基因治療在眼部疾病中的應用逐漸從單基因遺傳性疾病擴展至多基因、多因素、常見病和慢性疾病中，這一新興治療方式仍處于早期探索階段，預期獲益和風險仍然存在很大的不確定性。在基因治療藥物的遞送過程中，病毒載體是目前最成熟和應用最廣泛的載體之一，其相關免疫的發生程度將影響基因治療近期和遠期效果，甚至造成永久性的視功能嚴重損傷。由此，載體相關免疫反應是基因治療中安全性和長期療效維持的重點和挑戰，因此在基因治療的圍手術期和隨訪中應該重視載體相關免疫炎癥監測，并采取積極、恰當的處理措施，從而取得最佳視功能獲益。
引用本文： 孫曉東, 陳潔瓊. 重視眼部基因治療病毒載體相關免疫的監測與處理. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 621-625. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220629-00389 復制
眼部基因治療一直處在整個基因治療領域的最前沿，2017年12月全球首個針對遺傳性視網膜疾病（IRD）的基因治療藥物Luxturna的安全性和有效性已被廣泛認可，越來越多的基因治療藥物正從實驗室走向臨床。目前，全世界范圍內已經啟動了56項視網膜基因治療臨床試驗，其中12項處于Ⅲ期臨床試驗階段（https://clinicaltrials.gov）。近年來，基因治療研究將焦點從罕見的單基因遺傳病和腫瘤領域轉向常見病，例如，針對關鍵致病因子血管內皮生長因子開展了多個新生血管性老年性黃斑變性基因治療臨床試驗，取得了鼓舞人心的效果[1]；在難治性單純皰疹病毒性角膜炎中，通過角膜基質內注射慢病毒承載的基因治療藥物靶向三叉神經清除駐存的單純皰疹病毒的臨床前療效顯著，目前正在進入臨床試驗階段[2]；特異性靶向小梁網的腺相關病毒（AAV）2載體也在青光眼治療的臨床前研究中不斷探索。因此，眼部基因治療也正逐漸從單基因IRD擴展應用至多基因、多因素、常見病和慢性疾病。
盡管基因治療在越來越多的疾病治療中開始嘗試，這一新興的治療方式仍處于早期探索階段，所預期的獲益和風險仍然存在很大的不確定性。眼部作為基因治療的靶器官有其自身優勢，如器官相對獨立、相對免疫豁免特性、體積較小所需有效藥物量較少。目前大部分研究使用腺病毒、AAV和慢病毒等病毒載體遞送系統，而由于AAV具有無致病性、高效長期表達、不整合宿主以及低免疫原性等特點，在眼部基因治療臨床研究中應用較多[3]。已有臨床數據表明，患者的免疫學因素會顯著影響基因治療藥物的遞送效率，進而影響基因治療藥物的療效甚至產生嚴重后果[4]。在視網膜基因治療臨床研究中，高達三分之一的受試者在治療后產生不同程度的眼內炎癥激活，引起視網膜炎、脈絡膜炎、玻璃體炎及血管炎等[5]。由此提示眼部基因治療后免疫激活的發生率遠高于常規眼部手術和其他治療。基因治療后引起的眼內免疫炎癥反應稱為基因治療相關葡萄膜炎（GTAU），目前認為其主要與病毒載體免疫相關，且其發生程度將影響基因治療的近期和遠期效果，當引起眼內嚴重的炎癥時將造成永久性視功能嚴重損傷[4, 5-8]。由此，在開展基因治療圍手術期和隨訪中應該重視病毒載體相關免疫炎癥的監測，并對相應程度的免疫反應采取積極、恰當的處理措施，從而獲得最佳視功能獲益。
