引用本文： 房心荷, 朱艷, 袁仕琴, 容維寧, 王曉光, 芮雪, 馬美嬌, 盛迅倫. Leber先天性黑矇患者不同基因新突變與臨床表型分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 668-674. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220406-00192 復制
Leber先天性黑矇（LCA）是一種嚴重致盲性遺傳性視網膜疾病，是導致兒童先天性早發性盲的首要疾病[1]。LCA多表現為常染色體隱性遺傳，以眼球震顫、固視障礙、指壓眼征為主要臨床特征，視網膜電圖（ERG）表現為明、暗適應振幅中重度降低甚至呈熄滅型，具有診斷意義[2]；部分患者可伴有小眼球、圓錐角膜、身體智力發育遲緩等綜合征表現。LCA為單基因遺傳眼病，目前已發現與其相關的致病基因28個，主要包括AIPL1、CEP290、 RDH12、 GUCY2D、CRB1、RPE65、RPGRIP1[3]。各種視網膜功能相關基因突變引起蛋白、細胞結構功能異常而導致視功能嚴重喪失[4]。國際罕見病研究聯盟在其愿景中指出，到2020年，所有遺傳疾病患者都應得到分子診斷[5]，目前大家系、多患者的遺傳性疾病少見，利用傳統的直接測序法檢測效率低、耗時長、費用高，并且難以找到致病基因。對于小家系和散發患者，開發特異性高、覆蓋率廣的分子檢測技術，做到優生診斷，是當下研究的重點和難點。本研究采用全基因組外顯子測序技術對3個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，借助共分離驗證和生物信息學分析，明確其新致病基因突變位點，并初步分析與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究經寧夏回族自治區人民醫院倫理委員會審核（批準號：倫理[2021]-NZR-003）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；未成年患兒監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年1～12月于寧夏回族自治區人民醫院眼科檢查確診的4例LCA患者和7名家系成員納入本研究。4例患者來自3個無血緣關系家系。詳細詢問家族史、婚育史、全身疾病史，繪制家系圖（圖1）。患者及家系成員均行祼眼及最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、眼底彩色照相、視野、光相干斷層掃描（OCT）、全視野視網膜電圖（ff-ERG）、眼底自身熒光（AF）檢查。行熒光素眼底血管造影（FFA）1例。
圖1
3個LCA患者家系圖。1A～1C分別示家系1、2、3。□：健康男性； ○：健康女性； ■：患病男性； ●：患病女性；↗：先證者；參照文獻[6-7]的標準確立LCA臨床診斷標準：（1）6月齡以下視力嚴重損害或盲，伴固視障礙、眼球震顫或指壓眼征；（2）ff-ERG a、b波振幅嚴重降低，甚至呈熄滅型；（3）視網膜廣泛散在色素顆粒沉著，呈骨細胞樣或“椒鹽樣”改變。
采集患者及家系成員外周靜脈血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國QIAGEN公司Qiamp Blood Mini Kit DNA提取試劑盒按照操作規程提取全基因組DNA，DNA質量濃度≥50 ng/μl，DNA總量≥6 μg。采用美國Agilent公司SureSelect外顯子捕獲試劑盒行全基因組外顯子捕獲；美國Illumina公司Illumina NextSeq 500平臺進行高通量測序，測序深度100×。原始測序數據經Illumina Basecalling Software 1.7分析軟件處理后，與美國國立生物技術信息中心（NCBI）人類基因組DNA參照序列（NCBI build 37.1）進行比對。采用SOAP（http://soap. genomics.org.cn）、BWA軟件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）分別分析單核苷酸變異、插入和缺失變異的相關信息，獲得全部變異位點。濾過最小等位基因頻率（MAF）值＞1%的高頻變異位點及對蛋白質功能和結構無影響的變異位點。經逐步過濾，篩選出家系內所有先證者共享的變異數，再過濾家系中無患病成員存在的變異，獲得候選致病基因變異。對測序變異結果進行Sanger測序，驗證得到的致病性突變位點，確保正常家系成員中呈現共分離。根據遺傳規律，分析家族史，確立其遺傳類型。
