引用本文： 焦明菲, 曹靖靖, 李輝, 寇振宇, 吳桂佳, 東莉潔. 二甲雙胍抑制糖尿病視網膜血管內皮細胞中核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3炎癥小體活化和細胞焦亡. 中華眼底病雜志, 2023, 39(5): 408-414. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220818-00463 復制
高血糖和炎癥是影響糖尿病視網膜病變（DR）病理生理的主要因素。在DR模型中，包括內皮細胞、周細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞在內的許多類型視網膜細胞中存在細胞焦亡[1]。細胞焦亡是由炎性小體引發的一種細胞程序性死亡，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂。核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體介導效應蛋白炎性半胱天冬酶1（Caspase-1）激活，同時可調節Caspase-1依賴的細胞焦亡[2]。研究表明，高糖誘導人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）焦亡，NLRP3、Caspase-1活性顯著增加[3]。在RPE細胞中，NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）和cleaved-Caspase-1的蛋白表達水平隨葡萄糖濃度升高而增加[4]。因此，NLRP3/cleaved-Caspase-1/cleaved-GSDMD在促進高血糖誘導的DR細胞焦亡方面發揮重要作用。二甲雙胍（Met）是治療2型糖尿病（DM）的一線藥物，具有抗炎、抗氧化及降低血糖作用。近期研究表明，Met具有治療DM相關微血管并發癥的輔助作用，以劑量依賴性方式抑制血管生成，降低hRMEC中核因子（NF）-κB p65、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1和白細胞介素（IL）-8等炎性因子的表達[5]。長期服用Met可有效降低嚴重非增生型DR或增生型DR的發生率。目前已有大量研究深入探討DR發病的病理生理機制，但細胞焦亡在DR的發病機制中發揮的作用及Met對細胞焦亡的抑制作用研究較少。本研究目的是評估Met在小鼠視網膜中及在用晚期糖基化終末產物（AGE）處理的hRMEC中的抗焦亡作用及機制，初步探索經抗焦亡途徑治療DR的新藥物。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。
動物模型建立及分組。8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠9只，隨機分為DM組、正常對照組、DM+Met處理組（DM+Met組），每組各3只小鼠。正常對照組小鼠常規飼養，不作任何處理。DM組、DM+Met組小鼠禁食12 h后，按體重腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素，連續5 d，1周后小鼠尾靜脈平均血糖＞16.7 mmol/L為建模成功[6]。DM+Met組給予二甲雙胍250 mg/（kg·d）灌胃，連續14 d。建模后8周進行后續實驗。
免疫組織化學染色檢測正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網膜血管內皮細胞層中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，蘇木精-伊紅染色[7]。其后依次透膜、封閉，與一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，清洗加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育30 min，清洗后甘油封片，光學顯微鏡下觀察。應用Image J軟件圖像分析視網膜血管內皮細胞層中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達情況。實驗重復3次。
1.2 體外細胞實驗
細胞培養與分組。hRMEC（本實驗室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基中常規培養。細胞分為常規細胞培養組（N組）、AGE誘導組（AGE組）、AGE+Met處理組（AGE+Met組）。N組細胞常規培養，不作任何處理；AGE組、AGE+Met組加入150 μg/ml AGE誘導細胞72 h；AGE+Met組同時加入2.0 mmol/L Met處理72 h。
流式細胞儀檢測hRMEC焦亡率。N組、AGE組、AGE+Met組細胞按分組處理后，消化細胞后離心收集細胞，PBS浸洗，再離心去上清，按照膜聯蛋白-V（Annexin-V）-APC/7-氨基放線菌素（7-AAD）試劑盒說明操作，加入Annexin V-APC溶液室溫下避光反應15 min，再加入7-AAD染色液避光反應5 min，流式細胞儀檢測各組細胞晚期（雙陽性細胞）焦亡率，焦亡細胞為紅色熒光。每組樣品設置3個副孔Annexin-V，每孔獲取50 000個微粒信號，實驗重復3次，檢測結果通過Flowjo7.6軟件進行分析。
