糖尿病微血管病變（MCD）主要包括糖尿病視網膜病變（DR）和糖尿病腎病（DKD），兩者因存在共同的病理基礎，常兼并發生。中華醫學會腎臟病學分會專家組制定的“糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南”[1]提出，糖尿病患者出現尿白蛋白的同時發生視網膜微血管病變有助于DKD診斷。“眼腎同治”是未來MCD臨床診療中的重要方向。但目前尚缺乏同時觀察糖尿病視網膜和腎臟微血管病變的體內研究。為此，本研究通過制備2型糖尿病（T2DM）微血管病變大鼠模型，觀察模型相關指標和穩定性，以期構建一種可用于體內實驗的動物模型。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；血糖試紙（德國Roche公司）；胰島素（武漢圣達威科技有限公司）；4%多聚甲醛（武漢塞維爾生物科技有限公司）；水合氯醛（北京沃凱生物科技有限公司）。高速低溫離心機、電熱恒溫水浴鍋、干燥箱、電子天平、超純水系統、酸度計、－80°C冰箱、高壓滅菌鍋、渦旋振蕩器、羅氏血糖儀其后逐一列出公司名、全自動生化儀（日本日立公司）；光學顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；LKB超微切片；光相干斷層掃描（OCT）儀（德國蔡司公司CIRRUS HD-OCT 5000）、電子顯微鏡（日本Hitachi公司HT7800）。
健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，鼠齡6～8周齡，體重180～200 g，無特定病原體級（SPF），中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供［動物許可證號：SCXK（甘）2020-0002，合格證號：0002975］。均飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗中心［許可證號：SYXK（甘）2015-0005］。本研究通過甘肅中醫藥大學實驗動物倫理審核（倫理編號：IACUC2019-084）。
大鼠隨機分為空白組、模型組，分別為10、30只，按體重梯度均勻分配。適應性喂養1周后，空白組大鼠喂養普通維持飼料；模型組大鼠喂養高脂高糖飼料（北京科奧協力飼料有限公司）。喂養5周后大鼠禁食不禁水16 h，參照文獻[2-4]和前期預實驗結果，模型組大鼠按體重35 mg/kg劑量經腹腔單次注射1% STZ建立T2DM模型，72 h后取大鼠尾尖血檢測隨機血糖（GLU）≥16.7 mmol/L為建模成功；空白組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。T2DM模型建模成功后持續喂養至第10周，觀察大鼠建模后狀態改變，包括毛色、精神狀態、活動情況、飲水、進食等變化；采集樣本進行后續實驗。剔除死亡和GLU回退大鼠，最終模型組16只大鼠納入分析。
MCD建模成功標準[5-6]：（1）GLU≥16.7 mmol/L；（2）微量尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）、尿微量白蛋白（mAlb）等腎功能指標異常；（3）OCT血管成像（OCTA）檢查視網膜微血管異常；（4）視網膜及腎臟出現病理改變。
建模后4周，采集動脈血、尿樣標本檢測血肌酸酐（CREA）、血尿素氮（UREA）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）及mAlb、尿肌酐（UCr）、尿糖。大鼠禁食不禁水12 h，采血前收集隨機尿，按體重1 ml/100 g雙蒸水灌胃，1 h后采用反射排尿法采集大鼠尿液。麻醉后腹主動脈采血，離心送檢。實驗過程采用羅氏血糖儀監測血糖變化，血糖儀檢測范圍0.6～33.3 mmol/L，顯示Lo、Hi分別記為0.6、33.3 mmol/L。計算UACR。采樣后取出腎臟，生理鹽水清洗，電子天平稱重，計算大鼠腎臟指數（KW/BW）。KW/BW=腎臟重量（mg）/大鼠體重（kg）。