依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）2015年發布的《序列變異解讀標準和指南》[8]對新發現突變位點進行致病等級評估。參考千人基因組計劃數據庫（http://browser. 1000genomes.org）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）東亞人種等位基因頻率，MAF＜0.005作為排除良性變異的標準。應用Polyphen2（http://genetics.bwh. harvard.edu/pph2）、SIFT（http://sift.jcvi.org）、PROVEAN （http://provean.jcvi.org/index.php）、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）蛋白預測軟件分析錯義變異對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性，進行致病性預測。運用GERP++（https://bio.tools/gerp）等網站衡量進化中跨物種基因序列的保守情況。Polyphen2、Mutation Taster軟件對突變位點預測值范圍均為0～1，分值越高越有害；氨基酸序列保守性GERP++預測值范圍＞2表示比較保守，高分數意味著序列高度保守，因此改變是有害的。
2 結果
家系1先證者（Ⅱ-1），男，12歲，發病年齡出生后2個月。雙眼眼球震顫。雙眼祼眼視力均為數指，BCVA均為0.04；紅綠色盲。眼底彩色照相檢查，雙眼眼底視盤邊界清楚、顏色正常；黃斑中心凹反光可見，視網膜未見色素沉著。OCT檢查，右眼黃斑區橢圓體帶隆起呈強反射信號（圖2A）；左眼無明顯異常。眼底AF檢查，視盤顳下方片狀弱熒光區。FFA檢查，雙眼血管分支增多；右眼周邊視網膜可見無灌注區伴毛細血管滲漏（圖2B，2C）。ff-ERG檢查，雙眼明、暗適應振幅均重度下降。
圖2
LCA家系1先證者眼部檢查像。2A示右眼OCT像，右眼黃斑區橢圓體帶隆起呈強反射信號；2B、2C分別示右眼、左眼FFA像，雙眼視網膜血管分支增多，右眼周邊視網膜可見無灌注區伴毛細血管滲漏。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干斷層掃描；FFA：熒光素眼底血管造影
家系2先證者（Ⅱ-2），女，5歲，發病年齡4歲。指壓眼征伴夜間視力差。雙眼祼眼視力均為數指，BCVA均為0.2；全色盲。眼底視盤邊界清楚、顏色淡，杯盤比0.3；黃斑中心凹反光可見，周邊視網膜未見明顯異常，無色素沉著（圖3A）。OCT檢查，視網膜層間隱約可見弱反射信號（圖3B）。眼底AF檢查，雙眼黃斑區環狀強熒光（圖3C）。因患兒年齡小，FFA檢查欠配合。ff-ERG檢查，雙眼明、暗適應振幅均重度下降。
圖3
LCA家系2先證者眼部檢查像。3A示左眼彩色眼底像，視盤邊界清楚、顏色淡，黃斑中心凹反光可見，周邊視網膜未見明顯異常，無色素沉著；3B左眼OCT像，黃斑視網膜層間隱約可見弱反射信號；3C示左眼AF像，黃斑區環狀強熒光。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干斷層掃描；AF：自身熒光
家系3先證者（Ⅱ-1），女，18歲。雙眼祼眼視力均為0.02，BCVA均為0.1。其妹妹（Ⅱ-2）8歲，雙眼祼眼視力均為數指；BCVA右眼、左眼分別為0.25、0.10。先證者及其妹妹均自幼視物不清伴眼球震顫；全色盲。雙眼眼底彩色照相、OCT檢查均未見明顯異常；ff-ERG明、暗適應振幅均重度下降。其妹妹雙眼黃斑區AF增強（圖4）。
圖4
LCA家系3先證者妹妹AF像。4A、4B分別示先證者妹妹右眼、左眼AF像。雙眼黃斑區熒光增強。LCA：Leber先天性黑矇；AF：自身熒光