2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測hRMEC中活性氧（ROS）表達。N組、AGE組、AGE+Met組細胞按分組處理后，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針DCFDA（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育30 min，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1蛋白相對表達量。收集各組細胞，取40 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V恒壓0.5 h，分離膠100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h，二喹啉甲酸封閉，一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1（美國Affnity公司） 4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜10 min，3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗（美國Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化學發光底物進行曝光并拍照。以β-肌動蛋白（actin）為內參照，采用Bio-Rad軟件分析目的蛋白表達量。實驗重復3次。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1 mRNA相對表達量。應用總RNA提取試劑盒（上海怡澤生物科技有限公司）純化總RNA，分光光度計檢測其濃度，逆轉錄酶（武漢賽維爾生物科技有限公司）合成cDNA，以β-actin為內參照。應用Primer Premier軟件設計引物序列（表1）。PCR反應體系包括2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合。PCR反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，59℃退火15 s，72℃延伸10 min，40個循環；95℃反應15 s，60℃反應1 min，95℃作用15 s。實時熒光定量PCR（瑞士Roche 公司LC480）進行檢測，通過2?△△CT計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
表1
基因擴增測序引物
1.3 統計學分析
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
）表示。兩組間比較行獨立樣本t檢驗；三組間比較行單因素方差分析，分析前對數據的方差齊性進行檢驗。采用Graph-Prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 體內動物實驗結果
與DM組比較，正常對照組、DM+Met組小鼠視網膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達顯著下降。三組間NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達比較，差異有統計學意義（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）（圖1）。
圖1
正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達比較（n=6） DM：糖尿病；Met：二甲雙胍；NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；正常對照組：常規飼養，不作任何處理；DM組：糖尿病組；DM+Met組：給予Met 400 mg/（kg·d）干預。**P＜0.01
2.2 體外細胞實驗
流式細胞儀檢測結果顯示，N組、AGE組、AGE+Met組細胞焦亡率分別為3.80%、69.20%、39.86%；N組、AGE+Met組細胞焦亡率顯著低于AGE組，差異有統計學意義（F=32.598，P＜0.01）（圖2）。
圖2
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC焦亡率比較（n=3） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Annexin-V-PE：膜聯蛋白-V-聚乙烯；7-AAD：7-氨基放線菌素；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。2A～2C分別示N組、AGE組、AGE+Met組流式細胞儀檢測像；2D示3組細胞焦亡率比較，**P＜0.01
DCFH-DA熒光探針檢測結果顯示，N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內ROS表達量分別為1.26×101、1.00×103、1.20×101；AGE組ROS表達水平較N組、AGE+Met組顯著升高，差異有統計學意義（F=47.267，P＜0.01）（圖3）。
圖3
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內ROS水平比較（n=3） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。3A示3組流式細胞儀檢測像；3B示3組ROS水平比較，**P＜0.01
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA相對表達量分別為1.63±0.15、6.22±0.02、1.75±0.07，1.54±0.09、 6.25±0.07、1.62±0.11和1.59±0.07、5.93±0.04、1.64±0.11；蛋白相對表達量分別為0.50、1.05、0.57，0.73、1.30、0.86和0.55、1.15、0.75。與N組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相對表達量比較，AGE組均升高，AGE+Met組均降低，差異有統計學意義（mRNA相對表達量：F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01；蛋白相對表達量：F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）（圖4）。