OCTA觀察大鼠視網膜淺層毛細血管叢血管變化及無灌注區情況。采用美國Carl Zeiss公司Cirrus HD-OCT 5000儀行OCTA檢查。大鼠麻醉后復方托吡卡胺滴眼液散瞳，人工淚液保持角膜濕潤，根據大鼠屈光狀態添加—20 D前置鏡，掃描范圍6 mm×6 mm。全程監測大鼠呼吸頻率，保溫。檢查結束后處死大鼠，摘除眼球。
蘇木精-伊紅（HE）、高碘酸-雪夫（PAS）染色觀察大鼠腎臟、視網膜形態結構變化。大鼠腎臟及眼球置于含4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作4 μm厚度的連續切片。HE、PAS染色，光學顯微鏡下觀察拍照。視網膜HE染色切片，觀察視網膜厚度和各層組織學改變；腎臟HE染色切片，觀察腎小球基底膜及系膜區改變。PAS染色切片，觀察腎小球和視網膜微血管基底膜著染程度，明確糖原分布及組織改變。
免疫熒光染色觀察大鼠視網膜Müller細胞神經纖維及細胞核表達情況。摘除的眼球于顯微鏡下剪除角膜及晶狀體，4%多聚甲醛固定過夜。0.5%TritonX-100磷酸鹽緩沖液（PBS）透膜，常溫下封閉（含5%山羊血清的PBS），一抗[封閉液稀釋的肌動蛋白-膠質纖維酸性蛋白（GFAP）]孵育過夜，PBS浸洗后室溫避光孵育二抗，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色，PBS浸洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。細胞胞漿呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。
透射電子顯微鏡觀察視網膜組織超微結果。顯微鏡下剝離視網膜，4℃，2.5%戊二醛固定過夜，PBS沖洗，1%鋨酸固定2 h，乙醇丙酮脫水，環氧樹脂包埋、半薄切片行光學顯微鏡定位，制作50 nm超薄切片，乙酸鈾酰和檸檬鉛染色。透射電子顯微鏡觀察并照相記錄。
采用SPSS21.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（
）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
建模后 72 h，模型組30只大鼠中，GLU≥16.7 mmol/L 23只大鼠，成模率76.7%（23/30）。實驗過程中，空白組大鼠體重明顯增加，精神活動良好。模型組23只成模大鼠中，死亡6只（20.0%，6/30），GLU＜16.7mmol/L 1只；建模后1周內可見大鼠多飲多尿，第2周出現多食，明顯消瘦，精神滯怠，蜷臥少動，毛黑無澤，脫落成束。
空白組、模型組大鼠GLU分別為（8.14±1.33）、（28.23±3.96）mmol/L；體重分別為（408.83±6.16）、（273.77±6.03）g。與空白組比較，模型組大鼠隨機血糖顯著升高，體重顯著下降，差異均有統計學意義（t=5.755、－51.291，P=0.029、＜0.001）（圖1）。
圖1
建模后空白組、模型組大鼠隨機血糖、體重變化（n=8） 1A示隨機血糖；1B示體重。與空白組比較，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001
與空白組比較，模型組大鼠腎臟指數、尿糖、UACR、mAlb升高，腎臟指數、尿糖、UACR差異均有統計學意義（P＜0.05），mAlb差異無統計學意義（P＞0.05）；UCr顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；CREA降低，TG、TC、HDL-C、LDL-C升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；UREA升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