全外顯子測序結果顯示，家系1先證者（Ⅱ-1）攜帶 PRPH2 基因c.640T＞A（p.C214S）（M1）純合突變；其父親（Ⅰ-1）、母親（Ⅰ-2）該位點不存在突變（圖5）。家系2先證者（Ⅱ-2）攜帶TULP1基因c.1256G＞A（p.R419Q）（M2）、c.1A＞C（p.M1L）（M3）復合雜合突變；其父親（Ⅰ-1）、姐姐（Ⅱ-1）攜帶M2，母親（Ⅰ-2）攜帶M3。家系3先證者（Ⅱ-1）及其妹妹（Ⅱ-2）攜帶GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）復合雜合突變；其父親（Ⅰ-1）、母親（Ⅰ-2）分別攜帶M4、M5（圖6）。經各軟件分析上述突變均為致病突變，除M2外均為新發現突變位點（表1）。家系內基因型和疾病表型呈共分離。根據系譜及基因檢測結果分析，3個家系均為常染色體隱性遺傳。
圖5
LCA家系1先證者及其父母基因Sanger測序圖。5A示先證者，PRPH2基因c.640T＞A（p.C214S）純合突變（黑箭）；5B、5C分別示其父親、母親，該位點不存在突變。LCA：Leber先天性黑矇
圖6
LCA家系3先證者及其父母基因Sanger測序圖。6A、6B示先證者，GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）復合雜合突變；6C示先證者父親，攜帶M4；6D示先證者母親，攜帶M5。LCA：Leber先天性黑矇
表1
4例LCA患者基因檢測結果
生物信息學分析結果顯示，家系1先證者（Ⅱ-1）M1錯義突變位于第2外顯子。M1錯義突變第640位核苷酸T突變為A，導致第214位氨基酸由半胱氨酸變為絲氨酸。該突變未見文獻報道。在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點。蛋白分析結果顯示，Polyphen2軟件評分為0.957 1，Mutation Taster軟件評分為D，均為有害（表2）。根據ACMG指南，M1錯義突變評為PS2，數據庫中未發現該變異評為PM2，總致病性評分為PS2+PM2，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M1突變位點在人、牛、小鼠、倉鼠等物種中高度保守（圖7A）。
表2
PRPH2基因變異對其蛋白功能影響不同分析軟件預測結果
圖7
物種間序列保守性分析。7A示家系1，PRPH2 p.C214S所對應的第214位氨基酸序列位點在人、牛、小鼠和倉鼠等物種中高度保守（黑箭）；7B示家系2，TULP1 p.R419Q、p.M1L分別所對應的第419、1號氨基酸序列位點在人、猩猩、小鼠、野豬中高度保守（黑箭）；7C示家系3，GUCY2D p.L648P、p.P127L分別所對應的第648、127號氨基酸序列位點在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（黑箭）
家系2先證者（Ⅱ-2）TULP1基因M2、M3錯義突變分別位于第13、2外顯子。M2錯義突變第1 256位核苷酸G突變為A，導致第419位氨基酸由精氨酸轉變為谷氨酸。M3錯義突變第1位核苷酸由A突變為C，導致第1位氨基酸由蛋氨酸轉變為亮氨酸。M2錯義突變已被人類基因致病性突變數據庫收錄，M3在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點（表3）。根據ACMG指南，M2錯義突變評為PS1，符合家系共分離評為PP1，總致病性評分為PS1+PP1，為致病性變異；M3錯義突變評為PVS1，數據庫中未發現該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，總致病性評分為PVS1+PM2+PP1，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M2、M3突變位點在人、猩猩、小鼠、野豬中高度保守（圖7B）。
表3
TULP1基因變異對其蛋白功能影響的不同分析軟件預測結果
