引用本文： 焦明菲, 李輝, 曹靖靖, 寇振宇, 吳桂佳, 劉愛華, 東莉潔. 糖尿病小鼠視網膜p21活化激酶4表達上調及其對視網膜血管內皮細胞行為和線粒體功能的影響. 中華眼底病雜志, 2023, 39(5): 401-407. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220418-00224 復制
糖尿病視網膜病變（DR）的發展過程中，視網膜血管內皮細胞功能障礙是多因素病理學的重要啟動因素，這取決于代謝異常和炎癥。新的研究證據表明，視網膜血管內皮細胞代謝異常和炎癥與損傷的發生和進展有關[1-2]。然而，沒有有效的藥物可用于治療血管內皮細胞損傷。線粒體是細胞能量代謝的核心參與者，其功能障礙會誘發呼吸紊亂、產能異常、代謝失調，進而觸發相關疾病[3]。DR可見視網膜線粒體腫脹，膜完整性受損，超氧化物水平升高等一系列病理改變[4]。這提示保護線粒體功能與DR的發生發展密切相關。p21活化激酶4（PAK4）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在細胞粘附、遷移和增生調控中均有作用體現[5-6]。既往文獻報道，PAK4高表達通過代謝重編程促進結腸癌細胞增生，并在病毒介導的神經炎癥中調節促炎因子的表達[7]。鑒于PAK4本身的作用，我們推測PAK4的異常表達可能對糖尿病微環境下視網膜內皮細胞功能發揮具有潛在影響。本研究重點關注糖尿病狀態下PAK4在視網膜中的表達以及對視網膜血管內皮細胞線粒體功能的作用，并檢測其對細胞遷移和白細胞粘附的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
動物模型建立和分組。健康C57BL/6J雄性小鼠12只，7日齡，體重（3.52±0.35）g，清潔級，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。小鼠隨機分為糖尿病組、正常對照組，每組6只。小鼠8周齡時，禁食12 h，糖尿病組小鼠按體重腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素，連續5 d，2周后小鼠尾靜脈平均血糖＞16.7 mmol/L為建模成功[8]。對照組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉溶液（pH 4.5）。建模后8周進行后續實驗。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測糖尿病組、正常對照組小鼠視網膜中PAK4蛋白表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜。收集各組視網膜總蛋白，調整蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V 恒壓0.5 h，分離膠100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h，牛血清白蛋白封閉，一抗PAK4（英國Abcam公司） 4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜10 min，3次； 加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（美國Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化學發光底物進行曝光并拍照。以β-肌動蛋白為內參照，采用Bio-Rad軟件進行半定量灰度分析。實驗重復3次。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測糖尿病組、正常對照組小鼠視網膜中PAK4 mRNA表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照，應用Primer Premier軟件設計引物序列。PAK4正向引物：GGACATCAAGAGCGACTCGAT，反向引物：CGACCAGCGACTTCCTTCG；GAPDH正向引物：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向引物：CGCCCCACTTGATTTTGG。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，以離心半徑32.65 cm、1 500 r/min離心5 min。應用實時熒光qPCR進行檢測，通過2?△△CT計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
1.2 體外細胞實驗
