混合物包含SYBR Green FastStart、2倍Master Mix、cDNA模板和基因特異性引物。qPCR擴增條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s；59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 min，40個循環；95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，95℃作用15 s。以GAPDH作為內參。根據擴增曲線，輸出循環閾值（CT），依照公式2?ΔΔCT法進行數據分析。
免疫熒光檢測Müller細胞內VEGF的表達。4%多聚甲醛固定Müller細胞30 min，PBS清洗2次。0.1%Triton X-100的PBS滲透細胞5 min，5%脫脂奶粉孵育細胞。4 °C下與相應一抗過夜孵育，PBS洗滌細胞3次。室溫下與10%山羊血清孵育2 h，熒光團（Alexa 488）結合的二級抗體對細胞進行染色，4',6-二脒基-2-苯基吲哚復染，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.3 統計分析
采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（
±s）表示。兩組間比較采用Student-t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 沉默SMAD9可降低BMP4誘導的Müller細胞遷移
細胞劃痕實驗檢測結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞遷移率較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=68.319，P＜0.001）（圖1）。
圖1
沉默SMAD9對Müller細胞遷移的影響（n=6） 1A～1D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4組+NC組、BMP4+siSMAD9組細胞培養12 h倒置相差顯微鏡像（標尺：200 μm）。BMP4+siSMAD9組僅有少量細胞遷移進入裸區，BMP4組、BMP4組+NC組可見大量細胞遷移進入裸區。1E示4組細胞遷移率比較，*** P＜0.001。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒
2.2 沉默SMAD9可降低BMP4誘導的Müller細胞ROS產生
DCFH-DA探針檢測結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內ROS水平BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=52.158，P＜0.001）（圖2）。
圖2
沉默SMAD9對Müller細胞ROS產生的影響（n=6） 2A～2D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4組+NC組、BMP4+siSMAD9組流式細胞儀檢測圖；2E示4組ROS水平比較。BMP4+siSMAD9組ROS水平較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，***P＜0.001。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒；ROS：活性氧
2.3 沉默SMAD9可抑制Müller細胞活化標志物GS、GFAP表達
Western blot、qPCR檢查結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內GS、GFAP蛋白（F=42.715、36.618）、mRNA相對表達量（F=45.164、43.165）較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）（表1，圖3）。
表1
4組細胞內GS、GFAP蛋白相對表達量比較（
±s）
圖3
4組細胞內GS、GFAP mRNA相對表達量（n=6） BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒；GS：谷氨酰胺合成酶；GFAP：膠質纖維酸性蛋白；**P＜0.01
2.4 沉默SMAD9可下調BMP4誘導的VEGF水平
免疫熒光檢測結果顯示，BMP4組、BMP4+NC組細胞內VEGF熒光強度較正常對照組、BMP4+siSMAD9組顯著升高，差異有統計學意義（F=46.384，P＜0.05）（圖4）。
圖4