家系3先證者（Ⅱ-1）M4、M5錯義突變分別位于第9、2外顯子。M4錯義突變第1 943位核苷酸T突變為C，導致第648位氨基酸由亮氨酸變為脯氨酸；M5錯義突變第380位核苷酸由C突變為T，導致第127位氨基酸由脯氨酸變為亮氨酸。M4、M5錯義突變在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點（表4）。根據ACMG指南，M4、M5錯義突變評為PS2，數據庫中未發現該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，突變總致病性評分均為PS2+PM2+PP1，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M4、M5突變位點在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（圖7C）。
表4
GUCY2D基因變異對其蛋白功能影響的不同分析軟件預測結果
3 討論
LCA是一種極易導致兒童失明的視網膜疾病[9]，患兒多于出生時或6月齡內即出現視力低下、無固視、眼球震顫、指壓眼征、眼球內陷等。指壓眼征可引起眶周脂肪萎縮并眼窩凹陷。眼底表現可完全正常，也可表現為黃斑“牛眼樣”外觀、后極部灰白色斑點改變等，部分患者直至病變晚期仍可保持正常眼底外觀。ERG呈熄滅型或明、暗適應振幅重度下降，具有診斷意義。LCA臨床表現復雜，癥狀及體征特異性不強，其他綜合征或非綜合征眼病也可有相似表現，臨床上容易誤診為全色盲、不完全色盲、先天性靜止性夜盲、白化病和視神經發育不全等[10]。2016年Minegishi等[11]等發現導致LCA的新突變基因CCT2，其也是涉及光感受器連接纖毛轉運過程的基因。LCA具備臨床表型多樣性及遺傳異質性特點，主要表現為不同的等位基因或基因突變可引起相似的臨床表現[12]；但部分相同基因突變，發生在不同家系或不同位點時可有不同的臨床表現[13]。
PRPH2基因導致的LCA分型為LCA18型（OMIM：608133）[14]。PRPH2基因導致LCA的發病機制目前尚不明確，既往多認為PRPH2基因主要導致視網膜色素變性（RP）[15]。Becirovic等[16]研究發現，PRPH2基因中的點突變與影響桿狀和錐狀光感受器的嚴重視網膜退行性疾病有關，其電生理檢測明、暗適應振幅均呈顯著性下降，與本研究PRPH2基因突變導致的家系1電生理檢查結果一致。
TULP1是非綜合征型視網膜纖毛疾病相關基因，由542個氨基酸（相對分子質量61×103）構成，主要在視網膜光感受器細胞表達，內節表達最豐富，對于視紫紅質在光感受器內外節之間的轉運具有重要作用。TULP1基因變異可導致LCA15型（MIM：613843）和RP14型（MIM：600132）[12]。LCA15型具有LCA的一般特點，疾病嚴重程度較輕，但發病年齡早，表型嚴重于RP。Patel等[17]報道，TULP1基因錯義突變c.1256G＞A （p.Arg419Gln）可引起視網膜營養不良。本研究家系2先證者c.1256G＞A錯義突變引起的蛋白質變化p.R419Q，與Patel等[17]報道的蛋白質變化不同，導致的疾病也不同。相同位點的同種突變類型導致的疾病不同，我們考慮家系2為TULP1基因新突變位點（c.1A＞C）與已知突變位點（c.1256G＞A）的結合，從而引起蛋白結構功能發生變化。家系中先證者姐姐（Ⅱ-1）攜帶等位基因1突變c.1256G＞A（p.R419Q），眼部表型正常，其原因可能為2個突變共同構成復合雜合性突變是本家系的致病原因。該家系成員TULP1基因2個位點同時變異才表現出臨床癥狀。
GUCY2D基因編碼鳥苷酸環化酶，由1 103個氨基酸（相對分子質量120×103）構成，以跨膜蛋白的形式于光感受器細胞外節存在，其環磷酸鳥苷（cGMP）由三磷酸鳥苷催化轉變，cGMP門控離子通道得以開放，Ca2+、Na+細胞內流，光照射后恢復暗態。GUCY2D基因突變可導致LCA1型（MIM：204000）。其發病特點為視力嚴重損害，眼底通常無明顯病變，畏光明顯[18]。本研究中家系3先證者及其妹妹均為GUCY2D基因第9外顯子c.1943T＞C（p.L648P）和第2外顯子c.380C＞T（p.P127L）發生復合雜合錯義突變，眼底多為正常，但視功能損害嚴重，伴眼球震顫且為全色盲。