大鼠成模后腎功能相關指標比較（
）
表2
大鼠成模后血清指標比較（
）
光學顯微鏡觀察發現，空白組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，密度均勻；模型組大鼠視網膜內界膜腫脹、增厚，內核層（INL）、外核層（ONL）排列疏松、紊亂，密度降低（圖2）。空白組大鼠腎臟組織空白組大鼠腎臟組織腎小球、腎小管形態結構規整，未見明顯異常（圖3A，3B）；腎臟組織模型組大鼠腎小球充血，皮質管狀上皮腫脹，基底膜輕度增厚，系膜區增寬（圖3C，3D）。
圖2
空白組、模型組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（標尺：200 μm） 2A示蘇木精-伊紅染色像；2B示高碘酸-雪夫染色像。左圖為空白組，右圖為模型組。空白組大鼠視網膜各層細胞排列整齊（2A、2C）。模型組視網膜內界膜腫脹、增厚，INL、ONL外核層排列疏松、紊亂（2B），視網膜厚度增加，內核層、外核層排列紊亂（2D） GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；IS/OS：橢圓體帶
圖3
空白組、模型組大腎臟組織光學顯微鏡像（標尺：200 μm） 3A、3B示空白組，腎臟組織染色均勻，腎小球、腎小管、皮質、囊腔等結構形態規整。3C、3D示模型組，腎小球充血，皮質管狀上皮腫脹，基底膜輕度增厚，系膜區增寬（3C）；腎小球體積增大，囊腔狹窄，系膜基質和系膜細胞彌漫性輕度增生，系膜區紫紅色糖原沉積物明顯增加（3D） 3A、3C和3B、3D分別為蘇木精-伊紅、高碘酸-雪夫染色
免疫熒光顯微鏡觀察發現，模型組大鼠視網膜內、外叢狀層呈片狀強綠色熒光表達，INL、ONL呈散在點狀綠色熒光表達；空白組大鼠未見綠色熒光表達（圖4A，4B）。與空白組比較，模型組大鼠視網膜Müller細胞胞漿綠色熒光表達顯著增強，差異有統計學意義（t=－7.354，P=0.002）；細胞核藍色熒光表達差異無統計學意義（圖4C）。
圖4
空白組、模型組大鼠視網膜免疫熒光表達情況 4A、4B分別示空白組、模型組共聚焦熒光顯微鏡像（標尺：20 μm）。GFAP標記的視網膜Müller細胞胞漿呈綠色熒光；DAPI標記的細胞核呈藍色熒光。4C示兩組視網膜熒光表達結果（n=6），與空白組比較，***P＜0.001 GFAP：膠質纖維酸性蛋白；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
OCTA檢查結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠視網膜淺層毛細血管叢可見明顯無灌注區和輕度血管紆曲彎折（圖5）。
圖5
空白組、模型組大鼠光相干斷層掃描血管成像 5A示空白組，視網膜淺層毛細血管叢形態及走形規則；5B示模型組，視網膜淺層毛細血管叢可見明顯無灌注區（紅星）和輕度血管紆曲彎折
透射電子顯微鏡觀察發現，空白組大鼠視網膜微血管基底膜均勻平整，無增厚，周細胞位于血管壁外層，核較大，呈近橢圓形，內皮細胞位于血管內壁，核扁平較小；模型組大鼠視網膜微血管基底膜輕度增厚，血管內皮細胞明顯水腫，內皮細胞核固縮、核膜皺縮，周細胞核固縮，線粒體輕度腫脹，管腔變窄（圖6）。
圖6
空白組、模型組大鼠視網膜透射電子顯微鏡像（乙酸鈾酰和檸檬鉛染色，標尺：2 μm） 6A示空白組，視網膜微血管基底膜無增厚，周細胞核較大呈近橢圓形，內皮細胞核扁平較小；6B示模型組，視網膜微血管基底膜輕度增厚，血管內皮細胞明顯水腫，內皮細胞核固縮、核膜皺縮，周細胞核固縮，線粒體輕度腫脹，管腔變窄 E：內皮細胞；EN：內皮細胞核；P：周細胞；PN：周細胞核；BM：基底膜；lumen：管腔。*：視網膜神經節細胞核；黑箭：線粒體
3 討論
