引用本文： 王勇, 曹靖靖, 李輝, 洪亞茹, 劉愛華, 東莉潔. 干擾素基因刺激蛋白抑制劑改善視網膜血管內皮細胞白細胞粘附及糖酵解水平. 中華眼底病雜志, 2022, 38(12): 1013-1019. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220520-00312 復制
糖尿病（DM）視網膜病變（DR）是DM最常見的微血管并發癥之一[1]。眼部微環境的炎癥狀態與白細胞粘附是DR始動因素之一[2]。白細胞粘附是炎癥反應中的一個關鍵步驟，可導致視網膜血管內皮細胞的損傷及死亡，引起血視網膜屏障破壞，最終導致新生血管形成[3-4]。因此抑制白細胞粘附可以在DM早期抑制炎癥反應，從而阻礙病程進展。環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）/干擾素基因刺激蛋白（STING）通路在調節細胞炎癥方面發揮關鍵作用，STING可激活核因子（NF）-κB誘導相關細胞因子的產生，可引起炎癥反應[5-6]。STING激動劑可通過激活信號轉導和轉錄活化因子途徑促進腸上皮細胞中的糖酵解[7]。此外，STING經NF-κB/缺氧誘導因子-1α途徑誘導視網膜色素上皮（RPE）細胞中的血管內皮生長因子（VEGF）表達，驅動炎癥發生[8]。鑒于STING在炎癥反應方面的潛在作用，本研究旨在建立STING與DR的關聯，希望可以為治療DR找到新的突破點；同時，擬通過評價STING的強效共價抑制劑C176[9-10]對人視網膜血管內皮細胞白細胞粘附、氧化應激和糖酵解的影響，明確C176在治療DR中可能發揮的積極作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
DM模型建立與分組。雄性健康C57BL/6J小鼠48只，8周齡，體重（20.0±1.7）g，清潔級，北京斯貝福生物技術有限公司提供。采用隨機數字表法將小鼠分為野生型小鼠組（WT組）、DM組，每組各24只。DM組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素連續5 d，誘導DM模型；WT組小鼠腹腔注射等體積緩沖液。以注射7 d后DM組小鼠血糖值＞16.7 mmol/L為建模成功。其后，DM組再分為DM+二甲基亞砜（DMSO）組、DM+C176組，每組各12只小鼠。DM+DMSO組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射DMSO；DM+C176組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射C176（貨號HY-112906，美國MCE公司）750 nmol。建模后4周進行后續實驗[11]。
免疫組織化學染色檢測WT組、DM組小鼠視網膜組織中STING表達水平。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟和包埋、切片，蘇木精-伊紅染色[12]。切片經透膜和封閉處理后，與一抗STING（英國Abcam公司）4 ℃孵育過夜，復溫30 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Sigma公司）孵育30 min，甘油封片。顯微鏡采集圖像聯合Image J軟件圖像分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測WT組、DM組小鼠視網膜中STING mRNA相對表達量。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。分離視網膜，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，建立SYBR Green qPCR擴增反應體系，全程冰上避光操作[13]。STING正向序列：CCTGTTGCTGCTGTCCATCT，反向序列：ATGTTCAGT GCC TG CGAGAG；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）正向序列：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向序列：CGCCCCACTTGATTTTGG。應用qPCR進行檢測，通過2?△△CT方法對數據進行相對定量分析。
白細胞粘附實驗檢測WT組、DM+DMSO組、DM+C176組小鼠視網膜血管中粘附的白細胞。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，1%白蛋白和（或）磷酸緩沖液（PBS）全身灌注小鼠，以阻斷非特異性結合，綠色熒光素標記刀豆球蛋白A染色視網膜血管中粘附的白細胞，PBS灌注去除非特異性結合，摘除眼球，分離視網膜并進行視網膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察拍照，應用Image J分析計數視網膜血管中粘附的白細胞數。
1.2 體外細胞實驗