本研究從LCA的臨床表現和遺傳變異水平闡明了3個不同家系患者的致病原因，報道了導致LCA的新發變異，進一步擴充了LCA的突變位點，擴大了LCA基因突變頻譜，使該病的分子病理機制得到了進一步理解，為LCA精確診斷、遺傳咨詢和產前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據。同時也說明二代測序技術對此類疾病具有重要的輔助診斷意義。LCA具備臨床表型多樣性及遺傳異質性的特點，本研究的有限病例并不能涵蓋本病的一般情況，且患者多為幼兒，很多其他系統的病變尚未顯現，可能某些患者在未來會出現綜合征表現，還需加強隨訪和評估。
Leber先天性黑矇（LCA）是一種嚴重致盲性遺傳性視網膜疾病，是導致兒童先天性早發性盲的首要疾病[1]。LCA多表現為常染色體隱性遺傳，以眼球震顫、固視障礙、指壓眼征為主要臨床特征，視網膜電圖（ERG）表現為明、暗適應振幅中重度降低甚至呈熄滅型，具有診斷意義[2]；部分患者可伴有小眼球、圓錐角膜、身體智力發育遲緩等綜合征表現。LCA為單基因遺傳眼病，目前已發現與其相關的致病基因28個，主要包括AIPL1、CEP290、 RDH12、 GUCY2D、CRB1、RPE65、RPGRIP1[3]。各種視網膜功能相關基因突變引起蛋白、細胞結構功能異常而導致視功能嚴重喪失[4]。國際罕見病研究聯盟在其愿景中指出，到2020年，所有遺傳疾病患者都應得到分子診斷[5]，目前大家系、多患者的遺傳性疾病少見，利用傳統的直接測序法檢測效率低、耗時長、費用高，并且難以找到致病基因。對于小家系和散發患者，開發特異性高、覆蓋率廣的分子檢測技術，做到優生診斷，是當下研究的重點和難點。本研究采用全基因組外顯子測序技術對3個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，借助共分離驗證和生物信息學分析，明確其新致病基因突變位點，并初步分析與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
本研究經寧夏回族自治區人民醫院倫理委員會審核（批準號：倫理[2021]-NZR-003）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；未成年患兒監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年1～12月于寧夏回族自治區人民醫院眼科檢查確診的4例LCA患者和7名家系成員納入本研究。4例患者來自3個無血緣關系家系。詳細詢問家族史、婚育史、全身疾病史，繪制家系圖（圖1）。患者及家系成員均行祼眼及最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、眼底彩色照相、視野、光相干斷層掃描（OCT）、全視野視網膜電圖（ff-ERG）、眼底自身熒光（AF）檢查。行熒光素眼底血管造影（FFA）1例。
圖1
3個LCA患者家系圖。1A～1C分別示家系1、2、3。□：健康男性； ○：健康女性； ■：患病男性； ●：患病女性；↗：先證者；參照文獻[6-7]的標準確立LCA臨床診斷標準：（1）6月齡以下視力嚴重損害或盲，伴固視障礙、眼球震顫或指壓眼征；（2）ff-ERG a、b波振幅嚴重降低，甚至呈熄滅型；（3）視網膜廣泛散在色素顆粒沉著，呈骨細胞樣或“椒鹽樣”改變。
采集患者及家系成員外周靜脈血6 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國QIAGEN公司Qiamp Blood Mini Kit DNA提取試劑盒按照操作規程提取全基因組DNA，DNA質量濃度≥50 ng/μl，DNA總量≥6 μg。采用美國Agilent公司SureSelect外顯子捕獲試劑盒行全基因組外顯子捕獲；美國Illumina公司Illumina NextSeq 500平臺進行高通量測序，測序深度100×。原始測序數據經Illumina Basecalling Software 1.7分析軟件處理后，與美國國立生物技術信息中心（NCBI）人類基因組DNA參照序列（NCBI build 37.1）進行比對。采用SOAP（http://soap. genomics.org.cn）、BWA軟件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）分別分析單核苷酸變異、插入和缺失變異的相關信息，獲得全部變異位點。濾過最小等位基因頻率（MAF）值＞1%的高頻變異位點及對蛋白質功能和結構無影響的變異位點。經逐步過濾，篩選出家系內所有先證者共享的變異數，再過濾家系中無患病成員存在的變異，獲得候選致病基因變異。對測序變異結果進行Sanger測序，驗證得到的致病性突變位點，確保正常家系成員中呈現共分離。根據遺傳規律，分析家族史，確立其遺傳類型。