圖4
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA、蛋白相對表達量比較（n=6） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。4A示3組mRNA相對表達量結果，**P＜0.01；4B分別示3組蛋白相對表達量結果，**P＜0.01
3 討論
大量研究表明，炎癥和氧化應激可造成視網膜損傷和細胞死亡，進而導致DR的發生發展[8]。AGE在人體內的積累可能誘發氧化應激，導致內皮細胞功能障礙[9]，因此在體外模型中，本研究采用AGE誘導以模擬DR中血管內皮細胞的氧化應激反應。
細胞焦亡是由炎性小體引發的一種炎癥狀態下的細胞程序性死亡。這與在一定生理或病理條件下，受體內遺傳機制控制，按照自身程序主動性、生理性的細胞焦亡完全不同。細胞焦亡主要依靠炎性小體激活Caspase-1，使其激活并切割GSDMD，活化的GSDMD轉位到膜上，形成孔洞，細胞腫脹，胞質外流，最終導致細胞膜破裂，細胞焦亡[10]。NLRP3作為最具特征的炎性小體，可被廣泛的危險信號激活，這些信號可能來自微生物或代謝失調異常產物。ROS是主要來源于線粒體的氧代謝副產物，可以積累和破壞DNA、脂質、蛋白質和線粒體DNA等細胞成分，參與眾多與眼病相關的病理過程。過量ROS的產生會導致氧化應激。ROS可通過從其抑制劑硫氧還蛋白中釋放對ROS敏感的NLRP3配體硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP），進而導致NLRP3炎性小體的激活。NLRP3炎性小體的激活是誘導炎癥反應及細胞焦亡的關鍵機制[11]。原花青素可通過減少ROS的產生并抑制NLRP3炎性小體的活化來減輕高糖誘導的RPE細胞損傷[12]。AGE誘導ROS的大量產生可導致NLRP3炎性小體的過度活化和炎癥級聯反應，最終導致角膜上皮細胞的慢性炎癥和焦亡[13]。有研究發現，hRMEC中高糖對ROS的誘導增加了TXNIP的表達，進而觸發NLRP3炎癥小體的激活，NLRP3基因沉默導致IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、血管內皮生長因子、ICAM-1減少，表明NLRP3炎性小體是炎性級聯反應的關鍵引發劑。而米諾環素可通過ROS-TXNIP通路介導的NLRP3活性抑制減輕DM大鼠的視網膜血管通透性并抑制hRMEC的焦亡[14]。本研究結果顯示，AGE組hRMEC內ROS大量產生，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達水平上調。這表明AGE-ROS-NLRP3-Caspase-1-GSDMD軸介導的炎癥及細胞焦亡參與了DR的發病機制。
Met是一種雙胍類藥物，廣泛應用于2型DM治療。其通過抑制肝臟糖異生、激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及抑制線粒體ROS對細胞代謝的直接影響發揮其主要抗糖作用[15]。Met對正常細胞和組織在某些情況下具有自我保護作用。線粒體是Met的主要亞細胞靶點，其中線粒體復合物Ⅰ抑制的直接結果是減少ROS的產生。既往研究表明，Met可減弱百草枯誘導的ROS升高及相關DNA損傷和突變。從Met治療8周的小鼠中分離出的脂肪干細胞中ROS和一氧化氮減少，而超氧化物歧化酶水平上調，這也提示Met觸發了抗氧化反應。Met可通過減弱ROS的生成來抑制缺血再灌注誘導的脂肪肝氧化應激[16]。
此外，新近研究數據表明，Met對視網膜相關疾病亦具有抗炎、抗血管生成和抗氧化保護作用，包括DR、老年性黃斑變性、遺傳性視網膜變性、原發性開角型青光眼、視網膜靜脈阻塞和葡萄膜炎等。葡萄膜炎患者房水IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-18水平升高，Met可以激活AMPK，抑制環氧合酶2、誘導型一氧化氮合酶和NF-κB的激活，從而抑制以上因子的表達[17]。Met還可以抑制TNF誘導的ICAM-1和MCP-1的表達，以及抑制內皮細胞增生、遷移和管腔形成，從而防止視網膜新生血管形成[18]。文獻報道，Met可通過調節AMPK和去乙酰化酶抑制炎癥、ROS生成、內皮細胞衰老和新生血管形成，從而抑制DM及其并發癥的發展，這可能是預防或減輕DR的潛在機制[19]。因此，啟發我們探索Met在DR中的具體治療機制，即是否可通過抑制ROS的生成進而抑制細胞焦亡，以達到治療DR的目的。本研究結果顯示，AGE+Met組hRMEC中ROS水平下降，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達水平下調，表明Met的應用可減少ROS的產生并抑制細胞焦亡。
盡管本研究已初步明確AGE可誘導ROS大量產生，激活NLRP3炎性小體，導致hRMEC的炎癥反應及細胞焦亡，而Met可減少ROS的產生并抑制NLRP3的活化進而抑制細胞焦亡，但在實驗設計方面仍然存在一定局限性和不足之處。一方面存在劑量值和觀察時間點單一的問題，會影響對結果的動態或深入分析；另一方面，研究結果還僅僅停留在Met對NLRP3炎癥小體活化和焦亡的影響，但對Met發揮作用的分子機制尚未能很好地闡明。未來我們將進一步深入研究Met通過抑制細胞焦亡對病理性新生血管相關疾病的保護作用及機制，并取多個時間點及劑量濃度，實現對量效關系的動態解讀，并引入NLRP3的激動劑以期全方位多層次探究Met的作用及機制，明確其抗炎和抗焦亡的作用。