1 多種免疫應答機制參與基因治療病毒載體相關免疫
目前常用的AAV載體相關的免疫炎癥在不同時期由不同的抗原成分誘導。在轉導初始階段（手術后1～2周），免疫反應抗原主要為AAV衣殼蛋白和載體DNA及載體基因組的特定非編碼區域，例如反向末端重復區域的短雙鏈DNA序列、啟動子序列等可能上調固有免疫導致轉導失敗[7]。在轉導后階段（手術后1～2個月），潛在的免疫原性成分為目標基因RNA和目標蛋白持續表達后誘導特異性T細胞活化介導轉導細胞的死亡。目前認為針對AAV載體常見免疫應答機制包括：（1）機體預先存在的野生型AAV病毒的免疫記憶，即體內已有AAV中和抗體；（2）AAV病毒衣殼蛋白誘導固有免疫反應；（3）AAV病毒載體以及基因轉導產物誘導的細胞免疫和體液免疫反應。
AAV在人群中存在普遍感染，不同亞型的AAV中和抗體的血清陽性率為4%～72%[9]，其中32%的人能夠完全中和AAV[10]。由于AAV各血清型載體具有一定的同源性，特定AAV血清型抗體可能會出現交叉反應，目前認為AAV中和抗體是導致早期基因治療失敗的主要因素之一[11]。生理狀況下，眼球具有相對免疫豁免特性，眼部的抗AAV中和抗體水平通常較低，但是當眼部處于疾病狀態時，眼球的免疫屏障受到破壞，玻璃體液內的中和抗體濃度大幅增加[12]，免疫反應相關的風險也明顯增大，而且人體已經存在的AAV中和抗體可以通過誘導功能構象變化，使病毒衣殼不穩定阻止病毒轉導。因此，大規模人血清中和抗體檢測數據是早期研發方案制定的重要參考因素。
雖然基因治療AAV載體已經去除自身編碼蛋白序列，但是病毒衣殼和轉導基因產物可以誘導機體固有免疫和適應性免疫活化，并且病毒載體的核酸成分也可能具有佐劑樣效應，輔助活化宿主免疫系統。在基因治療藥物研發過程中，對AAV衣殼蛋白進行改造以減少免疫原性是減輕載體免疫的一個重要方向，而且不同AAV亞型的衣殼蛋白結構的變異，可能通過影響載體的抗原特性和轉導效率，并調節免疫細胞抗衣殼和抗目標基因的反應強度[13]。如，相比AAV8載體，AAVrh32.33和AAV2載體能夠誘導更強烈的T細胞反應。病毒在生產中會產生大量雜質，包括宿主細胞DNA、蛋白及質粒DNA的殘留，以及不同生產工藝過程的殘留物質等，雖然在生產最后環節會采用層析工藝吸附，但是由于尚無統一檢測標準，因此殘留雜質依然會引起非特異性炎癥反應。
AAV載體引進免疫反應機制：一方面被病原體相關分子模式識別表面抗原，通過免疫細胞模式識別受體后啟動固有免疫，激活炎癥信號通路和促炎細胞因子表達上調；另一方面通過抗原提呈細胞識別AAV或轉基因蛋白，提呈給注射點鄰近區域的淋巴細胞并激活細胞免疫，同時通過產生AAV衣殼或轉基因蛋白特異性抗體啟動體液免疫。因此，固有免疫和適應性免疫在基因治療病毒載體相關免疫中均發揮重要作用。
2 基因治療病毒載體相關免疫炎癥需要及早鑒別