依據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）2015年發布的《序列變異解讀標準和指南》[8]對新發現突變位點進行致病等級評估。參考千人基因組計劃數據庫（http://browser. 1000genomes.org）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）東亞人種等位基因頻率，MAF＜0.005作為排除良性變異的標準。應用Polyphen2（http://genetics.bwh. harvard.edu/pph2）、SIFT（http://sift.jcvi.org）、PROVEAN （http://provean.jcvi.org/index.php）、Mutation Taster（http://www.mutationtaster.org）蛋白預測軟件分析錯義變異對蛋白質功能的影響，以判斷其致病性，進行致病性預測。運用GERP++（https://bio.tools/gerp）等網站衡量進化中跨物種基因序列的保守情況。Polyphen2、Mutation Taster軟件對突變位點預測值范圍均為0～1，分值越高越有害；氨基酸序列保守性GERP++預測值范圍＞2表示比較保守，高分數意味著序列高度保守，因此改變是有害的。
2 結果
家系1先證者（Ⅱ-1），男，12歲，發病年齡出生后2個月。雙眼眼球震顫。雙眼祼眼視力均為數指，BCVA均為0.04；紅綠色盲。眼底彩色照相檢查，雙眼眼底視盤邊界清楚、顏色正常；黃斑中心凹反光可見，視網膜未見色素沉著。OCT檢查，右眼黃斑區橢圓體帶隆起呈強反射信號（圖2A）；左眼無明顯異常。眼底AF檢查，視盤顳下方片狀弱熒光區。FFA檢查，雙眼血管分支增多；右眼周邊視網膜可見無灌注區伴毛細血管滲漏（圖2B，2C）。ff-ERG檢查，雙眼明、暗適應振幅均重度下降。
圖2
LCA家系1先證者眼部檢查像。2A示右眼OCT像，右眼黃斑區橢圓體帶隆起呈強反射信號；2B、2C分別示右眼、左眼FFA像，雙眼視網膜血管分支增多，右眼周邊視網膜可見無灌注區伴毛細血管滲漏。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干斷層掃描；FFA：熒光素眼底血管造影
家系2先證者（Ⅱ-2），女，5歲，發病年齡4歲。指壓眼征伴夜間視力差。雙眼祼眼視力均為數指，BCVA均為0.2；全色盲。眼底視盤邊界清楚、顏色淡，杯盤比0.3；黃斑中心凹反光可見，周邊視網膜未見明顯異常，無色素沉著（圖3A）。OCT檢查，視網膜層間隱約可見弱反射信號（圖3B）。眼底AF檢查，雙眼黃斑區環狀強熒光（圖3C）。因患兒年齡小，FFA檢查欠配合。ff-ERG檢查，雙眼明、暗適應振幅均重度下降。
圖3
LCA家系2先證者眼部檢查像。3A示左眼彩色眼底像，視盤邊界清楚、顏色淡，黃斑中心凹反光可見，周邊視網膜未見明顯異常，無色素沉著；3B左眼OCT像，黃斑視網膜層間隱約可見弱反射信號；3C示左眼AF像，黃斑區環狀強熒光。LCA：Leber先天性黑矇；OCT：光相干斷層掃描；AF：自身熒光
家系3先證者（Ⅱ-1），女，18歲。雙眼祼眼視力均為0.02，BCVA均為0.1。其妹妹（Ⅱ-2）8歲，雙眼祼眼視力均為數指；BCVA右眼、左眼分別為0.25、0.10。先證者及其妹妹均自幼視物不清伴眼球震顫；全色盲。雙眼眼底彩色照相、OCT檢查均未見明顯異常；ff-ERG明、暗適應振幅均重度下降。其妹妹雙眼黃斑區AF增強（圖4）。
圖4
LCA家系3先證者妹妹AF像。4A、4B分別示先證者妹妹右眼、左眼AF像。雙眼黃斑區熒光增強。LCA：Leber先天性黑矇；AF：自身熒光