MCD為糖尿病常見慢性微血管并發癥，可導致腎功能衰竭、視功能喪失等嚴重損害。全身內皮功能障礙是MCD的關鍵發病機制，主要病理特征為一氧化氮釋放減少、氧化應激增強、炎癥因素增加、血管生成異常和內皮修復受損等[7-9]。血管內皮細胞損傷程度隨著糖尿病病程進展而逐漸加重，在糖尿病中晚期常損及視網膜和腎小球微血管，DR和DKD存在共同的病理基礎，微血管的異常改變是MCD模型成立的重要依據。臨床研究發現，50%以上的糖尿病患者同時并發DR與DKD[10]。本研究結果顯示，盡管在DKD早期尿微量白蛋白升高而無顯著性差異，但腎功能關鍵指標UACR提示已經出現了腎小球損害；MCD大鼠存在脂代謝紊亂，提示模型組大鼠視網膜Müller細胞激活明顯。Hsieh等[11]發現，DKD和DR在全身治療反應中存在時間順序的相關性。郭振紅[12]觀察自發模型OLETF大鼠DKD與DR各個時期病理變化的相關性，發現大鼠發生DKD時視網膜病理切片結果提示已出現新生血管，表明DKD可能早于DR出現。因此，建立穩定可靠的MCD眼腎微血管病變體內模型有助于糖尿病的分子機制分析、藥效學評價和系統診療體系的形成。
既往研究表明，通過長期高脂飼養可引發大鼠胰島素抵抗，發病過程更貼近人類T2DM，但缺點是極大地增加了實驗時間和經費[13]。而若同時配合低劑量STZ，既可縮短建模時間，提高成模效率，又能反應T2DM的自然病程[14]。胰島破壞和β細胞丟失是STZ誘發糖尿病的機制，其不同劑量可制備1型糖尿病（T1DM）或T2DM[15]。目前常用方案是高脂高糖飼料聯合低劑量STZ制備T2DM模型。另外，通過直接高劑量STZ建立的T1DM模型也被廣泛用于糖尿病并發癥研究[16-17]。但有研究表明，STZ在糖尿病造模劑量下對動物有明顯的腎臟毒性，通常劑量為65 mg/kg的STZ可引起明顯的腎小管壞死和腎毒性，嚴重影響DKD的模型評價[18-19]。有學者通過總結大量T2DM模型研究后發現，高脂飲食配合低劑量STZ可建立穩定的T2DM模型，但需考慮到STZ注射劑量、濃度、途徑、時間和環境，禁食起止時間，飼料配方等因素對T2DM造模的影響，并提出血糖和胰島素/c肽水平是識別T2DM進展階段的重要因素[20]。
MCD是糖尿病慢性并發癥，其動物模型建立需首先考慮基礎病的制備，進一步研究其微血管病變。但目前T2DM的微血管并發癥模型多以單一病種進行研究，且T2DM成模后維持高脂飼養時間不一。Sugano等[21]發現STZ注射后維持高脂飼養7周內可檢測到嚴重的mAlb，隨后則出現白蛋白尿。高雪等[22]觀察了STZ注射后高脂飼養不同時間大鼠腎臟功能，發現STZ注射后繼續高脂飼養4周大鼠可出現尿白蛋白排泄率升高。Matboli等[4]也發現STZ注射后繼續高脂飼養4周大鼠腎臟功異常和病理改變。此外，另有學者總結分析了DR建模方案，低劑量STZ注射后維持高脂飼養4周即可觀察到血視網膜屏障破壞，ONL變薄，無細胞毛細血管增多等表現[3]。目前還沒有模型能同時完全概括DR與DKD在每一階段發生的病理生理學改變，但每種模型都再現了多種疾病的表型。
本研究在經典T2DM建模方案[2, 20, 23]基礎上，結合目前DR[3]和DKD[4]的模型制備，擬定MCD建模方案：4周高脂高糖飲食聯合35 mg/kg 1% STZ，建模后維持高脂高糖飼養4周，觀察視網膜及腎臟病變。此方案在原有基礎上加入“高糖”，進一步縮短了T2DM微血管并發癥的建模時間，同時可觀察到眼和腎臟微血管病變[24]。實驗過程中模型組大鼠死亡6只，GLU＜16.7 mmol/L 1只，死亡率為20%（6/30）。
本研究建模方案成功誘導了MCD視網膜和腎微血管病變，模型成模率較高，穩定性較好，可用于MCD病理及新藥干預研究。但本研究仍存在以下不足：（1）實驗過程未進行階段性取材，無法確定最早出現視網膜及腎微血管病變的時間點，難以對照疾病的分期分型；（2）T2DM建模后維持高脂高糖飼養時間較短，對于需長時間干預的藥物研究缺乏進一步穩定性證據；（3）實驗過程中未收集飲水進食量，不能量化糖尿病三多一少表現；（4）實驗過程中對視網膜進行了免疫熒光檢測，初步觀察到視網膜Müller細胞的異常活化，提示DR不僅是一種血管疾病，也是一種神經退行性疾病，尚缺乏電子顯微鏡等超微結果的直觀證據[25]。今后研究將進一步完善上述不足，以進一步驗證本研究結果。