進行基因治療手術后眼部炎癥主要包括手術操作損傷引起的無菌性炎癥、手術后感染性眼內炎以及基因治療特有的病毒載體免疫相關炎癥等。其中需特別關注載體相關免疫炎癥，該類反應在給藥后即可發生并可能持續較長時間，在手術后早期階段需要與手術操作引起的手術反應和輕癥的感染性眼內炎進行鑒別。在手術后1～2周的轉導初始階段通過衣殼蛋白激活固有免疫，手術后1～2個月進入轉導后階段持續表達的目標基因RNA和目標基因產物相關蛋白激活體液免疫和細胞免疫。因此手術后監測眼部炎癥反應至少至手術后8周，根據炎癥反應發生的時間監測載體相關免疫炎癥激活，及時地進行干預對于基因治療的療效維持非常關鍵。
基因治療手術后病毒性后部葡萄膜炎與病毒載體相關免疫炎癥的鑒別存在諸多難點，在臨床表現和部分體征上二者表現極其相似，均可能伴有視力下降、視野損害、“飛蚊”漂浮感、閃光感等癥狀，均可出現眼前節的輕度炎癥反應以及玻璃體細胞陽性，但在病毒性后部葡萄膜炎急性期常存在視網膜炎癥滲出、視網膜血管炎癥以及黃斑水腫等改變，隨著病程延長出現視網膜脈絡膜疤痕、視網膜色素上皮（RPE）細胞增生等變化[14]；而病毒載體相關免疫炎癥的視網膜滲出性改變少見，通常視網膜及血管炎癥反應輕微且持續。在視網膜下注射給藥中，炎癥反應多在注射泡覆蓋及其邊緣區域，光相干斷層掃描（OCT）檢查可觀察到相應位置視網膜層間及RPE層的強反射點增多，推測為小膠質細胞、巨噬細胞以及其他炎癥細胞的激活，隨著時間延長出現注射泡邊緣帶狀的RPE脫色素及RPE萎縮改變，并伴隨相應位置視網膜和脈絡膜萎縮變薄[15]。以上臨床特征需要在每次隨訪中密切關注，仔細甄別，尤其對注射部位視網膜色素改變和OCT上異常增多的點狀強信號進行多次隨訪的前后對比，單次隨訪的觀察容易忽視輕微改變，需要仔細觀察同一部位的動態變化，才能盡早地發現活動性炎癥病灶，及早進行干預和處理，避免視網膜功能進一步損傷。基于以病毒為載體基因治療中潛在免疫反應對于療效的重要影響作用，目前國際上基因治療專家共識均建議在圍手術期合并全身和局部糖皮質激素的應用[16]。我們需要關注，此時眼部處于相對免疫抑制狀態，發生病毒性、細菌性及真菌性眼內炎的潛在可能性均升高。
3 眼部基因治療應該選擇合適的給藥方式
要降低基因治療的免疫反應，選擇合適的眼部基因治療給藥方式尤為重要。GTAU反應程度不僅取決于載體的設計和劑量，還與其在眼內的生物分布密切相關，存在于眼內的病毒載體在眼部不同腔室中可以引起不同程度的反應[17]。因此，在設計特異且高效轉染的病毒載體之上，根據轉染靶細胞所在解剖位置，選擇合適的給藥方式，盡可能地減少病毒用量，減少眼內其他組織的擴散，對于降低載體相關免疫炎癥反應極為重要。
目前眼部基因治療給藥方式主要為玻璃體腔注射、視網膜下腔注射以及脈絡膜上腔注射，部分眼前節病變采用前房注射或角膜基質注射等方式。不同給藥方式的選擇通常與基因治療病毒載體與靶細胞的親和性及其解剖位置有著密切的關系。通常玻璃體腔注射優先轉導視網膜內層細胞[18]，也是最為簡便的給藥方式，但是存在虹膜、睫狀體等眼前節組織的脫靶轉導效應，而且病毒載體通過房水流出途徑進入全身血循環，導致血液中載體負荷升高，誘發全身體液免疫和細胞免疫激活[19]。