全外顯子測序結果顯示，家系1先證者（Ⅱ-1）攜帶 PRPH2 基因c.640T＞A（p.C214S）（M1）純合突變；其父親（Ⅰ-1）、母親（Ⅰ-2）該位點不存在突變（圖5）。家系2先證者（Ⅱ-2）攜帶TULP1基因c.1256G＞A（p.R419Q）（M2）、c.1A＞C（p.M1L）（M3）復合雜合突變；其父親（Ⅰ-1）、姐姐（Ⅱ-1）攜帶M2，母親（Ⅰ-2）攜帶M3。家系3先證者（Ⅱ-1）及其妹妹（Ⅱ-2）攜帶GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）復合雜合突變；其父親（Ⅰ-1）、母親（Ⅰ-2）分別攜帶M4、M5（圖6）。經各軟件分析上述突變均為致病突變，除M2外均為新發現突變位點（表1）。家系內基因型和疾病表型呈共分離。根據系譜及基因檢測結果分析，3個家系均為常染色體隱性遺傳。
圖5
LCA家系1先證者及其父母基因Sanger測序圖。5A示先證者，PRPH2基因c.640T＞A（p.C214S）純合突變（黑箭）；5B、5C分別示其父親、母親，該位點不存在突變。LCA：Leber先天性黑矇
圖6
LCA家系3先證者及其父母基因Sanger測序圖。6A、6B示先證者，GUCY2D基因c.1943T＞C（p.L648P）（M4）、c.380C＞T（p.P127L）（M5）復合雜合突變；6C示先證者父親，攜帶M4；6D示先證者母親，攜帶M5。LCA：Leber先天性黑矇
表1
4例LCA患者基因檢測結果
生物信息學分析結果顯示，家系1先證者（Ⅱ-1）M1錯義突變位于第2外顯子。M1錯義突變第640位核苷酸T突變為A，導致第214位氨基酸由半胱氨酸變為絲氨酸。該突變未見文獻報道。在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點。蛋白分析結果顯示，Polyphen2軟件評分為0.957 1，Mutation Taster軟件評分為D，均為有害（表2）。根據ACMG指南，M1錯義突變評為PS2，數據庫中未發現該變異評為PM2，總致病性評分為PS2+PM2，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M1突變位點在人、牛、小鼠、倉鼠等物種中高度保守（圖7A）。
表2
PRPH2基因變異對其蛋白功能影響不同分析軟件預測結果
圖7
物種間序列保守性分析。7A示家系1，PRPH2 p.C214S所對應的第214位氨基酸序列位點在人、牛、小鼠和倉鼠等物種中高度保守（黑箭）；7B示家系2，TULP1 p.R419Q、p.M1L分別所對應的第419、1號氨基酸序列位點在人、猩猩、小鼠、野豬中高度保守（黑箭）；7C示家系3，GUCY2D p.L648P、p.P127L分別所對應的第648、127號氨基酸序列位點在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（黑箭）
家系2先證者（Ⅱ-2）TULP1基因M2、M3錯義突變分別位于第13、2外顯子。M2錯義突變第1 256位核苷酸G突變為A，導致第419位氨基酸由精氨酸轉變為谷氨酸。M3錯義突變第1位核苷酸由A突變為C，導致第1位氨基酸由蛋氨酸轉變為亮氨酸。M2錯義突變已被人類基因致病性突變數據庫收錄，M3在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點（表3）。根據ACMG指南，M2錯義突變評為PS1，符合家系共分離評為PP1，總致病性評分為PS1+PP1，為致病性變異；M3錯義突變評為PVS1，數據庫中未發現該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，總致病性評分為PVS1+PM2+PP1，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M2、M3突變位點在人、猩猩、小鼠、野豬中高度保守（圖7B）。
表3
TULP1基因變異對其蛋白功能影響的不同分析軟件預測結果
家系3先證者（Ⅱ-1）M4、M5錯義突變分別位于第9、2外顯子。M4錯義突變第1 943位核苷酸T突變為C，導致第648位氨基酸由亮氨酸變為脯氨酸；M5錯義突變第380位核苷酸由C突變為T，導致第127位氨基酸由脯氨酸變為亮氨酸。M4、M5錯義突變在千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫東亞人種中突變頻率為0，為新發現突變位點（表4）。根據ACMG指南，M4、M5錯義突變評為PS2，數據庫中未發現該變異評為PM2，符合家系共分離評為PP1，突變總致病性評分均為PS2+PM2+PP1，為致病性變異。氨基酸保守性分析發現，M4、M5突變位點在人、猩猩、小鼠、野牛中高度保守（圖7C）。