細胞培養和分組。人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC，本實驗室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養。3～5 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。細胞分為N+糖基化終末產物（AGE）組（N組）、空載體+AGE組（Vector組）、PAK4過表達+AGE組（PAK4組）。N組為常規培養細胞加入150 μg/ml AGE處理誘導細胞；Vector組轉染空載質粒，同時聯合AGE誘導；PAK4組應用轉染試劑脂質體2000將pcDNA-PAK4真核表達質粒導入細胞中，同時聯合AGE誘導。Vector組、PAK4組細胞轉染24 h后，加入AGE誘導，濃度同N組。采用Western blot、qPCR檢測PAK4的轉染效率達到過表達。實驗重復3次。
細胞劃痕實驗檢測N組、Vector組、PAK4組hRMEC內細胞遷移情況。以細胞密度6×105個/孔將細胞接種于6孔板，每孔最終體系為2 ml，待生長融合為單層細胞后，用100～1 000 μl微量加樣槍頭于每孔中央行“十”字形劃痕，PBS沖洗后拍照。按實驗分組予干預刺激，常規培養24 h后于相同位置再次拍照，觀察各孔細胞向裸區的遷移情況，采用CellSens Standard軟件測量裸區面積。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率。遷移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。實驗重復3次。
白細胞粘附實驗檢測N組、Vector組、PAK4組hRMEC上白細胞粘附情況。取C57BL/6J雄性小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心臟處取血并與等體積PBS混合，Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMC）。部分PBMC與hRMEC共培養，4', 6-二脒基-2 -苯基吲哚染色，熒光顯微鏡觀察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的無血清RPMI 1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯（目錄號：76823-03-5）標記45 min；漢可氏平衡鹽溶液洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經腫瘤壞死因子-α處理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析粘附的白細胞數量。實驗重復3次。
Seahorse XFe 96細胞能量代謝儀檢測hRMEC線粒體壓力。以細胞密度2×104個/孔將細胞接種于XFe 96孔微孔板中，各組進行相應處理后，依次添加寡霉素、羰基氰-4、魚藤酮、抗霉素A，測定線粒體基礎呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸與備用呼吸能力（圖1）。
圖1
線粒體壓力測量示意圖
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
）表示。兩組間比較行獨立樣本t檢驗；三組間比較行單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 糖尿病小鼠視網膜中PAK4表達升高
與正常對照組小鼠比較，糖尿病組小鼠視網膜中PAK4 mRNA、蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統計學意義（t=22.419、25.372，P＜0.01、＜0.001）（圖2）。
圖2
正常對照組、糖尿病組小鼠視網膜中PAK4表達比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌動蛋白。2A示兩組PAK4 mRNA相對表達量結果，**P＜0.01；2B、2C分別示兩組PAK4電泳圖和PAK4蛋白相對量表達結果，***P＜0.001
2.2 PAK4誘導hRMEC遷移
與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相對表達量和細胞遷移率均顯著升高，差異有統計學意義（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.01）（圖3，4）。
圖3
N組、Vector組、PAK4組細胞轉染PAK4后PAK4表達比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌動蛋白；N組：常規培養細胞，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。3A、3B分別示3組電泳圖、PAK4蛋白相對表達量結果，**P＜0.01；3C示3組PAK4 mRNA相對表達量結果，**P＜0.01