視網膜下注射基因治療藥物在視網膜外層分布濃度較高[20]，優先轉導光感受器和RPE細胞，僅極少量AAV載體通過注射針孔反流至玻璃體腔或者通過已破壞的血視網膜屏障進入全身循環，因此玻璃體腔注射比視網膜下腔注射更易引發病毒載體相關免疫反應。但是隨著病毒體內篩選和定向進化技術的突破，以前只能通過視網膜下腔注射轉染光感受器細胞，在優化病毒載體后也可以通過玻璃體腔注射成功轉染[21]。近年來，脈絡膜上腔注射是一種新興的給藥方式，通過微針穿透鞏膜達到脈絡膜上腔，藥物在脈絡膜上腔內環繞擴散，直接浸入視網膜外層和RPE層，有效轉染光感受器細胞和RPE細胞[22]。而且脈絡膜上腔的藥物容納空間相較于視網膜下腔更大，并且無需進行眼內手術即可完成操作，可以減少手術源性損傷和血視網膜屏障的進一步破壞，因此被認為是更加精準、靶向、安全、高效的給藥方式，目前主要為慢性葡萄膜炎的新型給藥方式[23]，也有望在視網膜基因治療中進一步開展應用。
4 全身和局部應用免疫抑制劑有利于控制基因治療病毒載體相關免疫炎癥反應
目前，對于預防和控制眼部基因治療病毒載體相關免疫，全球多個眼科基因治療中心對于需要接受治療的患者均推薦手術前及手術后給予全身糖皮質激素，并且手術后增加眼局部糖皮質激素應用，根據患者全身和眼局部的炎癥反應情況調整用藥劑量和維持時間。糖皮質激素應用的理論依據是其通過抑制抗體和補體結合，抑制小膠質細胞活化，上調白細胞介素（IL）-10表達和下調IL-2、IL-6和干擾素-γ合成，增加調節性T細胞活性，促進對外來抗原免疫反應的抑制作用，保護神經視網膜免受細胞毒性損傷，從而提高轉導效率。盡管不同臨床試驗中給予的糖皮質激素使用劑量和持續時間有所不同，但多數研究結果顯示糖皮質激素能夠有效預防和抑制全身和眼局部炎癥反應。
對于基因治療病毒載體相關免疫的預防和治療是首選糖皮質激素還是免疫抑制劑，仍然存在一定爭議。有學者認為糖皮質激素的免疫抑制作用為瞬時，眼部基因治療載體以及持續表達的目標RNA和目標蛋白可能導致GTAU持續存在，在糖皮質激素停用后，眼部炎癥反應容易出現反復和波動，采用免疫抑制劑治療可以更為有效地抑制免疫反應[24]。在臨床中，根據患者的眼部炎癥的程度和持續時間，在避免或者盡量減少全身副作用的前提下，也可以考慮全身和局部應用免疫抑制劑。
5 展望
病毒載體所引起的固有免疫和適應性免疫反應的激活，影響基因治療的整體療效，同時也可能對視網膜和眼部其他組織造成損傷。基因治療早期的病毒載體免疫炎癥反應阻礙病毒轉導，導致病毒進入靶細胞失敗；中晚期的免疫炎癥反應通過細胞免疫攻擊和清除已經轉導成功的靶細胞，最終導致治療失敗。由于病毒載體給藥后轉基因表達水平不足以達到有效治療水平，而病毒載體的中和抗體和免疫細胞已經存在，將使患者有可能無法進行二次基因治療給藥，因此探索有效給藥劑量也是臨床試驗中的關鍵，需要在療效和高劑量病毒載體過載導致的免疫反應中探索最佳劑量。隨著基因治療在眼科疾病中的普遍開展，病毒載體相關免疫的發生將不可避免，其發生程度也難以預料。對于不同的基因治療載體、不同的給藥方式、不同的給藥劑量均可能導致不同免疫炎癥相關的臨床特征，這些特征極有可能與其他眼部疾病的臨床表現存在重疊，因此，在進行基因治療前后，臨床醫生應該盡可能全面地了解病毒載體相關免疫的特點、發生時間和機制，提前進行預防，并對相應程度的免疫反應采取積極、恰當的處理措施，需要長期的觀察隨訪，及時地發現免疫炎癥的激活并采取抑制炎癥的措施減少視功能損傷。