表4
GUCY2D基因變異對其蛋白功能影響的不同分析軟件預測結果
3 討論
LCA是一種極易導致兒童失明的視網膜疾病[9]，患兒多于出生時或6月齡內即出現視力低下、無固視、眼球震顫、指壓眼征、眼球內陷等。指壓眼征可引起眶周脂肪萎縮并眼窩凹陷。眼底表現可完全正常，也可表現為黃斑“牛眼樣”外觀、后極部灰白色斑點改變等，部分患者直至病變晚期仍可保持正常眼底外觀。ERG呈熄滅型或明、暗適應振幅重度下降，具有診斷意義。LCA臨床表現復雜，癥狀及體征特異性不強，其他綜合征或非綜合征眼病也可有相似表現，臨床上容易誤診為全色盲、不完全色盲、先天性靜止性夜盲、白化病和視神經發育不全等[10]。2016年Minegishi等[11]等發現導致LCA的新突變基因CCT2，其也是涉及光感受器連接纖毛轉運過程的基因。LCA具備臨床表型多樣性及遺傳異質性特點，主要表現為不同的等位基因或基因突變可引起相似的臨床表現[12]；但部分相同基因突變，發生在不同家系或不同位點時可有不同的臨床表現[13]。
PRPH2基因導致的LCA分型為LCA18型（OMIM：608133）[14]。PRPH2基因導致LCA的發病機制目前尚不明確，既往多認為PRPH2基因主要導致視網膜色素變性（RP）[15]。Becirovic等[16]研究發現，PRPH2基因中的點突變與影響桿狀和錐狀光感受器的嚴重視網膜退行性疾病有關，其電生理檢測明、暗適應振幅均呈顯著性下降，與本研究PRPH2基因突變導致的家系1電生理檢查結果一致。
TULP1是非綜合征型視網膜纖毛疾病相關基因，由542個氨基酸（相對分子質量61×103）構成，主要在視網膜光感受器細胞表達，內節表達最豐富，對于視紫紅質在光感受器內外節之間的轉運具有重要作用。TULP1基因變異可導致LCA15型（MIM：613843）和RP14型（MIM：600132）[12]。LCA15型具有LCA的一般特點，疾病嚴重程度較輕，但發病年齡早，表型嚴重于RP。Patel等[17]報道，TULP1基因錯義突變c.1256G＞A （p.Arg419Gln）可引起視網膜營養不良。本研究家系2先證者c.1256G＞A錯義突變引起的蛋白質變化p.R419Q，與Patel等[17]報道的蛋白質變化不同，導致的疾病也不同。相同位點的同種突變類型導致的疾病不同，我們考慮家系2為TULP1基因新突變位點（c.1A＞C）與已知突變位點（c.1256G＞A）的結合，從而引起蛋白結構功能發生變化。家系中先證者姐姐（Ⅱ-1）攜帶等位基因1突變c.1256G＞A（p.R419Q），眼部表型正常，其原因可能為2個突變共同構成復合雜合性突變是本家系的致病原因。該家系成員TULP1基因2個位點同時變異才表現出臨床癥狀。
GUCY2D基因編碼鳥苷酸環化酶，由1 103個氨基酸（相對分子質量120×103）構成，以跨膜蛋白的形式于光感受器細胞外節存在，其環磷酸鳥苷（cGMP）由三磷酸鳥苷催化轉變，cGMP門控離子通道得以開放，Ca2+、Na+細胞內流，光照射后恢復暗態。GUCY2D基因突變可導致LCA1型（MIM：204000）。其發病特點為視力嚴重損害，眼底通常無明顯病變，畏光明顯[18]。本研究中家系3先證者及其妹妹均為GUCY2D基因第9外顯子c.1943T＞C（p.L648P）和第2外顯子c.380C＞T（p.P127L）發生復合雜合錯義突變，眼底多為正常，但視功能損害嚴重，伴眼球震顫且為全色盲。
本研究從LCA的臨床表現和遺傳變異水平闡明了3個不同家系患者的致病原因，報道了導致LCA的新發變異，進一步擴充了LCA的突變位點，擴大了LCA基因突變頻譜，使該病的分子病理機制得到了進一步理解，為LCA精確診斷、遺傳咨詢和產前診斷以及可能的基因治療提供了理論依據。同時也說明二代測序技術對此類疾病具有重要的輔助診斷意義。LCA具備臨床表型多樣性及遺傳異質性的特點，本研究的有限病例并不能涵蓋本病的一般情況，且患者多為幼兒，很多其他系統的病變尚未顯現，可能某些患者在未來會出現綜合征表現，還需加強隨訪和評估。