糖尿病微血管病變（MCD）主要包括糖尿病視網膜病變（DR）和糖尿病腎病（DKD），兩者因存在共同的病理基礎，常兼并發生。中華醫學會腎臟病學分會專家組制定的“糖尿病腎臟疾病臨床診療中國指南”[1]提出，糖尿病患者出現尿白蛋白的同時發生視網膜微血管病變有助于DKD診斷。“眼腎同治”是未來MCD臨床診療中的重要方向。但目前尚缺乏同時觀察糖尿病視網膜和腎臟微血管病變的體內研究。為此，本研究通過制備2型糖尿病（T2DM）微血管病變大鼠模型，觀察模型相關指標和穩定性，以期構建一種可用于體內實驗的動物模型。現將結果報道如下。
1 材料和方法
鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；血糖試紙（德國Roche公司）；胰島素（武漢圣達威科技有限公司）；4%多聚甲醛（武漢塞維爾生物科技有限公司）；水合氯醛（北京沃凱生物科技有限公司）。高速低溫離心機、電熱恒溫水浴鍋、干燥箱、電子天平、超純水系統、酸度計、－80°C冰箱、高壓滅菌鍋、渦旋振蕩器、羅氏血糖儀其后逐一列出公司名、全自動生化儀（日本日立公司）；光學顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；LKB超微切片；光相干斷層掃描（OCT）儀（德國蔡司公司CIRRUS HD-OCT 5000）、電子顯微鏡（日本Hitachi公司HT7800）。
健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，鼠齡6～8周齡，體重180～200 g，無特定病原體級（SPF），中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供［動物許可證號：SCXK（甘）2020-0002，合格證號：0002975］。均飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗中心［許可證號：SYXK（甘）2015-0005］。本研究通過甘肅中醫藥大學實驗動物倫理審核（倫理編號：IACUC2019-084）。
大鼠隨機分為空白組、模型組，分別為10、30只，按體重梯度均勻分配。適應性喂養1周后，空白組大鼠喂養普通維持飼料；模型組大鼠喂養高脂高糖飼料（北京科奧協力飼料有限公司）。喂養5周后大鼠禁食不禁水16 h，參照文獻[2-4]和前期預實驗結果，模型組大鼠按體重35 mg/kg劑量經腹腔單次注射1% STZ建立T2DM模型，72 h后取大鼠尾尖血檢測隨機血糖（GLU）≥16.7 mmol/L為建模成功；空白組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。T2DM模型建模成功后持續喂養至第10周，觀察大鼠建模后狀態改變，包括毛色、精神狀態、活動情況、飲水、進食等變化；采集樣本進行后續實驗。剔除死亡和GLU回退大鼠，最終模型組16只大鼠納入分析。
MCD建模成功標準[5-6]：（1）GLU≥16.7 mmol/L；（2）微量尿白蛋白/尿肌酐比值（UACR）、尿微量白蛋白（mAlb）等腎功能指標異常；（3）OCT血管成像（OCTA）檢查視網膜微血管異常；（4）視網膜及腎臟出現病理改變。
建模后4周，采集動脈血、尿樣標本檢測血肌酸酐（CREA）、血尿素氮（UREA）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）及mAlb、尿肌酐（UCr）、尿糖。大鼠禁食不禁水12 h，采血前收集隨機尿，按體重1 ml/100 g雙蒸水灌胃，1 h后采用反射排尿法采集大鼠尿液。麻醉后腹主動脈采血，離心送檢。實驗過程采用羅氏血糖儀監測血糖變化，血糖儀檢測范圍0.6～33.3 mmol/L，顯示Lo、Hi分別記為0.6、33.3 mmol/L。計算UACR。采樣后取出腎臟，生理鹽水清洗，電子天平稱重，計算大鼠腎臟指數（KW/BW）。KW/BW=腎臟重量（mg）/大鼠體重（kg）。