沉默SMAD9對BMP4誘導的VEGF表達的影響（n=6） 4A～4D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4+NC組、BMP4+siSMAD9組熒光顯微鏡像（標尺：50 μm），綠色熒光為VEGF表達，藍色熒光為細胞核染色。BMP4組、BMP4+NC組細胞內VEGF熒光強度較正常對照組、BMP4+siSMAD9組顯著升高。4E示4組熒光強度比較，*P＜0.05。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒
3 討論
Müller細胞作為視網膜中最為主要的膠質細胞，對雙極細胞的穩態維持，能量供應等方面都起著重要的作用。因此，Müller細胞的功能障礙會嚴重影響視網膜神經細胞的活動，從而引起視力下降[15]。氧化應激是指氧化成分和抗氧化成分的失衡，在目前的研究中主要是氧化成分過多，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2－）、ROS等。過氧化物主要是由細胞內的線粒體所產生，當線粒體功能障礙時就會引起大量的過氧化物的產生，而過氧化物的產生又會引起線粒體的損傷從而進入細胞胞質內[16]。一方面，胞質內的ROS可以通過如BMP4/SMAD信號通路引起細胞功能改變；另一方面，線粒體的損傷也會因為能量供應問題而引起細胞的損傷。
本研究結果顯示，BMP4可顯著促進Müller細胞遷移及ROS生成，并上調SMAD9的表達水平；沉默SMAD9可有效拮抗BMP4的作用，包括降低Müller細胞的遷移率并減少Müller細胞中ROS的生成。此外，BMP4可顯著上調Müller細胞標志物GS、GFAP的表達，并可促進VEGF的表達，同時沉默SMAD9可發揮其拮抗BMP4的作用，即下調GS、GFAP和VEGF的表達。因此，我們推測BMP4可通過上調SMAD9表達進而促進Müller細胞的遷移及ROS生成。
本研究結果顯示，BMP4組細胞遷移率明顯增加，且ROS生成亦明顯增高。BMP信號轉導參與DR相關細胞的生理和病理過程調節。前期研究發現，BMP4和SMAD9在DR的體內動物模型和體外多種細胞模型（包括視網膜內皮細胞、Müller細胞及RPE細胞）中均表達上調[11]。BMP4可通過促進內皮運動和侵襲及細胞增生以促進血管生成[10]。我們前期研究也發現4-羥基壬烯醛誘導狀態下，視網膜血管內皮細胞中BMP4表達上調，BMP4可促進內皮細胞增生和遷移以促進血管生成[17]。因此，BMP4可促進Müller細胞的遷移及細胞ROS的生成。
BMP4可通過與BMP激活的SMAD結合元件結合，影響R-SMAD（SMAD1、SMAD5和SMAD9）的磷酸化并與SMAD4形成復合物，最終激活BMP靶基因，從而以劑量和時間依賴性方式增加VEGF分泌[18]。大量研究表明，BMP4在C2C12、H9c2、3T3-L1、HepG2、B16細胞和原代成纖維細胞等許多細胞類型中上調SMAD9表達[19-20]。據此我們推測，BMP4在Müller細胞模型中通過SMAD9來發揮作用，進而導致細胞的損傷。
本研究結果顯示，BMP4可顯著上調VEGF表達；沉默SMAD9可發揮其拮抗BMP4的作用，即下調VEGF表達。此外，采用BMP4處理的ARPE-19細胞顯示分泌到培養基中的VEGF顯著增加，表明BMP4可能通過VEGF誘導的機制促進眼部血管生成[12]。研究表明，高糖誘導Müller細胞活化和炎性細胞因子產生，BMP4在Müller細胞中上調，miR-340-5p過表達對炎癥細胞因子VEGF、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α分泌的抑制作用可被BMP4上調所抵消，提示BMP4可促進Müller細胞的活化和炎癥細胞因子的產生[13]。因此，本研究推測BMP4可能通過調控SMAD9的表達進而促進Müller細胞的遷移及ROS生成。
視網膜新生血管和纖維化是增生型DR的標志。近年，有學者提出在DR中應用雙靶點治療的思路，即抑制新生血管以及抑制纖維化在DR的治療中被認為是同等重要的。本研究發現BMP4經調控SMAD9表達進而促進Müller細胞的遷移，這提示通過拮抗BMP4和SMAD9可能在治療DR中發揮重要且全面的作用。拮抗BMP4和SMAD9的表達有望成為增生型DR雙靶點治療的潛在靶點，同時也將成為本課題組今后的研究和探索方向。