高血糖和炎癥是影響糖尿病視網膜病變（DR）病理生理的主要因素。在DR模型中，包括內皮細胞、周細胞、Müller細胞和視網膜色素上皮（RPE）細胞在內的許多類型視網膜細胞中存在細胞焦亡[1]。細胞焦亡是由炎性小體引發的一種細胞程序性死亡，表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂。核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體介導效應蛋白炎性半胱天冬酶1（Caspase-1）激活，同時可調節Caspase-1依賴的細胞焦亡[2]。研究表明，高糖誘導人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）焦亡，NLRP3、Caspase-1活性顯著增加[3]。在RPE細胞中，NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）和cleaved-Caspase-1的蛋白表達水平隨葡萄糖濃度升高而增加[4]。因此，NLRP3/cleaved-Caspase-1/cleaved-GSDMD在促進高血糖誘導的DR細胞焦亡方面發揮重要作用。二甲雙胍（Met）是治療2型糖尿病（DM）的一線藥物，具有抗炎、抗氧化及降低血糖作用。近期研究表明，Met具有治療DM相關微血管并發癥的輔助作用，以劑量依賴性方式抑制血管生成，降低hRMEC中核因子（NF）-κB p65、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1和白細胞介素（IL）-8等炎性因子的表達[5]。長期服用Met可有效降低嚴重非增生型DR或增生型DR的發生率。目前已有大量研究深入探討DR發病的病理生理機制，但細胞焦亡在DR的發病機制中發揮的作用及Met對細胞焦亡的抑制作用研究較少。本研究目的是評估Met在小鼠視網膜中及在用晚期糖基化終末產物（AGE）處理的hRMEC中的抗焦亡作用及機制，初步探索經抗焦亡途徑治療DR的新藥物。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 體內動物實驗
本研究由天津醫科大學眼科醫院動物倫理委員會批準（動物倫理批號：TJYY20190103002）。
動物模型建立及分組。8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠9只，隨機分為DM組、正常對照組、DM+Met處理組（DM+Met組），每組各3只小鼠。正常對照組小鼠常規飼養，不作任何處理。DM組、DM+Met組小鼠禁食12 h后，按體重腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素，連續5 d，1周后小鼠尾靜脈平均血糖＞16.7 mmol/L為建模成功[6]。DM+Met組給予二甲雙胍250 mg/（kg·d）灌胃，連續14 d。建模后8周進行后續實驗。
免疫組織化學染色檢測正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網膜血管內皮細胞層中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的表達。每組隨機選取3只小鼠，過量麻醉處死，摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，蘇木精-伊紅染色[7]。其后依次透膜、封閉，與一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫30 min，清洗加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育30 min，清洗后甘油封片，光學顯微鏡下觀察。應用Image J軟件圖像分析視網膜血管內皮細胞層中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達情況。實驗重復3次。
1.2 體外細胞實驗
細胞培養與分組。hRMEC（本實驗室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培養基中常規培養。細胞分為常規細胞培養組（N組）、AGE誘導組（AGE組）、AGE+Met處理組（AGE+Met組）。N組細胞常規培養，不作任何處理；AGE組、AGE+Met組加入150 μg/ml AGE誘導細胞72 h；AGE+Met組同時加入2.0 mmol/L Met處理72 h。
流式細胞儀檢測hRMEC焦亡率。N組、AGE組、AGE+Met組細胞按分組處理后，消化細胞后離心收集細胞，PBS浸洗，再離心去上清，按照膜聯蛋白-V（Annexin-V）-APC/7-氨基放線菌素（7-AAD）試劑盒說明操作，加入Annexin V-APC溶液室溫下避光反應15 min，再加入7-AAD染色液避光反應5 min，流式細胞儀檢測各組細胞晚期（雙陽性細胞）焦亡率，焦亡細胞為紅色熒光。每組樣品設置3個副孔Annexin-V，每孔獲取50 000個微粒信號，實驗重復3次，檢測結果通過Flowjo7.6軟件進行分析。
2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光探針檢測hRMEC中活性氧（ROS）表達。N組、AGE組、AGE+Met組細胞按分組處理后，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針DCFDA（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育30 min，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1蛋白相對表達量。收集各組細胞，取40 μg蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V恒壓0.5 h，分離膠100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h，二喹啉甲酸封閉，一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1（美國Affnity公司） 4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗膜10 min，3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗（美國Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化學發光底物進行曝光并拍照。以β-肌動蛋白（actin）為內參照，采用Bio-Rad軟件分析目的蛋白表達量。實驗重復3次。