由于病毒載體的免疫反應、容量限制和制備工藝的挑戰，也讓學者們不斷探索非病毒載體的可能性，如納米顆粒，與病毒載體相比，具有較低的免疫源性和更好的容納能力[25]，且易于合成、靈活修飾和大規模生產潛力，盡管目前還存在轉導效率低的問題，非病毒載體被認為是未來最具潛力的載體之一。
眼部基因治療一直處在整個基因治療領域的最前沿，2017年12月全球首個針對遺傳性視網膜疾病（IRD）的基因治療藥物Luxturna的安全性和有效性已被廣泛認可，越來越多的基因治療藥物正從實驗室走向臨床。目前，全世界范圍內已經啟動了56項視網膜基因治療臨床試驗，其中12項處于Ⅲ期臨床試驗階段（https://clinicaltrials.gov）。近年來，基因治療研究將焦點從罕見的單基因遺傳病和腫瘤領域轉向常見病，例如，針對關鍵致病因子血管內皮生長因子開展了多個新生血管性老年性黃斑變性基因治療臨床試驗，取得了鼓舞人心的效果[1]；在難治性單純皰疹病毒性角膜炎中，通過角膜基質內注射慢病毒承載的基因治療藥物靶向三叉神經清除駐存的單純皰疹病毒的臨床前療效顯著，目前正在進入臨床試驗階段[2]；特異性靶向小梁網的腺相關病毒（AAV）2載體也在青光眼治療的臨床前研究中不斷探索。因此，眼部基因治療也正逐漸從單基因IRD擴展應用至多基因、多因素、常見病和慢性疾病。
盡管基因治療在越來越多的疾病治療中開始嘗試，這一新興的治療方式仍處于早期探索階段，所預期的獲益和風險仍然存在很大的不確定性。眼部作為基因治療的靶器官有其自身優勢，如器官相對獨立、相對免疫豁免特性、體積較小所需有效藥物量較少。目前大部分研究使用腺病毒、AAV和慢病毒等病毒載體遞送系統，而由于AAV具有無致病性、高效長期表達、不整合宿主以及低免疫原性等特點，在眼部基因治療臨床研究中應用較多[3]。已有臨床數據表明，患者的免疫學因素會顯著影響基因治療藥物的遞送效率，進而影響基因治療藥物的療效甚至產生嚴重后果[4]。在視網膜基因治療臨床研究中，高達三分之一的受試者在治療后產生不同程度的眼內炎癥激活，引起視網膜炎、脈絡膜炎、玻璃體炎及血管炎等[5]。由此提示眼部基因治療后免疫激活的發生率遠高于常規眼部手術和其他治療。基因治療后引起的眼內免疫炎癥反應稱為基因治療相關葡萄膜炎（GTAU），目前認為其主要與病毒載體免疫相關，且其發生程度將影響基因治療的近期和遠期效果，當引起眼內嚴重的炎癥時將造成永久性視功能嚴重損傷[4, 5-8]。由此，在開展基因治療圍手術期和隨訪中應該重視病毒載體相關免疫炎癥的監測，并對相應程度的免疫反應采取積極、恰當的處理措施，從而獲得最佳視功能獲益。
1 多種免疫應答機制參與基因治療病毒載體相關免疫