糖尿病視網膜病變（DR）眼底表現復雜多樣，包括神經膠原細胞損傷、血管內皮細胞破壞、新生血管形成和細胞外纖維成分聚集等[1]。Müller細胞是眼內最豐富的視網膜膠質細胞，貫穿視網膜全層，是神經血管單元核心[2-3]。由于其介于視網膜神經元和血管之間，具有獨特的形態和定位，其不僅為周圍神經元提供營養和代謝支持，而且可以重新分配和緩沖代謝廢物、鉀和神經遞質[4]。體外研究表明，Müller細胞激活后會釋放生長因子、趨化因子等細胞因子[5-6]，其中多數對視網膜細胞產生不利影響。Müller細胞可能參與DR血視網膜屏障完整性的改變、新血管形成、視網膜神經膠質增生及慢性炎癥等過程。骨形成蛋白4（BMP4）是一組參與各種細胞過程的骨形態發生蛋白[7]。其在黑色素瘤中上調并促進平滑肌細胞的侵襲和遷移[8]。在斑馬魚胚胎中，BMP4可通過與SMAD元件結合進而增加血管內皮生長因子（VEGF）的釋放，從而促進腎纖維化和血管生成細胞增生[9]。近年有研究報道，BMP4在DR或DR相關疾病的病理生理學中發揮重要功能[10]。我們前期研究發現，高糖誘導下，視網膜血管內皮細胞中BMP4表達有明顯差異，可促進內皮細胞增生和遷移以促進血管生成[11]。BMP4可刺激視網膜色素上皮（RPE）細胞中VEGF分泌進而調節DR患者眼部血管生成[12]。此外，BMP4在高糖刺激的Müller細胞中過表達，進而上調Müller細胞中膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和促炎細胞因子的水平[13]。然而，BMP4如何通過影響Müller細胞的功能進而影響DR的發生發展仍不清楚。本研究初步探討Müller細胞中BMP4的表達水平及BMP4靶向調控其潛在下游分子SMAD同源物9（SMAD9）對Müller細胞增生遷移的作用機制。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人Müller細胞（MIO-M1）由天津醫科大學眼科醫院自行保存。BMP4（ab238298）、SMAD9（ab262940）、VEGF（ab32152）、GFAP（ab7260）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，ab8245）（英國Abcam公司）；谷氨酰胺合成酶（GS）（DF7341，美國Affnity公司）；2'，7'-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽（DCFH-DA）、辣根過氧化物（HRP）偶聯的二抗（美國Sigma公司）；siRNA/miRNA體外轉染試劑（40806ES02，中國Yeasan公司）。
1.2 方法
細胞培養與分組。Müller細胞置于含10％胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）中常規培養。細胞密度達70%～80%時傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。細胞分為分為正常對照組、BMP4組、BMP4+空載質粒組（BMP4+NC組）、BMP4+SMAD9小干擾質粒組（BMP4+siSMAD9）。BMP4組、BMP4+NC組、BMP4+siSMAD9組細胞培養基加入100 ng/ml BMP4誘導細胞24 h[14]。其后，BMP4+NC組轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9組轉染SMAD9小干擾質粒48 h。正常對照組細胞置于DMEM完全培養基培養。siRNA設計：SMAD9正向引物：GGAUUUACAGAUCCUUCAATT，反向引物：UGAAGGAUCUGUAAAUCCTT；NC-siRNA正向引物：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向引物：ACGU GAGUU CGG AGAATT。
細胞劃痕實驗測定BMP4對Müller細胞遷移的影響。細胞密度達到70%～80%時，對細胞進行消化并且以6×105的細胞密度接種于6孔板中。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養12 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用ImageJ軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。
DCFH-DA探針檢測BMP4對Müller細胞內ROS生成的影響。各組細胞與含有10 μmol/L DCFH-DA的50 μl PBS于37 °C下孵育20 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測ROS表達情況。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測Müller細胞內SMAD9、谷氨酰胺合成酶（GS）、GFAP、VEGF蛋白相對表達量。收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入40 μg待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。牛血清白蛋白封閉，與一抗BMP4、SMAD9、VEGF、GS、GFAP 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入HRP偶聯的二抗，37 ℃孵育2 h。