圖4
N組、Vector組、PAK4組細胞遷移情況比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。4A～4C分別示N組、Vector組、PAK4組細胞顯微鏡像， N組、Vector組僅有少量細胞遷移進入裸區，PAK4組可見大量細胞遷移進入裸區，標尺：100 μm；4D示3組細胞遷移率比較，**P＜0.01
2.3 PAK4可誘導白細胞粘附于hRMEC
流式細胞儀檢測結果顯示，與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC上白細胞粘附數量明顯升高，差異有統計學意義（F=39.649，P＜0.01）（圖5）。
圖5
N組、Vector組、PAK4組共培養hRMEC上白細胞粘附情況比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。5A～5C分別示N組、Vector組、PAK4組流式細胞儀檢測像；5D示3組共培養hRMEC上白細胞粘附檢測結果，**P＜0.01
2.4 PAK4可抑制hRMEC線粒體氧化磷酸化
線粒體壓力測量結果顯示，N組、Vector組、PAK4組hRMEC內線粒體基礎呼吸分別為2.21、2.31、1.51，ATP產生分別為1.62、1.64、1.23，最大呼吸分別為3.22、3.21、1.27，備用呼吸能力分別為1.26、1.29、0.14。與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC內線粒體基礎呼吸、ATP生成、最大呼吸與備用呼吸能力均減弱，差異有統計學意義（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）（圖6）。
圖6
N組、Vector組、PAK4組hRMEC內線粒體壓力檢測（n=3） OCR：耗氧率；PAK4：p21活化激酶4； hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ATP：三磷酸腺苷；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入 150 μg/ml AGE誘導。*P＜0.05
3 討論
視網膜是中樞神經系統的一部分，需消耗大量葡萄糖和氧氣，通過線粒體氧化磷酸化產生ATP，以實現其光轉導和視覺功能[9]。糖代謝產物AGE在人體內的積累可能誘發氧化應激，導致線粒體發生損傷，紊亂氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循環之間的動態平衡，誘發氧化應激與炎癥的發生，導致血管內皮細胞的增生遷移，引發內皮細胞功能障礙，最終導致新生血管形成，加重DR進展[10-11]。因此，維持視網膜血管內皮細胞線粒體穩態，保護線粒體的正常代謝對于改善DR至關重要。
PAK4作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族一員，其表達水平的增加與多種類型的疾病密切相關[12-13]。PAK4可促進結腸癌細胞對葡萄糖的攝入和脂質生物合成，啟動結腸癌細胞的線粒體功能異常，導致癌細胞代謝重編程，進而促進結腸癌細胞的增生[14]。PAK4過表達可以促進細胞增生、侵襲和遷移，調節細胞骨架組織并增加細胞粘附力[15]。在神經炎癥中，PAK4的激活與腦炎病毒介導的炎性因子的表達增加有關[7]，而抑制PAK4可抑制膠質母細胞瘤的腫瘤內皮細胞粘附蛋白的生成，減少血管異常，同時抑制白細胞對內皮細胞的粘附[16-17]。本研究首先構建糖尿病小鼠模型并明確其視網膜中PAK4表達水平顯著高于正常對照組，提示PAK4與DR的發生發展可能存在潛在關聯。
為進一步明確PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞生物學行為及線粒體功能的影響。本研究將PAK4真核表達質粒導入hRMEC以實現PAK4高表達，并在此基礎上通過相關實驗評價PAK4在糖尿病微環境下的作用，發現PAK4可顯著促進視網膜血管內皮細胞的遷移以及白細胞粘附。在糖尿病早期粘附分子及炎性因子表達上調可促進白細胞與血管內皮的粘附[18]。作為炎癥反應中的關鍵步驟，白細胞粘附損傷視網膜血管內皮細胞，破壞血視網膜屏障完整性[19]。此外，本研究采用細胞能量代謝分析儀（Seahorse），通過線粒體應激壓力實驗分析PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞線粒體功能的影響。Seahorse是檢測線粒體功能和細胞代謝的工具，可以實時且以不需要任何染料或標記物的非侵入性方式測量線粒體呼吸，并以基礎呼吸、ATP生成、質子漏、最大呼吸值、能量儲備能力等多方面數據輸出結果[20-21]。線粒體壓力測試結果顯示，PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞基礎呼吸值、ATP生成、最大呼吸值、呼吸儲備能力有明顯抑制作用。