實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1 mRNA相對表達量。應用總RNA提取試劑盒（上海怡澤生物科技有限公司）純化總RNA，分光光度計檢測其濃度，逆轉錄酶（武漢賽維爾生物科技有限公司）合成cDNA，以β-actin為內參照。應用Primer Premier軟件設計引物序列（表1）。PCR反應體系包括2 μl cDNA、1 μl正向引物、1 μl反向引物和4 μl SYBR混合。PCR反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，59℃退火15 s，72℃延伸10 min，40個循環；95℃反應15 s，60℃反應1 min，95℃作用15 s。實時熒光定量PCR（瑞士Roche 公司LC480）進行檢測，通過2?△△CT計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
表1
基因擴增測序引物
1.3 統計學分析
采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示。兩組間比較行獨立樣本t檢驗；三組間比較行單因素方差分析，分析前對數據的方差齊性進行檢驗。采用Graph-Prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 體內動物實驗結果
與DM組比較，正常對照組、DM+Met組小鼠視網膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達顯著下降。三組間NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達比較，差異有統計學意義（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）（圖1）。
圖1
正常對照組、DM組、DM+Met組小鼠視網膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達比較（n=6） DM：糖尿病；Met：二甲雙胍；NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；正常對照組：常規飼養，不作任何處理；DM組：糖尿病組；DM+Met組：給予Met 400 mg/（kg·d）干預。**P＜0.01
2.2 體外細胞實驗
流式細胞儀檢測結果顯示，N組、AGE組、AGE+Met組細胞焦亡率分別為3.80%、69.20%、39.86%；N組、AGE+Met組細胞焦亡率顯著低于AGE組，差異有統計學意義（F=32.598，P＜0.01）（圖2）。
圖2
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC焦亡率比較（n=3） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；Annexin-V-PE：膜聯蛋白-V-聚乙烯；7-AAD：7-氨基放線菌素；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。2A～2C分別示N組、AGE組、AGE+Met組流式細胞儀檢測像；2D示3組細胞焦亡率比較，**P＜0.01
DCFH-DA熒光探針檢測結果顯示，N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內ROS表達量分別為1.26×101、1.00×103、1.20×101；AGE組ROS表達水平較N組、AGE+Met組顯著升高，差異有統計學意義（F=47.267，P＜0.01）（圖3）。
圖3
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內ROS水平比較（n=3） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；ROS：活性氧；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。3A示3組流式細胞儀檢測像；3B示3組ROS水平比較，**P＜0.01
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA相對表達量分別為1.63±0.15、6.22±0.02、1.75±0.07，1.54±0.09、 6.25±0.07、1.62±0.11和1.59±0.07、5.93±0.04、1.64±0.11；蛋白相對表達量分別為0.50、1.05、0.57，0.73、1.30、0.86和0.55、1.15、0.75。與N組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相對表達量比較，AGE組均升高，AGE+Met組均降低，差異有統計學意義（mRNA相對表達量：F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01；蛋白相對表達量：F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）（圖4）。