人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）培養與分組。hRMEC由本實驗室自行保存，以含10%胎牛血清和1%雙抗的改良Eagle培養基常規培養。實驗分為N+糖基化終末產物（AGE）組（N組）、DMSO+AGE組（DMSO組）、C176+AGE組（C176組）。N組為常規培養細胞加入150 μg/ml AGE處理誘導細胞；DMSO組應用DMSO對細胞進行處理，同時聯合AGE誘導（AGE濃度同N組）；C176組加入1 μmmol/L C176（貨號HY-112906，美國MCE公司）對細胞進行處理[14]，同時聯合AGE誘導（AGE濃度同N組）。
白細胞粘附實驗檢測N組、DMSO組、C176組hRMEC上小鼠外周血白細胞粘附情況。C57BL/6J小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心臟處取血并與等體積PBS混合，Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMC）。部分PBMC與hRMEC共培養，4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，熒光顯微鏡觀察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的無血清RPMI 1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯（目錄號：76823-03-5）標記45 min[15]；HBSS洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經腫瘤壞死因子-α處理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析粘附的白細胞數量。
H2DCFDA/活性氧（ROS）熒光探針檢測hRMEC中ROS表達。hRMEC接種于6孔板中，待細胞生長融合度約為80%時，各組進行相應處理后，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針H2DCFDA（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育1 h，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
Seahorse XFe 96細胞能量代謝分析儀測定細胞外酸化率（ECAR）。hRMEC以細胞密度2×104個/孔接種于XFe 96孔微孔板中，各組進行相應處理后，依次添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脫氧葡萄糖，測定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR（圖1）。每個標繪值≥3個一式三份孔的平均值，根據基線ECAR和總蛋白水平進行標準化。
圖1
糖酵解測量示意圖
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
）表示。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 體內動物實驗
與WT組比較，DM組小鼠視網膜中STING表達水平（t=73.248）及mRNA（t=67.385）相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。
圖2
WT組、DM組小鼠視網膜中STING水平檢測。2A、2B分別示WT組、DM組小鼠視網膜光學顯微鏡像，可見清晰的視網膜結構（黑箭） 標尺：50、20 μm。2C示WT組、DM組STING表達結果（n=3），**P＜0.01。2D示WT組、DM組STING mRNA相對表達量結果（n=3），*P＜0.05。WT：野生型小鼠；DM：糖尿病；STING：干擾素基因刺激蛋白；GCL：神經節細胞層；IPL：內從狀層；INL：內核層；DNL：外核層；OPL：外叢狀層
與WT組小鼠視網膜血管中白細胞粘附數量比較，DM+DMSO組顯著增加，DM+C176組顯著降低，差異有統計學意義（F=84.352，P＜0.01）（圖3）。
圖3
WT組、DM+DMSO組、DM+C176組小鼠視網膜血管中白細胞粘附檢測（n=6）。3A～3C分別示WT組、DM+DMSO組、DM+C176組視網膜鋪片熒光顯微鏡像，可見清晰的血管結構（白箭） FITC-ConA染色 標尺：100 μm。3D示3組視網膜血管中白細胞粘附數量比較，**P＜0.01。WT：野生型小鼠；DM：糖尿病；DMSO：二甲基亞砜；FITC-ConA：綠色熒光素標記刀豆球蛋白A
2.2 體外細胞實驗
與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC上白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=35.251，P＜0.01）（圖4）。流式細胞儀檢測結果顯示，與N組比較，DMSO組、C176組hRMEC上外周血白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=26.374，P＜0.01）（圖5）；C176組hRMEC內ROS水平較N組、DMSO組降低，差異有統計學意義（F=41.362，P＜0.01）（圖6）。