化學發光試劑盒顯色，以GAPDH為內參，全自動化學發光圖像分析儀曝光。應用Bio-Rad軟件進行半定量分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測Müller細胞內GS、GFAP、SMAD9、VEGF mRNA相對表達量。按照試劑盒說明提取細胞總RNA（6 μg）。DNase I消化清除總RNA中殘留的DNA雜質，將總RNA逆轉錄成cDNA。應用RevertAid cDNA合成試劑盒在20 μl反應混合物中對1 μg總RNA進行逆轉錄。SYBR Green qPCR Master Mix和Roche LC 480 qPCR系統進行qPCR。反應混合物包含SYBR Green FastStart、2倍Master Mix、cDNA模板和基因特異性引物。qPCR擴增條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s；59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 min，40個循環；95 ℃反應15 s，60 ℃反應1 min，95℃作用15 s。以GAPDH作為內參。根據擴增曲線，輸出循環閾值（CT），依照公式2?ΔΔCT法進行數據分析。
免疫熒光檢測Müller細胞內VEGF的表達。4%多聚甲醛固定Müller細胞30 min，PBS清洗2次。0.1%Triton X-100的PBS滲透細胞5 min，5%脫脂奶粉孵育細胞。4 °C下與相應一抗過夜孵育，PBS洗滌細胞3次。室溫下與10%山羊血清孵育2 h，熒光團（Alexa 488）結合的二級抗體對細胞進行染色，4',6-二脒基-2-苯基吲哚復染，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.3 統計分析
采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用Student-t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 沉默SMAD9可降低BMP4誘導的Müller細胞遷移
細胞劃痕實驗檢測結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞遷移率較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=68.319，P＜0.001）（圖1）。
圖1
沉默SMAD9對Müller細胞遷移的影響（n=6） 1A～1D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4組+NC組、BMP4+siSMAD9組細胞培養12 h倒置相差顯微鏡像（標尺：200 μm）。BMP4+siSMAD9組僅有少量細胞遷移進入裸區，BMP4組、BMP4組+NC組可見大量細胞遷移進入裸區。1E示4組細胞遷移率比較，*** P＜0.001。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒
2.2 沉默SMAD9可降低BMP4誘導的Müller細胞ROS產生
DCFH-DA探針檢測結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內ROS水平BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（F=52.158，P＜0.001）（圖2）。
圖2
沉默SMAD9對Müller細胞ROS產生的影響（n=6） 2A～2D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4組+NC組、BMP4+siSMAD9組流式細胞儀檢測圖；2E示4組ROS水平比較。BMP4+siSMAD9組ROS水平較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，***P＜0.001。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒；ROS：活性氧
2.3 沉默SMAD9可抑制Müller細胞活化標志物GS、GFAP表達
Western blot、qPCR檢查結果顯示，BMP4+siSMAD9組細胞內GS、GFAP蛋白（F=42.715、36.618）、mRNA相對表達量（F=45.164、43.165）較BMP4組、BMP4+NC組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）（表1，圖3）。
表1
4組細胞內GS、GFAP蛋白相對表達量比較（±s）
圖3