本研究通過觀察動物及細胞模型中PAK4的表達水平及線粒體呼吸變化，初步判斷PAK4可能通過影響線粒體穩態誘導白細胞粘附以及視網膜血管內皮細胞遷移。今后應進一步完善實驗方案，后續研究希望以PAK4抑制劑為干預手段，開發其藥用價值為治療DR提供新的策略。更加深刻地解讀PAK4的炎癥調控作用，包括PAK4抑制劑對視網膜血管內皮細胞粘附分子及炎性介質表達的影響，對線粒體氧化應激及能量代謝的調控等。
糖尿病視網膜病變（DR）的發展過程中，視網膜血管內皮細胞功能障礙是多因素病理學的重要啟動因素，這取決于代謝異常和炎癥。新的研究證據表明，視網膜血管內皮細胞代謝異常和炎癥與損傷的發生和進展有關[1-2]。然而，沒有有效的藥物可用于治療血管內皮細胞損傷。線粒體是細胞能量代謝的核心參與者，其功能障礙會誘發呼吸紊亂、產能異常、代謝失調，進而觸發相關疾病[3]。DR可見視網膜線粒體腫脹，膜完整性受損，超氧化物水平升高等一系列病理改變[4]。這提示保護線粒體功能與DR的發生發展密切相關。p21活化激酶4（PAK4）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，在細胞粘附、遷移和增生調控中均有作用體現[5-6]。既往文獻報道，PAK4高表達通過代謝重編程促進結腸癌細胞增生，并在病毒介導的神經炎癥中調節促炎因子的表達[7]。鑒于PAK4本身的作用，我們推測PAK4的異常表達可能對糖尿病微環境下視網膜內皮細胞功能發揮具有潛在影響。本研究重點關注糖尿病狀態下PAK4在視網膜中的表達以及對視網膜血管內皮細胞線粒體功能的作用，并檢測其對細胞遷移和白細胞粘附的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
動物模型建立和分組。健康C57BL/6J雄性小鼠12只，7日齡，體重（3.52±0.35）g，清潔級，斯貝福（北京）生物技術有限公司提供。本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。小鼠隨機分為糖尿病組、正常對照組，每組6只。小鼠8周齡時，禁食12 h，糖尿病組小鼠按體重腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素，連續5 d，2周后小鼠尾靜脈平均血糖＞16.7 mmol/L為建模成功[8]。對照組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉溶液（pH 4.5）。建模后8周進行后續實驗。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測糖尿病組、正常對照組小鼠視網膜中PAK4蛋白表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜。收集各組視網膜總蛋白，調整蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V 恒壓0.5 h，分離膠100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h，牛血清白蛋白封閉，一抗PAK4（英國Abcam公司） 4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜10 min，3次； 加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗（美國Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化學發光底物進行曝光并拍照。以β-肌動蛋白為內參照，采用Bio-Rad軟件進行半定量灰度分析。實驗重復3次。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測糖尿病組、正常對照組小鼠視網膜中PAK4 mRNA表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，分離視網膜。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照，應用Primer Premier軟件設計引物序列。PAK4正向引物：GGACATCAAGAGCGACTCGAT，反向引物：CGACCAGCGACTTCCTTCG；GAPDH正向引物：ATGGAAATCCCATCACCATCTT，反向引物：CGCCCCACTTGATTTTGG。384孔板中依此加入2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合，以離心半徑32.65 cm、1 500 r/min離心5 min。應用實時熒光qPCR進行檢測，通過2?△△CT計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
1.2 體外細胞實驗