圖4
N組、DMSO組、C176組hRMEC上外周血白細胞粘附情況檢測（n=6）。4A～4C分別示N組、DMSO組、C176組熒光顯微鏡像，PBMC的細胞核小、圓且較亮，hRMEC的細胞核大、形狀不規則且顏色較淡，白箭所指為粘附的白細胞 DAPI 染色 標尺：50 μm。3D示3組白細胞粘附數量檢測結果，*P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；PBMC：外周血單個核細胞；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
圖5
N組、DMSO組、C176組共培養hRMEC上白細胞粘附情況檢測（n=6）。5A～5C分別示N組、DMSO組、C176組流式細胞儀檢測像。5D示3組共培養hRMEC上白細胞粘附檢測結果，** P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；DCFCE：羥基熒光素乙酰氧基甲酯
細胞能量代謝測定結果顯示，N組、DMSO組、C176組hRMEC內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR分別為2.4、4.0、0.9，2.2、4.2、1.0，0.9、1.5、0.3；與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC的糖酵解水平顯著降低，差異有統計學意義（F=68.741，P＜0.01）（圖7）。
圖6
N組、DMSO組、C176組hRMEC內ROS水平差異（n=6）。6A示N組、DMSO組、C176組流式細胞儀檢測像。6B示3組ROS水平比較，**P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧；FITC：異硫氰酸熒光素
圖7
N組、DMSO組、C176組hRMEC糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR比較（n=6），**P<0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ECAR：細胞外酸化率
3 討論
白細胞激活并粘附到損傷組織對炎癥應答至關重要，是炎癥反應中的關鍵環節[16]。在DM慢性炎癥持續存在的情況下，DR早期即可發現白細胞粘附于視網膜血管內皮，造成血管內皮細胞損傷，血視網膜屏障破壞，無灌注毛細血管形成，導致視網膜缺血和新生血管生成[17]。本研究通過觀察hRMEC中STING的表達及對白細胞粘附的影響，旨在尋找DR早期的炎癥調控靶點，抑制新生血管形成，控制疾病的進展。
cGAS/STING信號傳導是檢測胞質DNA的關鍵先天免疫應答，是細胞應激和組織損傷環境中的關鍵炎癥介質。STING活化后可通過NF-κB途徑誘導其他炎性細胞因子的產生，STING的功能突變可引起嚴重的自身炎癥性疾病，而抑制cGAS/STING信號傳導對多種炎癥性損傷有益[18]。肝臟Kupffer細胞中STING可作為線粒體DNA傳感器，參與誘導NF-κB依賴性炎癥[19]；而在RPE細胞中STING信號活化與VEGF表達上調密切相關[8]。有研究發現，老年性黃斑變性患者視網膜中STING表達升高，cGAS/STING的激活可促進氧化應激誘導的視網膜變性和炎癥，抑制cGAS/STING信號傳導后可減輕視網膜的氧化損傷[20]。在視網膜血管內皮細胞中，線粒體DNA泄漏到胞質中可被DNA傳感器cGAS激活，通過STING-TBK1通路誘導相關炎性因子的表達，是血視網膜屏障破壞的重要因素之一[21]。目前的研究僅局限于激活STING可引起視網膜血管內皮細胞的炎癥，細胞存在何種行為改變未有深入研究，但STING在炎癥性疾病以及視網膜炎癥中的作用給予我們一定啟發。本研究將STING與DR相關聯，通過抑制STING的表達水平探究hRMEC的行為學改變，希望能作為治療DR的潛在靶點。體內實驗結果顯示，DM小鼠hRMEC中STING高表達，而C176可抑制小鼠視網膜中白細胞對hRMEC的粘附，提示STING與DM微環境中視網膜的炎癥反應存在潛在關聯。
DR微環境中氧化應激水平與糖酵解代謝異常密切相關[18]。ROS作為能量代謝的主要產物，參與眾多眼病相關的病理過程，ROS的過量產生會導致氧化應激，進而損傷視網膜血管內皮細胞，誘導新生血管形成[22]。DR的神經和微血管并發癥與葡萄糖代謝失調密切相關，糖酵解代謝途徑的異常增強，可產生大量中間代謝物并通過多種途徑，包括多元醇途徑、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑降低谷胱甘肽再生所需的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸濃度，從而導致抗氧化防御系統減弱和ROS的過量產生，加重DR進展[23]。本研究體外實驗結果顯示，C176可抑制白細胞粘附和ROS的生成并下調糖酵解水平，這些發現均對改善視網膜血管內皮細胞的功能具有積極作用，提示STING可能成為緩解DR早期炎癥的新靶點。
本研究為STING抑制劑在治療DR中的應用提供了實驗依據，但有關STING抑制劑對于炎癥因子及粘附因子表達水平的作用應在今后研究中完善，同時在實驗設計方面應在體外細胞實驗方面進一步補充STING高表達對視網膜血管內皮細胞的不利影響，從而更全面地解讀STING作為潛在靶點治療DR的分子機制。