4組細胞內GS、GFAP mRNA相對表達量（n=6） BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒；GS：谷氨酰胺合成酶；GFAP：膠質纖維酸性蛋白；**P＜0.01
2.4 沉默SMAD9可下調BMP4誘導的VEGF水平
免疫熒光檢測結果顯示，BMP4組、BMP4+NC組細胞內VEGF熒光強度較正常對照組、BMP4+siSMAD9組顯著升高，差異有統計學意義（F=46.384，P＜0.05）（圖4）。
圖4
沉默SMAD9對BMP4誘導的VEGF表達的影響（n=6） 4A～4D分別示正常對照組、BMP4組、BMP4+NC組、BMP4+siSMAD9組熒光顯微鏡像（標尺：50 μm），綠色熒光為VEGF表達，藍色熒光為細胞核染色。BMP4組、BMP4+NC組細胞內VEGF熒光強度較正常對照組、BMP4+siSMAD9組顯著升高。4E示4組熒光強度比較，*P＜0.05。BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+轉染轉染空載質粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+轉染SMAD9小干擾質粒
3 討論
Müller細胞作為視網膜中最為主要的膠質細胞，對雙極細胞的穩態維持，能量供應等方面都起著重要的作用。因此，Müller細胞的功能障礙會嚴重影響視網膜神經細胞的活動，從而引起視力下降[15]。氧化應激是指氧化成分和抗氧化成分的失衡，在目前的研究中主要是氧化成分過多，包括過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2－）、ROS等。過氧化物主要是由細胞內的線粒體所產生，當線粒體功能障礙時就會引起大量的過氧化物的產生，而過氧化物的產生又會引起線粒體的損傷從而進入細胞胞質內[16]。一方面，胞質內的ROS可以通過如BMP4/SMAD信號通路引起細胞功能改變；另一方面，線粒體的損傷也會因為能量供應問題而引起細胞的損傷。
本研究結果顯示，BMP4可顯著促進Müller細胞遷移及ROS生成，并上調SMAD9的表達水平；沉默SMAD9可有效拮抗BMP4的作用，包括降低Müller細胞的遷移率并減少Müller細胞中ROS的生成。此外，BMP4可顯著上調Müller細胞標志物GS、GFAP的表達，并可促進VEGF的表達，同時沉默SMAD9可發揮其拮抗BMP4的作用，即下調GS、GFAP和VEGF的表達。因此，我們推測BMP4可通過上調SMAD9表達進而促進Müller細胞的遷移及ROS生成。
本研究結果顯示，BMP4組細胞遷移率明顯增加，且ROS生成亦明顯增高。BMP信號轉導參與DR相關細胞的生理和病理過程調節。前期研究發現，BMP4和SMAD9在DR的體內動物模型和體外多種細胞模型（包括視網膜內皮細胞、Müller細胞及RPE細胞）中均表達上調[11]。BMP4可通過促進內皮運動和侵襲及細胞增生以促進血管生成[10]。我們前期研究也發現4-羥基壬烯醛誘導狀態下，視網膜血管內皮細胞中BMP4表達上調，BMP4可促進內皮細胞增生和遷移以促進血管生成[17]。因此，BMP4可促進Müller細胞的遷移及細胞ROS的生成。
BMP4可通過與BMP激活的SMAD結合元件結合，影響R-SMAD（SMAD1、SMAD5和SMAD9）的磷酸化并與SMAD4形成復合物，最終激活BMP靶基因，從而以劑量和時間依賴性方式增加VEGF分泌[18]。大量研究表明，BMP4在C2C12、H9c2、3T3-L1、HepG2、B16細胞和原代成纖維細胞等許多細胞類型中上調SMAD9表達[19-20]。據此我們推測，BMP4在Müller細胞模型中通過SMAD9來發揮作用，進而導致細胞的損傷。
本研究結果顯示，BMP4可顯著上調VEGF表達；沉默SMAD9可發揮其拮抗BMP4的作用，即下調VEGF表達。此外，采用BMP4處理的ARPE-19細胞顯示分泌到培養基中的VEGF顯著增加，表明BMP4可能通過VEGF誘導的機制促進眼部血管生成[12]。研究表明，高糖誘導Müller細胞活化和炎性細胞因子產生，BMP4在Müller細胞中上調，miR-340-5p過表達對炎癥細胞因子VEGF、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α分泌的抑制作用可被BMP4上調所抵消，提示BMP4可促進Müller細胞的活化和炎癥細胞因子的產生[13]。因此，本研究推測BMP4可能通過調控SMAD9的表達進而促進Müller細胞的遷移及ROS生成。
視網膜新生血管和纖維化是增生型DR的標志。近年，有學者提出在DR中應用雙靶點治療的思路，即抑制新生血管以及抑制纖維化在DR的治療中被認為是同等重要的。本研究發現BMP4經調控SMAD9表達進而促進Müller細胞的遷移，這提示通過拮抗BMP4和SMAD9可能在治療DR中發揮重要且全面的作用。拮抗BMP4和SMAD9的表達有望成為增生型DR雙靶點治療的潛在靶點，同時也將成為本課題組今后的研究和探索方向。