細胞培養和分組。人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC，本實驗室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養。3～5 d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。細胞分為N+糖基化終末產物（AGE）組（N組）、空載體+AGE組（Vector組）、PAK4過表達+AGE組（PAK4組）。N組為常規培養細胞加入150 μg/ml AGE處理誘導細胞；Vector組轉染空載質粒，同時聯合AGE誘導；PAK4組應用轉染試劑脂質體2000將pcDNA-PAK4真核表達質粒導入細胞中，同時聯合AGE誘導。Vector組、PAK4組細胞轉染24 h后，加入AGE誘導，濃度同N組。采用Western blot、qPCR檢測PAK4的轉染效率達到過表達。實驗重復3次。
細胞劃痕實驗檢測N組、Vector組、PAK4組hRMEC內細胞遷移情況。以細胞密度6×105個/孔將細胞接種于6孔板，每孔最終體系為2 ml，待生長融合為單層細胞后，用100～1 000 μl微量加樣槍頭于每孔中央行“十”字形劃痕，PBS沖洗后拍照。按實驗分組予干預刺激，常規培養24 h后于相同位置再次拍照，觀察各孔細胞向裸區的遷移情況，采用CellSens Standard軟件測量裸區面積。實驗重復3次，按以下公式計算遷移率。遷移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積）。實驗重復3次。
白細胞粘附實驗檢測N組、Vector組、PAK4組hRMEC上白細胞粘附情況。取C57BL/6J雄性小鼠3只，4%水合氯醛深度麻醉，于心臟處取血并與等體積PBS混合，Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMC）。部分PBMC與hRMEC共培養，4', 6-二脒基-2 -苯基吲哚染色，熒光顯微鏡觀察拍照。另一部分PBMC于37 ℃的無血清RPMI 1640培養基中，羧基熒光素乙酰氧基甲酯（目錄號：76823-03-5）標記45 min；漢可氏平衡鹽溶液洗滌去除游離染料，與AGE誘導且經腫瘤壞死因子-α處理的hRMEC于37℃下孵育1 h。去除非粘附細胞并細胞重懸后，流式細胞儀采集熒光信號，FlowJo軟件定量分析粘附的白細胞數量。實驗重復3次。
Seahorse XFe 96細胞能量代謝儀檢測hRMEC線粒體壓力。以細胞密度2×104個/孔將細胞接種于XFe 96孔微孔板中，各組進行相應處理后，依次添加寡霉素、羰基氰-4、魚藤酮、抗霉素A，測定線粒體基礎呼吸、三磷酸腺苷（ATP）生成、最大呼吸與備用呼吸能力（圖1）。
圖1
線粒體壓力測量示意圖
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示。兩組間比較行獨立樣本t檢驗；三組間比較行單因素方差分析。采用Graph-prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 糖尿病小鼠視網膜中PAK4表達升高
與正常對照組小鼠比較，糖尿病組小鼠視網膜中PAK4 mRNA、蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統計學意義（t=22.419、25.372，P＜0.01、＜0.001）（圖2）。
圖2
正常對照組、糖尿病組小鼠視網膜中PAK4表達比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌動蛋白。2A示兩組PAK4 mRNA相對表達量結果，**P＜0.01；2B、2C分別示兩組PAK4電泳圖和PAK4蛋白相對量表達結果，***P＜0.001
2.2 PAK4誘導hRMEC遷移
與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC中PAK4蛋白、mRNA相對表達量和細胞遷移率均顯著升高，差異有統計學意義（F=36.821、38.692、29.421，P＜0.01）（圖3，4）。
圖3
N組、Vector組、PAK4組細胞轉染PAK4后PAK4表達比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；β-actin：β-肌動蛋白；N組：常規培養細胞，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。3A、3B分別示3組電泳圖、PAK4蛋白相對表達量結果，**P＜0.01；3C示3組PAK4 mRNA相對表達量結果，**P＜0.01
圖4
N組、Vector組、PAK4組細胞遷移情況比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。4A～4C分別示N組、Vector組、PAK4組細胞顯微鏡像， N組、Vector組僅有少量細胞遷移進入裸區，PAK4組可見大量細胞遷移進入裸區，標尺：100 μm；4D示3組細胞遷移率比較，**P＜0.01