圖4
N組、AGE組、AGE+Met組hRMEC內NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA、蛋白相對表達量比較（n=6） AGE：晚期糖基化終末產物；Met：二甲雙胍；hRMEC：人視網膜微血管內皮細胞；NLRP3：核苷酸結合寡聚化結構樣受體蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；N組：常規培養細胞組；AGE組：加入150 μg/ml AGE誘導；AGE+Met組：加入2.0 mmol/L Met干預，150 μg/ml AGE誘導。4A示3組mRNA相對表達量結果，**P＜0.01；4B分別示3組蛋白相對表達量結果，**P＜0.01
3 討論
大量研究表明，炎癥和氧化應激可造成視網膜損傷和細胞死亡，進而導致DR的發生發展[8]。AGE在人體內的積累可能誘發氧化應激，導致內皮細胞功能障礙[9]，因此在體外模型中，本研究采用AGE誘導以模擬DR中血管內皮細胞的氧化應激反應。
細胞焦亡是由炎性小體引發的一種炎癥狀態下的細胞程序性死亡。這與在一定生理或病理條件下，受體內遺傳機制控制，按照自身程序主動性、生理性的細胞焦亡完全不同。細胞焦亡主要依靠炎性小體激活Caspase-1，使其激活并切割GSDMD，活化的GSDMD轉位到膜上，形成孔洞，細胞腫脹，胞質外流，最終導致細胞膜破裂，細胞焦亡[10]。NLRP3作為最具特征的炎性小體，可被廣泛的危險信號激活，這些信號可能來自微生物或代謝失調異常產物。ROS是主要來源于線粒體的氧代謝副產物，可以積累和破壞DNA、脂質、蛋白質和線粒體DNA等細胞成分，參與眾多與眼病相關的病理過程。過量ROS的產生會導致氧化應激。ROS可通過從其抑制劑硫氧還蛋白中釋放對ROS敏感的NLRP3配體硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP），進而導致NLRP3炎性小體的激活。NLRP3炎性小體的激活是誘導炎癥反應及細胞焦亡的關鍵機制[11]。原花青素可通過減少ROS的產生并抑制NLRP3炎性小體的活化來減輕高糖誘導的RPE細胞損傷[12]。AGE誘導ROS的大量產生可導致NLRP3炎性小體的過度活化和炎癥級聯反應，最終導致角膜上皮細胞的慢性炎癥和焦亡[13]。有研究發現，hRMEC中高糖對ROS的誘導增加了TXNIP的表達，進而觸發NLRP3炎癥小體的激活，NLRP3基因沉默導致IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、血管內皮生長因子、ICAM-1減少，表明NLRP3炎性小體是炎性級聯反應的關鍵引發劑。而米諾環素可通過ROS-TXNIP通路介導的NLRP3活性抑制減輕DM大鼠的視網膜血管通透性并抑制hRMEC的焦亡[14]。本研究結果顯示，AGE組hRMEC內ROS大量產生，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達水平上調。這表明AGE-ROS-NLRP3-Caspase-1-GSDMD軸介導的炎癥及細胞焦亡參與了DR的發病機制。
Met是一種雙胍類藥物，廣泛應用于2型DM治療。其通過抑制肝臟糖異生、激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及抑制線粒體ROS對細胞代謝的直接影響發揮其主要抗糖作用[15]。Met對正常細胞和組織在某些情況下具有自我保護作用。線粒體是Met的主要亞細胞靶點，其中線粒體復合物Ⅰ抑制的直接結果是減少ROS的產生。既往研究表明，Met可減弱百草枯誘導的ROS升高及相關DNA損傷和突變。從Met治療8周的小鼠中分離出的脂肪干細胞中ROS和一氧化氮減少，而超氧化物歧化酶水平上調，這也提示Met觸發了抗氧化反應。Met可通過減弱ROS的生成來抑制缺血再灌注誘導的脂肪肝氧化應激[16]。
此外，新近研究數據表明，Met對視網膜相關疾病亦具有抗炎、抗血管生成和抗氧化保護作用，包括DR、老年性黃斑變性、遺傳性視網膜變性、原發性開角型青光眼、視網膜靜脈阻塞和葡萄膜炎等。葡萄膜炎患者房水IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-18水平升高，Met可以激活AMPK，抑制環氧合酶2、誘導型一氧化氮合酶和NF-κB的激活，從而抑制以上因子的表達[17]。Met還可以抑制TNF誘導的ICAM-1和MCP-1的表達，以及抑制內皮細胞增生、遷移和管腔形成，從而防止視網膜新生血管形成[18]。文獻報道，Met可通過調節AMPK和去乙酰化酶抑制炎癥、ROS生成、內皮細胞衰老和新生血管形成，從而抑制DM及其并發癥的發展，這可能是預防或減輕DR的潛在機制[19]。因此，啟發我們探索Met在DR中的具體治療機制，即是否可通過抑制ROS的生成進而抑制細胞焦亡，以達到治療DR的目的。本研究結果顯示，AGE+Met組hRMEC中ROS水平下降，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表達水平下調，表明Met的應用可減少ROS的產生并抑制細胞焦亡。
盡管本研究已初步明確AGE可誘導ROS大量產生，激活NLRP3炎性小體，導致hRMEC的炎癥反應及細胞焦亡，而Met可減少ROS的產生并抑制NLRP3的活化進而抑制細胞焦亡，但在實驗設計方面仍然存在一定局限性和不足之處。一方面存在劑量值和觀察時間點單一的問題，會影響對結果的動態或深入分析；另一方面，研究結果還僅僅停留在Met對NLRP3炎癥小體活化和焦亡的影響，但對Met發揮作用的分子機制尚未能很好地闡明。未來我們將進一步深入研究Met通過抑制細胞焦亡對病理性新生血管相關疾病的保護作用及機制，并取多個時間點及劑量濃度，實現對量效關系的動態解讀，并引入NLRP3的激動劑以期全方位多層次探究Met的作用及機制，明確其抗炎和抗焦亡的作用。