OCTA觀察大鼠視網膜淺層毛細血管叢血管變化及無灌注區情況。采用美國Carl Zeiss公司Cirrus HD-OCT 5000儀行OCTA檢查。大鼠麻醉后復方托吡卡胺滴眼液散瞳，人工淚液保持角膜濕潤，根據大鼠屈光狀態添加—20 D前置鏡，掃描范圍6 mm×6 mm。全程監測大鼠呼吸頻率，保溫。檢查結束后處死大鼠，摘除眼球。
蘇木精-伊紅（HE）、高碘酸-雪夫（PAS）染色觀察大鼠腎臟、視網膜形態結構變化。大鼠腎臟及眼球置于含4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，制作4 μm厚度的連續切片。HE、PAS染色，光學顯微鏡下觀察拍照。視網膜HE染色切片，觀察視網膜厚度和各層組織學改變；腎臟HE染色切片，觀察腎小球基底膜及系膜區改變。PAS染色切片，觀察腎小球和視網膜微血管基底膜著染程度，明確糖原分布及組織改變。
免疫熒光染色觀察大鼠視網膜Müller細胞神經纖維及細胞核表達情況。摘除的眼球于顯微鏡下剪除角膜及晶狀體，4%多聚甲醛固定過夜。0.5%TritonX-100磷酸鹽緩沖液（PBS）透膜，常溫下封閉（含5%山羊血清的PBS），一抗[封閉液稀釋的肌動蛋白-膠質纖維酸性蛋白（GFAP）]孵育過夜，PBS浸洗后室溫避光孵育二抗，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）避光染色，PBS浸洗后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。細胞胞漿呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。
透射電子顯微鏡觀察視網膜組織超微結果。顯微鏡下剝離視網膜，4℃，2.5%戊二醛固定過夜，PBS沖洗，1%鋨酸固定2 h，乙醇丙酮脫水，環氧樹脂包埋、半薄切片行光學顯微鏡定位，制作50 nm超薄切片，乙酸鈾酰和檸檬鉛染色。透射電子顯微鏡觀察并照相記錄。
采用SPSS21.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
建模后 72 h，模型組30只大鼠中，GLU≥16.7 mmol/L 23只大鼠，成模率76.7%（23/30）。實驗過程中，空白組大鼠體重明顯增加，精神活動良好。模型組23只成模大鼠中，死亡6只（20.0%，6/30），GLU＜16.7mmol/L 1只；建模后1周內可見大鼠多飲多尿，第2周出現多食，明顯消瘦，精神滯怠，蜷臥少動，毛黑無澤，脫落成束。
空白組、模型組大鼠GLU分別為（8.14±1.33）、（28.23±3.96）mmol/L；體重分別為（408.83±6.16）、（273.77±6.03）g。與空白組比較，模型組大鼠隨機血糖顯著升高，體重顯著下降，差異均有統計學意義（t=5.755、－51.291，P=0.029、＜0.001）（圖1）。
圖1
建模后空白組、模型組大鼠隨機血糖、體重變化（n=8） 1A示隨機血糖；1B示體重。與空白組比較，*P＜0.05，** P＜0.01，***P＜0.001
與空白組比較，模型組大鼠腎臟指數、尿糖、UACR、mAlb升高，腎臟指數、尿糖、UACR差異均有統計學意義（P＜0.05），mAlb差異無統計學意義（P＞0.05）；UCr顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；CREA降低，TG、TC、HDL-C、LDL-C升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；UREA升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
大鼠成模后腎功能相關指標比較（）