2.3 PAK4可誘導白細胞粘附于hRMEC
流式細胞儀檢測結果顯示，與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC上白細胞粘附數量明顯升高，差異有統計學意義（F=39.649，P＜0.01）（圖5）。
圖5
N組、Vector組、PAK4組共培養hRMEC上白細胞粘附情況比較（n=3） PAK4：p21活化激酶4；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導。5A～5C分別示N組、Vector組、PAK4組流式細胞儀檢測像；5D示3組共培養hRMEC上白細胞粘附檢測結果，**P＜0.01
2.4 PAK4可抑制hRMEC線粒體氧化磷酸化
線粒體壓力測量結果顯示，N組、Vector組、PAK4組hRMEC內線粒體基礎呼吸分別為2.21、2.31、1.51，ATP產生分別為1.62、1.64、1.23，最大呼吸分別為3.22、3.21、1.27，備用呼吸能力分別為1.26、1.29、0.14。與N組、Vector組比較，PAK4組hRMEC內線粒體基礎呼吸、ATP生成、最大呼吸與備用呼吸能力均減弱，差異有統計學意義（F=27.472、22.315、31.147、27.472，P＜0.05）（圖6）。
圖6
N組、Vector組、PAK4組hRMEC內線粒體壓力檢測（n=3） OCR：耗氧率；PAK4：p21活化激酶4； hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ATP：三磷酸腺苷；N組：常規培養細胞組，加入150 μg/ml糖基化終末產物（AGE）誘導；Vector組：轉染空載質粒組，加入150 μg/ml AGE誘導；PAK4組：轉染PAK4質粒組，加入 150 μg/ml AGE誘導。*P＜0.05
3 討論
視網膜是中樞神經系統的一部分，需消耗大量葡萄糖和氧氣，通過線粒體氧化磷酸化產生ATP，以實現其光轉導和視覺功能[9]。糖代謝產物AGE在人體內的積累可能誘發氧化應激，導致線粒體發生損傷，紊亂氧化磷酸化、糖酵解、三羧酸循環之間的動態平衡，誘發氧化應激與炎癥的發生，導致血管內皮細胞的增生遷移，引發內皮細胞功能障礙，最終導致新生血管形成，加重DR進展[10-11]。因此，維持視網膜血管內皮細胞線粒體穩態，保護線粒體的正常代謝對于改善DR至關重要。
PAK4作為絲氨酸/蘇氨酸激酶家族一員，其表達水平的增加與多種類型的疾病密切相關[12-13]。PAK4可促進結腸癌細胞對葡萄糖的攝入和脂質生物合成，啟動結腸癌細胞的線粒體功能異常，導致癌細胞代謝重編程，進而促進結腸癌細胞的增生[14]。PAK4過表達可以促進細胞增生、侵襲和遷移，調節細胞骨架組織并增加細胞粘附力[15]。在神經炎癥中，PAK4的激活與腦炎病毒介導的炎性因子的表達增加有關[7]，而抑制PAK4可抑制膠質母細胞瘤的腫瘤內皮細胞粘附蛋白的生成，減少血管異常，同時抑制白細胞對內皮細胞的粘附[16-17]。本研究首先構建糖尿病小鼠模型并明確其視網膜中PAK4表達水平顯著高于正常對照組，提示PAK4與DR的發生發展可能存在潛在關聯。
為進一步明確PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞生物學行為及線粒體功能的影響。本研究將PAK4真核表達質粒導入hRMEC以實現PAK4高表達，并在此基礎上通過相關實驗評價PAK4在糖尿病微環境下的作用，發現PAK4可顯著促進視網膜血管內皮細胞的遷移以及白細胞粘附。在糖尿病早期粘附分子及炎性因子表達上調可促進白細胞與血管內皮的粘附[18]。作為炎癥反應中的關鍵步驟，白細胞粘附損傷視網膜血管內皮細胞，破壞血視網膜屏障完整性[19]。此外，本研究采用細胞能量代謝分析儀（Seahorse），通過線粒體應激壓力實驗分析PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞線粒體功能的影響。Seahorse是檢測線粒體功能和細胞代謝的工具，可以實時且以不需要任何染料或標記物的非侵入性方式測量線粒體呼吸，并以基礎呼吸、ATP生成、質子漏、最大呼吸值、能量儲備能力等多方面數據輸出結果[20-21]。線粒體壓力測試結果顯示，PAK4高表達對視網膜血管內皮細胞基礎呼吸值、ATP生成、最大呼吸值、呼吸儲備能力有明顯抑制作用。
本研究通過觀察動物及細胞模型中PAK4的表達水平及線粒體呼吸變化，初步判斷PAK4可能通過影響線粒體穩態誘導白細胞粘附以及視網膜血管內皮細胞遷移。今后應進一步完善實驗方案，后續研究希望以PAK4抑制劑為干預手段，開發其藥用價值為治療DR提供新的策略。更加深刻地解讀PAK4的炎癥調控作用，包括PAK4抑制劑對視網膜血管內皮細胞粘附分子及炎性介質表達的影響，對線粒體氧化應激及能量代謝的調控等。