目前常用的AAV載體相關的免疫炎癥在不同時期由不同的抗原成分誘導。在轉導初始階段（手術后1～2周），免疫反應抗原主要為AAV衣殼蛋白和載體DNA及載體基因組的特定非編碼區域，例如反向末端重復區域的短雙鏈DNA序列、啟動子序列等可能上調固有免疫導致轉導失敗[7]。在轉導后階段（手術后1～2個月），潛在的免疫原性成分為目標基因RNA和目標蛋白持續表達后誘導特異性T細胞活化介導轉導細胞的死亡。目前認為針對AAV載體常見免疫應答機制包括：（1）機體預先存在的野生型AAV病毒的免疫記憶，即體內已有AAV中和抗體；（2）AAV病毒衣殼蛋白誘導固有免疫反應；（3）AAV病毒載體以及基因轉導產物誘導的細胞免疫和體液免疫反應。
AAV在人群中存在普遍感染，不同亞型的AAV中和抗體的血清陽性率為4%～72%[9]，其中32%的人能夠完全中和AAV[10]。由于AAV各血清型載體具有一定的同源性，特定AAV血清型抗體可能會出現交叉反應，目前認為AAV中和抗體是導致早期基因治療失敗的主要因素之一[11]。生理狀況下，眼球具有相對免疫豁免特性，眼部的抗AAV中和抗體水平通常較低，但是當眼部處于疾病狀態時，眼球的免疫屏障受到破壞，玻璃體液內的中和抗體濃度大幅增加[12]，免疫反應相關的風險也明顯增大，而且人體已經存在的AAV中和抗體可以通過誘導功能構象變化，使病毒衣殼不穩定阻止病毒轉導。因此，大規模人血清中和抗體檢測數據是早期研發方案制定的重要參考因素。
雖然基因治療AAV載體已經去除自身編碼蛋白序列，但是病毒衣殼和轉導基因產物可以誘導機體固有免疫和適應性免疫活化，并且病毒載體的核酸成分也可能具有佐劑樣效應，輔助活化宿主免疫系統。在基因治療藥物研發過程中，對AAV衣殼蛋白進行改造以減少免疫原性是減輕載體免疫的一個重要方向，而且不同AAV亞型的衣殼蛋白結構的變異，可能通過影響載體的抗原特性和轉導效率，并調節免疫細胞抗衣殼和抗目標基因的反應強度[13]。如，相比AAV8載體，AAVrh32.33和AAV2載體能夠誘導更強烈的T細胞反應。病毒在生產中會產生大量雜質，包括宿主細胞DNA、蛋白及質粒DNA的殘留，以及不同生產工藝過程的殘留物質等，雖然在生產最后環節會采用層析工藝吸附，但是由于尚無統一檢測標準，因此殘留雜質依然會引起非特異性炎癥反應。
AAV載體引進免疫反應機制：一方面被病原體相關分子模式識別表面抗原，通過免疫細胞模式識別受體后啟動固有免疫，激活炎癥信號通路和促炎細胞因子表達上調；另一方面通過抗原提呈細胞識別AAV或轉基因蛋白，提呈給注射點鄰近區域的淋巴細胞并激活細胞免疫，同時通過產生AAV衣殼或轉基因蛋白特異性抗體啟動體液免疫。因此，固有免疫和適應性免疫在基因治療病毒載體相關免疫中均發揮重要作用。
2 基因治療病毒載體相關免疫炎癥需要及早鑒別
進行基因治療手術后眼部炎癥主要包括手術操作損傷引起的無菌性炎癥、手術后感染性眼內炎以及基因治療特有的病毒載體免疫相關炎癥等。其中需特別關注載體相關免疫炎癥，該類反應在給藥后即可發生并可能持續較長時間，在手術后早期階段需要與手術操作引起的手術反應和輕癥的感染性眼內炎進行鑒別。在手術后1～2周的轉導初始階段通過衣殼蛋白激活固有免疫，手術后1～2個月進入轉導后階段持續表達的目標基因RNA和目標基因產物相關蛋白激活體液免疫和細胞免疫。因此手術后監測眼部炎癥反應至少至手術后8周，根據炎癥反應發生的時間監測載體相關免疫炎癥激活，及時地進行干預對于基因治療的療效維持非常關鍵。