糖尿病（DM）視網膜病變（DR）是DM最常見的微血管并發癥之一[1]。眼部微環境的炎癥狀態與白細胞粘附是DR始動因素之一[2]。白細胞粘附是炎癥反應中的一個關鍵步驟，可導致視網膜血管內皮細胞的損傷及死亡，引起血視網膜屏障破壞，最終導致新生血管形成[3-4]。因此抑制白細胞粘附可以在DM早期抑制炎癥反應，從而阻礙病程進展。環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）/干擾素基因刺激蛋白（STING）通路在調節細胞炎癥方面發揮關鍵作用，STING可激活核因子（NF）-κB誘導相關細胞因子的產生，可引起炎癥反應[5-6]。STING激動劑可通過激活信號轉導和轉錄活化因子途徑促進腸上皮細胞中的糖酵解[7]。此外，STING經NF-κB/缺氧誘導因子-1α途徑誘導視網膜色素上皮（RPE）細胞中的血管內皮生長因子（VEGF）表達，驅動炎癥發生[8]。鑒于STING在炎癥反應方面的潛在作用，本研究旨在建立STING與DR的關聯，希望可以為治療DR找到新的突破點；同時，擬通過評價STING的強效共價抑制劑C176[9-10]對人視網膜血管內皮細胞白細胞粘附、氧化應激和糖酵解的影響，明確C176在治療DR中可能發揮的積極作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。所有動物的飼養及管理均符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。
DM模型建立與分組。雄性健康C57BL/6J小鼠48只，8周齡，體重（20.0±1.7）g，清潔級，北京斯貝福生物技術有限公司提供。采用隨機數字表法將小鼠分為野生型小鼠組（WT組）、DM組，每組各24只。DM組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射鏈脲佐菌素連續5 d，誘導DM模型；WT組小鼠腹腔注射等體積緩沖液。以注射7 d后DM組小鼠血糖值＞16.7 mmol/L為建模成功。其后，DM組再分為DM+二甲基亞砜（DMSO）組、DM+C176組，每組各12只小鼠。DM+DMSO組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射DMSO；DM+C176組小鼠按照50 mg/kg劑量腹腔注射C176（貨號HY-112906，美國MCE公司）750 nmol。建模后4周進行后續實驗[11]。
免疫組織化學染色檢測WT組、DM組小鼠視網膜組織中STING表達水平。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟和包埋、切片，蘇木精-伊紅染色[12]。切片經透膜和封閉處理后，與一抗STING（英國Abcam公司）4 ℃孵育過夜，復溫30 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Sigma公司）孵育30 min，甘油封片。顯微鏡采集圖像聯合Image J軟件圖像分析。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測WT組、DM組小鼠視網膜中STING mRNA相對表達量。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球。分離視網膜，應用TRIzol提取視網膜總RNA，逆轉錄成cDNA，建立SYBR Green qPCR擴增反應體系，全程冰上避光操作[13]。STING正向序列：CCTGTTGCTGCTGTCCATCT，反向序列：ATGTTCAGT GCC TG CGAGAG；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）正向序列：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向序列：CGCCCCACTTGATTTTGG。應用qPCR進行檢測，通過2?△△CT方法對數據進行相對定量分析。
白細胞粘附實驗檢測WT組、DM+DMSO組、DM+C176組小鼠視網膜血管中粘附的白細胞。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，1%白蛋白和（或）磷酸緩沖液（PBS）全身灌注小鼠，以阻斷非特異性結合，綠色熒光素標記刀豆球蛋白A染色視網膜血管中粘附的白細胞，PBS灌注去除非特異性結合，摘除眼球，分離視網膜并進行視網膜鋪片，熒光顯微鏡下觀察拍照，應用Image J分析計數視網膜血管中粘附的白細胞數。
1.2 體外細胞實驗
人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）培養與分組。hRMEC由本實驗室自行保存，以含10%胎牛血清和1%雙抗的改良Eagle培養基常規培養。實驗分為N+糖基化終末產物（AGE）組（N組）、DMSO+AGE組（DMSO組）、C176+AGE組（C176組）。N組為常規培養細胞加入150 μg/ml AGE處理誘導細胞；DMSO組應用DMSO對細胞進行處理，同時聯合AGE誘導（AGE濃度同N組）；C176組加入1 μmmol/L C176（貨號HY-112906，美國MCE公司）對細胞進行處理[14]，同時聯合AGE誘導（AGE濃度同N組）。