表2
大鼠成模后血清指標比較（）
光學顯微鏡觀察發現，空白組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，密度均勻；模型組大鼠視網膜內界膜腫脹、增厚，內核層（INL）、外核層（ONL）排列疏松、紊亂，密度降低（圖2）。空白組大鼠腎臟組織空白組大鼠腎臟組織腎小球、腎小管形態結構規整，未見明顯異常（圖3A，3B）；腎臟組織模型組大鼠腎小球充血，皮質管狀上皮腫脹，基底膜輕度增厚，系膜區增寬（圖3C，3D）。
圖2
空白組、模型組大鼠視網膜組織光學顯微鏡像（標尺：200 μm） 2A示蘇木精-伊紅染色像；2B示高碘酸-雪夫染色像。左圖為空白組，右圖為模型組。空白組大鼠視網膜各層細胞排列整齊（2A、2C）。模型組視網膜內界膜腫脹、增厚，INL、ONL外核層排列疏松、紊亂（2B），視網膜厚度增加，內核層、外核層排列紊亂（2D） GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；ONL：外核層；IS/OS：橢圓體帶
圖3
空白組、模型組大腎臟組織光學顯微鏡像（標尺：200 μm） 3A、3B示空白組，腎臟組織染色均勻，腎小球、腎小管、皮質、囊腔等結構形態規整。3C、3D示模型組，腎小球充血，皮質管狀上皮腫脹，基底膜輕度增厚，系膜區增寬（3C）；腎小球體積增大，囊腔狹窄，系膜基質和系膜細胞彌漫性輕度增生，系膜區紫紅色糖原沉積物明顯增加（3D） 3A、3C和3B、3D分別為蘇木精-伊紅、高碘酸-雪夫染色
免疫熒光顯微鏡觀察發現，模型組大鼠視網膜內、外叢狀層呈片狀強綠色熒光表達，INL、ONL呈散在點狀綠色熒光表達；空白組大鼠未見綠色熒光表達（圖4A，4B）。與空白組比較，模型組大鼠視網膜Müller細胞胞漿綠色熒光表達顯著增強，差異有統計學意義（t=－7.354，P=0.002）；細胞核藍色熒光表達差異無統計學意義（圖4C）。
圖4
空白組、模型組大鼠視網膜免疫熒光表達情況 4A、4B分別示空白組、模型組共聚焦熒光顯微鏡像（標尺：20 μm）。GFAP標記的視網膜Müller細胞胞漿呈綠色熒光；DAPI標記的細胞核呈藍色熒光。4C示兩組視網膜熒光表達結果（n=6），與空白組比較，***P＜0.001 GFAP：膠質纖維酸性蛋白；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
OCTA檢查結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠視網膜淺層毛細血管叢可見明顯無灌注區和輕度血管紆曲彎折（圖5）。
圖5
空白組、模型組大鼠光相干斷層掃描血管成像 5A示空白組，視網膜淺層毛細血管叢形態及走形規則；5B示模型組，視網膜淺層毛細血管叢可見明顯無灌注區（紅星）和輕度血管紆曲彎折
透射電子顯微鏡觀察發現，空白組大鼠視網膜微血管基底膜均勻平整，無增厚，周細胞位于血管壁外層，核較大，呈近橢圓形，內皮細胞位于血管內壁，核扁平較小；模型組大鼠視網膜微血管基底膜輕度增厚，血管內皮細胞明顯水腫，內皮細胞核固縮、核膜皺縮，周細胞核固縮，線粒體輕度腫脹，管腔變窄（圖6）。
圖6
空白組、模型組大鼠視網膜透射電子顯微鏡像（乙酸鈾酰和檸檬鉛染色，標尺：2 μm） 6A示空白組，視網膜微血管基底膜無增厚，周細胞核較大呈近橢圓形，內皮細胞核扁平較小；6B示模型組，視網膜微血管基底膜輕度增厚，血管內皮細胞明顯水腫，內皮細胞核固縮、核膜皺縮，周細胞核固縮，線粒體輕度腫脹，管腔變窄 E：內皮細胞；EN：內皮細胞核；P：周細胞；PN：周細胞核；BM：基底膜；lumen：管腔。*：視網膜神經節細胞核；黑箭：線粒體
3 討論