基因治療手術后病毒性后部葡萄膜炎與病毒載體相關免疫炎癥的鑒別存在諸多難點，在臨床表現和部分體征上二者表現極其相似，均可能伴有視力下降、視野損害、“飛蚊”漂浮感、閃光感等癥狀，均可出現眼前節的輕度炎癥反應以及玻璃體細胞陽性，但在病毒性后部葡萄膜炎急性期常存在視網膜炎癥滲出、視網膜血管炎癥以及黃斑水腫等改變，隨著病程延長出現視網膜脈絡膜疤痕、視網膜色素上皮（RPE）細胞增生等變化[14]；而病毒載體相關免疫炎癥的視網膜滲出性改變少見，通常視網膜及血管炎癥反應輕微且持續。在視網膜下注射給藥中，炎癥反應多在注射泡覆蓋及其邊緣區域，光相干斷層掃描（OCT）檢查可觀察到相應位置視網膜層間及RPE層的強反射點增多，推測為小膠質細胞、巨噬細胞以及其他炎癥細胞的激活，隨著時間延長出現注射泡邊緣帶狀的RPE脫色素及RPE萎縮改變，并伴隨相應位置視網膜和脈絡膜萎縮變薄[15]。以上臨床特征需要在每次隨訪中密切關注，仔細甄別，尤其對注射部位視網膜色素改變和OCT上異常增多的點狀強信號進行多次隨訪的前后對比，單次隨訪的觀察容易忽視輕微改變，需要仔細觀察同一部位的動態變化，才能盡早地發現活動性炎癥病灶，及早進行干預和處理，避免視網膜功能進一步損傷。基于以病毒為載體基因治療中潛在免疫反應對于療效的重要影響作用，目前國際上基因治療專家共識均建議在圍手術期合并全身和局部糖皮質激素的應用[16]。我們需要關注，此時眼部處于相對免疫抑制狀態，發生病毒性、細菌性及真菌性眼內炎的潛在可能性均升高。
3 眼部基因治療應該選擇合適的給藥方式
要降低基因治療的免疫反應，選擇合適的眼部基因治療給藥方式尤為重要。GTAU反應程度不僅取決于載體的設計和劑量，還與其在眼內的生物分布密切相關，存在于眼內的病毒載體在眼部不同腔室中可以引起不同程度的反應[17]。因此，在設計特異且高效轉染的病毒載體之上，根據轉染靶細胞所在解剖位置，選擇合適的給藥方式，盡可能地減少病毒用量，減少眼內其他組織的擴散，對于降低載體相關免疫炎癥反應極為重要。
目前眼部基因治療給藥方式主要為玻璃體腔注射、視網膜下腔注射以及脈絡膜上腔注射，部分眼前節病變采用前房注射或角膜基質注射等方式。不同給藥方式的選擇通常與基因治療病毒載體與靶細胞的親和性及其解剖位置有著密切的關系。通常玻璃體腔注射優先轉導視網膜內層細胞[18]，也是最為簡便的給藥方式，但是存在虹膜、睫狀體等眼前節組織的脫靶轉導效應，而且病毒載體通過房水流出途徑進入全身血循環，導致血液中載體負荷升高，誘發全身體液免疫和細胞免疫激活[19]。視網膜下注射基因治療藥物在視網膜外層分布濃度較高[20]，優先轉導光感受器和RPE細胞，僅極少量AAV載體通過注射針孔反流至玻璃體腔或者通過已破壞的血視網膜屏障進入全身循環，因此玻璃體腔注射比視網膜下腔注射更易引發病毒載體相關免疫反應。但是隨著病毒體內篩選和定向進化技術的突破，以前只能通過視網膜下腔注射轉染光感受器細胞，在優化病毒載體后也可以通過玻璃體腔注射成功轉染[21]。近年來，脈絡膜上腔注射是一種新興的給藥方式，通過微針穿透鞏膜達到脈絡膜上腔，藥物在脈絡膜上腔內環繞擴散，直接浸入視網膜外層和RPE層，有效轉染光感受器細胞和RPE細胞[22]。而且脈絡膜上腔的藥物容納空間相較于視網膜下腔更大，并且無需進行眼內手術即可完成操作，可以減少手術源性損傷和血視網膜屏障的進一步破壞，因此被認為是更加精準、靶向、安全、高效的給藥方式，目前主要為慢性葡萄膜炎的新型給藥方式[23]，也有望在視網膜基因治療中進一步開展應用。