白細胞粘附實驗檢測N組、DMSO組、C176組hRMEC上小鼠外周血白細胞粘附情況。C57BL/6J小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心臟處取血并與等體積PBS混合，Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMC）。部分PBMC與hRMEC共培養，4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色，熒光顯微鏡觀察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的無血清RPMI 1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯（目錄號：76823-03-5）標記45 min[15]；HBSS洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經腫瘤壞死因子-α處理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析粘附的白細胞數量。
H2DCFDA/活性氧（ROS）熒光探針檢測hRMEC中ROS表達。hRMEC接種于6孔板中，待細胞生長融合度約為80%時，各組進行相應處理后，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針H2DCFDA（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育1 h，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
Seahorse XFe 96細胞能量代謝分析儀測定細胞外酸化率（ECAR）。hRMEC以細胞密度2×104個/孔接種于XFe 96孔微孔板中，各組進行相應處理后，依次添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脫氧葡萄糖，測定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR（圖1）。每個標繪值≥3個一式三份孔的平均值，根據基線ECAR和總蛋白水平進行標準化。
圖1
糖酵解測量示意圖
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（）表示。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 體內動物實驗
與WT組比較，DM組小鼠視網膜中STING表達水平（t=73.248）及mRNA（t=67.385）相對表達量升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。
圖2
WT組、DM組小鼠視網膜中STING水平檢測。2A、2B分別示WT組、DM組小鼠視網膜光學顯微鏡像，可見清晰的視網膜結構（黑箭） 標尺：50、20 μm。2C示WT組、DM組STING表達結果（n=3），**P＜0.01。2D示WT組、DM組STING mRNA相對表達量結果（n=3），*P＜0.05。WT：野生型小鼠；DM：糖尿病；STING：干擾素基因刺激蛋白；GCL：神經節細胞層；IPL：內從狀層；INL：內核層；DNL：外核層；OPL：外叢狀層
與WT組小鼠視網膜血管中白細胞粘附數量比較，DM+DMSO組顯著增加，DM+C176組顯著降低，差異有統計學意義（F=84.352，P＜0.01）（圖3）。
圖3
WT組、DM+DMSO組、DM+C176組小鼠視網膜血管中白細胞粘附檢測（n=6）。3A～3C分別示WT組、DM+DMSO組、DM+C176組視網膜鋪片熒光顯微鏡像，可見清晰的血管結構（白箭） FITC-ConA染色 標尺：100 μm。3D示3組視網膜血管中白細胞粘附數量比較，**P＜0.01。WT：野生型小鼠；DM：糖尿病；DMSO：二甲基亞砜；FITC-ConA：綠色熒光素標記刀豆球蛋白A
2.2 體外細胞實驗
與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC上白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=35.251，P＜0.01）（圖4）。流式細胞儀檢測結果顯示，與N組比較，DMSO組、C176組hRMEC上外周血白細胞粘附數量降低，差異有統計學意義（F=26.374，P＜0.01）（圖5）；C176組hRMEC內ROS水平較N組、DMSO組降低，差異有統計學意義（F=41.362，P＜0.01）（圖6）。
圖4
N組、DMSO組、C176組hRMEC上外周血白細胞粘附情況檢測（n=6）。4A～4C分別示N組、DMSO組、C176組熒光顯微鏡像，PBMC的細胞核小、圓且較亮，hRMEC的細胞核大、形狀不規則且顏色較淡，白箭所指為粘附的白細胞 DAPI 染色 標尺：50 μm。3D示3組白細胞粘附數量檢測結果，*P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；PBMC：外周血單個核細胞；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚
圖5
N組、DMSO組、C176組共培養hRMEC上白細胞粘附情況檢測（n=6）。5A～5C分別示N組、DMSO組、C176組流式細胞儀檢測像。5D示3組共培養hRMEC上白細胞粘附檢測結果，** P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；DCFCE：羥基熒光素乙酰氧基甲酯
細胞能量代謝測定結果顯示，N組、DMSO組、C176組hRMEC內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR分別為2.4、4.0、0.9，2.2、4.2、1.0，0.9、1.5、0.3；與N組、DMSO組比較，C176組hRMEC的糖酵解水平顯著降低，差異有統計學意義（F=68.741，P＜0.01）（圖7）。
圖6
N組、DMSO組、C176組hRMEC內ROS水平差異（n=6）。6A示N組、DMSO組、C176組流式細胞儀檢測像。6B示3組ROS水平比較，**P＜0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧；FITC：異硫氰酸熒光素
圖7
N組、DMSO組、C176組hRMEC糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR比較（n=6），**P<0.01。DMSO：二甲基亞砜；AGE：糖基化終末產物；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml AGE誘導；DMSO組：加入DMSO干預，150 μg/ml AGE誘導；C176組：加入1 μmmol/L C176干預，150 μg/ml AGE誘導；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ECAR：細胞外酸化率
3 討論
白細胞激活并粘附到損傷組織對炎癥應答至關重要，是炎癥反應中的關鍵環節[16]。在DM慢性炎癥持續存在的情況下，DR早期即可發現白細胞粘附于視網膜血管內皮，造成血管內皮細胞損傷，血視網膜屏障破壞，無灌注毛細血管形成，導致視網膜缺血和新生血管生成[17]。本研究通過觀察hRMEC中STING的表達及對白細胞粘附的影響，旨在尋找DR早期的炎癥調控靶點，抑制新生血管形成，控制疾病的進展。
cGAS/STING信號傳導是檢測胞質DNA的關鍵先天免疫應答，是細胞應激和組織損傷環境中的關鍵炎癥介質。STING活化后可通過NF-κB途徑誘導其他炎性細胞因子的產生，STING的功能突變可引起嚴重的自身炎癥性疾病，而抑制cGAS/STING信號傳導對多種炎癥性損傷有益[18]。肝臟Kupffer細胞中STING可作為線粒體DNA傳感器，參與誘導NF-κB依賴性炎癥[19]；而在RPE細胞中STING信號活化與VEGF表達上調密切相關[8]。有研究發現，老年性黃斑變性患者視網膜中STING表達升高，cGAS/STING的激活可促進氧化應激誘導的視網膜變性和炎癥，抑制cGAS/STING信號傳導后可減輕視網膜的氧化損傷[20]。在視網膜血管內皮細胞中，線粒體DNA泄漏到胞質中可被DNA傳感器cGAS激活，通過STING-TBK1通路誘導相關炎性因子的表達，是血視網膜屏障破壞的重要因素之一[21]。目前的研究僅局限于激活STING可引起視網膜血管內皮細胞的炎癥，細胞存在何種行為改變未有深入研究，但STING在炎癥性疾病以及視網膜炎癥中的作用給予我們一定啟發。本研究將STING與DR相關聯，通過抑制STING的表達水平探究hRMEC的行為學改變，希望能作為治療DR的潛在靶點。體內實驗結果顯示，DM小鼠hRMEC中STING高表達，而C176可抑制小鼠視網膜中白細胞對hRMEC的粘附，提示STING與DM微環境中視網膜的炎癥反應存在潛在關聯。
DR微環境中氧化應激水平與糖酵解代謝異常密切相關[18]。ROS作為能量代謝的主要產物，參與眾多眼病相關的病理過程，ROS的過量產生會導致氧化應激，進而損傷視網膜血管內皮細胞，誘導新生血管形成[22]。DR的神經和微血管并發癥與葡萄糖代謝失調密切相關，糖酵解代謝途徑的異常增強，可產生大量中間代謝物并通過多種途徑，包括多元醇途徑、己糖胺途徑、蛋白激酶C途徑降低谷胱甘肽再生所需的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸濃度，從而導致抗氧化防御系統減弱和ROS的過量產生，加重DR進展[23]。本研究體外實驗結果顯示，C176可抑制白細胞粘附和ROS的生成并下調糖酵解水平，這些發現均對改善視網膜血管內皮細胞的功能具有積極作用，提示STING可能成為緩解DR早期炎癥的新靶點。
本研究為STING抑制劑在治療DR中的應用提供了實驗依據，但有關STING抑制劑對于炎癥因子及粘附因子表達水平的作用應在今后研究中完善，同時在實驗設計方面應在體外細胞實驗方面進一步補充STING高表達對視網膜血管內皮細胞的不利影響，從而更全面地解讀STING作為潛在靶點治療DR的分子機制。