MCD為糖尿病常見慢性微血管并發癥，可導致腎功能衰竭、視功能喪失等嚴重損害。全身內皮功能障礙是MCD的關鍵發病機制，主要病理特征為一氧化氮釋放減少、氧化應激增強、炎癥因素增加、血管生成異常和內皮修復受損等[7-9]。血管內皮細胞損傷程度隨著糖尿病病程進展而逐漸加重，在糖尿病中晚期常損及視網膜和腎小球微血管，DR和DKD存在共同的病理基礎，微血管的異常改變是MCD模型成立的重要依據。臨床研究發現，50%以上的糖尿病患者同時并發DR與DKD[10]。本研究結果顯示，盡管在DKD早期尿微量白蛋白升高而無顯著性差異，但腎功能關鍵指標UACR提示已經出現了腎小球損害；MCD大鼠存在脂代謝紊亂，提示模型組大鼠視網膜Müller細胞激活明顯。Hsieh等[11]發現，DKD和DR在全身治療反應中存在時間順序的相關性。郭振紅[12]觀察自發模型OLETF大鼠DKD與DR各個時期病理變化的相關性，發現大鼠發生DKD時視網膜病理切片結果提示已出現新生血管，表明DKD可能早于DR出現。因此，建立穩定可靠的MCD眼腎微血管病變體內模型有助于糖尿病的分子機制分析、藥效學評價和系統診療體系的形成。
既往研究表明，通過長期高脂飼養可引發大鼠胰島素抵抗，發病過程更貼近人類T2DM，但缺點是極大地增加了實驗時間和經費[13]。而若同時配合低劑量STZ，既可縮短建模時間，提高成模效率，又能反應T2DM的自然病程[14]。胰島破壞和β細胞丟失是STZ誘發糖尿病的機制，其不同劑量可制備1型糖尿病（T1DM）或T2DM[15]。目前常用方案是高脂高糖飼料聯合低劑量STZ制備T2DM模型。另外，通過直接高劑量STZ建立的T1DM模型也被廣泛用于糖尿病并發癥研究[16-17]。但有研究表明，STZ在糖尿病造模劑量下對動物有明顯的腎臟毒性，通常劑量為65 mg/kg的STZ可引起明顯的腎小管壞死和腎毒性，嚴重影響DKD的模型評價[18-19]。有學者通過總結大量T2DM模型研究后發現，高脂飲食配合低劑量STZ可建立穩定的T2DM模型，但需考慮到STZ注射劑量、濃度、途徑、時間和環境，禁食起止時間，飼料配方等因素對T2DM造模的影響，并提出血糖和胰島素/c肽水平是識別T2DM進展階段的重要因素[20]。
MCD是糖尿病慢性并發癥，其動物模型建立需首先考慮基礎病的制備，進一步研究其微血管病變。但目前T2DM的微血管并發癥模型多以單一病種進行研究，且T2DM成模后維持高脂飼養時間不一。Sugano等[21]發現STZ注射后維持高脂飼養7周內可檢測到嚴重的mAlb，隨后則出現白蛋白尿。高雪等[22]觀察了STZ注射后高脂飼養不同時間大鼠腎臟功能，發現STZ注射后繼續高脂飼養4周大鼠可出現尿白蛋白排泄率升高。Matboli等[4]也發現STZ注射后繼續高脂飼養4周大鼠腎臟功異常和病理改變。此外，另有學者總結分析了DR建模方案，低劑量STZ注射后維持高脂飼養4周即可觀察到血視網膜屏障破壞，ONL變薄，無細胞毛細血管增多等表現[3]。目前還沒有模型能同時完全概括DR與DKD在每一階段發生的病理生理學改變，但每種模型都再現了多種疾病的表型。
本研究在經典T2DM建模方案[2, 20, 23]基礎上，結合目前DR[3]和DKD[4]的模型制備，擬定MCD建模方案：4周高脂高糖飲食聯合35 mg/kg 1% STZ，建模后維持高脂高糖飼養4周，觀察視網膜及腎臟病變。此方案在原有基礎上加入“高糖”，進一步縮短了T2DM微血管并發癥的建模時間，同時可觀察到眼和腎臟微血管病變[24]。實驗過程中模型組大鼠死亡6只，GLU＜16.7 mmol/L 1只，死亡率為20%（6/30）。
本研究建模方案成功誘導了MCD視網膜和腎微血管病變，模型成模率較高，穩定性較好，可用于MCD病理及新藥干預研究。但本研究仍存在以下不足：（1）實驗過程未進行階段性取材，無法確定最早出現視網膜及腎微血管病變的時間點，難以對照疾病的分期分型；（2）T2DM建模后維持高脂高糖飼養時間較短，對于需長時間干預的藥物研究缺乏進一步穩定性證據；（3）實驗過程中未收集飲水進食量，不能量化糖尿病三多一少表現；（4）實驗過程中對視網膜進行了免疫熒光檢測，初步觀察到視網膜Müller細胞的異常活化，提示DR不僅是一種血管疾病，也是一種神經退行性疾病，尚缺乏電子顯微鏡等超微結果的直觀證據[25]。今后研究將進一步完善上述不足，以進一步驗證本研究結果。