4 全身和局部應用免疫抑制劑有利于控制基因治療病毒載體相關免疫炎癥反應
目前，對于預防和控制眼部基因治療病毒載體相關免疫，全球多個眼科基因治療中心對于需要接受治療的患者均推薦手術前及手術后給予全身糖皮質激素，并且手術后增加眼局部糖皮質激素應用，根據患者全身和眼局部的炎癥反應情況調整用藥劑量和維持時間。糖皮質激素應用的理論依據是其通過抑制抗體和補體結合，抑制小膠質細胞活化，上調白細胞介素（IL）-10表達和下調IL-2、IL-6和干擾素-γ合成，增加調節性T細胞活性，促進對外來抗原免疫反應的抑制作用，保護神經視網膜免受細胞毒性損傷，從而提高轉導效率。盡管不同臨床試驗中給予的糖皮質激素使用劑量和持續時間有所不同，但多數研究結果顯示糖皮質激素能夠有效預防和抑制全身和眼局部炎癥反應。
對于基因治療病毒載體相關免疫的預防和治療是首選糖皮質激素還是免疫抑制劑，仍然存在一定爭議。有學者認為糖皮質激素的免疫抑制作用為瞬時，眼部基因治療載體以及持續表達的目標RNA和目標蛋白可能導致GTAU持續存在，在糖皮質激素停用后，眼部炎癥反應容易出現反復和波動，采用免疫抑制劑治療可以更為有效地抑制免疫反應[24]。在臨床中，根據患者的眼部炎癥的程度和持續時間，在避免或者盡量減少全身副作用的前提下，也可以考慮全身和局部應用免疫抑制劑。
5 展望
病毒載體所引起的固有免疫和適應性免疫反應的激活，影響基因治療的整體療效，同時也可能對視網膜和眼部其他組織造成損傷。基因治療早期的病毒載體免疫炎癥反應阻礙病毒轉導，導致病毒進入靶細胞失敗；中晚期的免疫炎癥反應通過細胞免疫攻擊和清除已經轉導成功的靶細胞，最終導致治療失敗。由于病毒載體給藥后轉基因表達水平不足以達到有效治療水平，而病毒載體的中和抗體和免疫細胞已經存在，將使患者有可能無法進行二次基因治療給藥，因此探索有效給藥劑量也是臨床試驗中的關鍵，需要在療效和高劑量病毒載體過載導致的免疫反應中探索最佳劑量。隨著基因治療在眼科疾病中的普遍開展，病毒載體相關免疫的發生將不可避免，其發生程度也難以預料。對于不同的基因治療載體、不同的給藥方式、不同的給藥劑量均可能導致不同免疫炎癥相關的臨床特征，這些特征極有可能與其他眼部疾病的臨床表現存在重疊，因此，在進行基因治療前后，臨床醫生應該盡可能全面地了解病毒載體相關免疫的特點、發生時間和機制，提前進行預防，并對相應程度的免疫反應采取積極、恰當的處理措施，需要長期的觀察隨訪，及時地發現免疫炎癥的激活并采取抑制炎癥的措施減少視功能損傷。由于病毒載體的免疫反應、容量限制和制備工藝的挑戰，也讓學者們不斷探索非病毒載體的可能性，如納米顆粒，與病毒載體相比，具有較低的免疫源性和更好的容納能力[25]，且易于合成、靈活修飾和大規模生產潛力，盡管目前還存在轉導效率低的問題，非病毒載體被認為是未來最具潛力的載體之一。