引用本文： 邢東軍, 李志清, 于榮國, 王林妮, 胡立影, 楊旸, 李嫦, 李筱榮. Leber先天性黑矇患者致病基因與臨床表型分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 663-667. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211116-00643 復制
Leber先天性黑矇（LCA）是臨床罕見且嚴重損害視力的遺傳性視網膜疾病，患兒出生時或出生后不久即可發病[1]。臨床特征包括眼球震顫、畏光、指壓眼征；視網膜表型多樣，個體差異較大。視網膜電圖波幅平緩甚至消失是其典型表現。目前已發現與LCA相關的致病基因29個[2]，其中GUCY2D占國人LCA致病基因的首位（10%～16%），其次為CRB1（7%～11%）[3-4]。LCA1型由GUCY2D基因突變所致，患者眼底無明顯異常[5]；而LCA8型由CRB1基因突變所致，因該基因表達于光感受器細胞頂端質膜，可導致患者黃斑區萎縮、視網膜小動脈狹窄、Coats樣改變以及“錢幣樣”、椒鹽狀或骨細胞樣視網膜色素沉著[6]。本研究采用新一代目標區域捕獲測序技術對2個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，明確其致病基因變異，同時分析其與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會批準（批文號：2018KY-13）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有受檢者和未成年患者監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年至2020年于天津醫科大學眼科醫院眼底病科與神經眼科檢查確診的LCA患者2例及其家系成員6名納入本研究。2例患者來自2個無血緣關系家系（圖1），均為先證者。
圖1
LCA家系圖。1A、1B分別示家系1、2。LCA：Leber先天性黒矇；↗：先證者；○：正常女性；患者均經基因檢測檢出相關致病基因的致病性變異。排除梅毒感染及既往有特殊藥物使用病史者。患者均行視力、裂隙燈顯微鏡、超廣角眼底照相、眼底自身熒光（AF）、B型超聲、閃光視覺誘發電位（F-VEP）、頭顱核磁共振成像（MRI）檢查；家系成員經裂隙燈顯微鏡檢查排除眼底病變。
采集受檢者外周靜脈血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司的全血液基因組DNA提取試劑盒，按照操作規程提取全基因組DNA。應用北京邁基諾基因科技股份有限公司的遺傳性視網膜疾病區域捕獲基因試劑盒對已知的381個致病基因外顯子及相鄰的內含子區域捕獲測序。測序數據經Bcl2Fastq軟件除去低質量及短序列數據后，與人類基因組（hg19）進行對比，提取單核苷酸多態性、刪除和插入變異、錯義突變。應用堿基突變耐受性分類（SIFT，http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.Edu/pph2/）、Mutation Taster（http://www.mutation-taster.org/）軟件預測錯義氨基酸突變對蛋白質功能的影響；應用GERP++預測氨基酸突變位點保守性；應用人類基因突變數據庫（HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）、ClinVar數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、歐裔及非裔美國正常人數據庫收錄信息進行對比。對候選致病突變進行Sanger測序及家系內共分離驗證。在外顯子缺失區域設計引物，實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）驗證基因片段缺失。對數據的分析解讀參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）相關指南。
2 結果
家系1先證者（F1-Ⅱ-3），男，3歲。自幼雙眼視物不見伴指壓眼征。雙眼眼球震顫，眼窩凹陷。雙眼視力疑似光感（欠配合）；眼前節檢查未見明顯異常。眼底視盤邊界清楚，視網膜血管走行正常，黃斑中心凹未見異常（圖2A，2B）。F-VEP檢查，雙眼最大正向波隱含期大致正常，振幅大幅下降（圖2C，2D）。頭顱MRI檢查，雙側頂葉區片狀強信號，考慮髓鞘發育延遲；顱腦MRI增強未見腦膜異常強化影。就診期間多次至兒科及神經內科就診，排除顱內病變導致視力損害。先證者父母及姐姐眼部表型未見異常。擬診LCA。
圖2
家系1先證者（F1-Ⅱ-3）彩色眼底像和F-VEP檢查結果。患兒男，3歲，臨床擬診LCA。2A、2B分別示右眼、左眼彩色眼底像，雙眼眼底基本正常；2C、2D分別示右眼、左眼F-VEP檢查結果，最大正向波P2隱含期大致正常，振幅重度下降。F-VEP：閃光視覺誘發電位；LCA：Leber先天性黑矇
家系2先證者（F2-Ⅱ-1），男，27歲。主訴自幼視物不見。雙眼視力無光感，眼壓及眼前節檢查正常。雙眼玻璃體輕度混濁；視盤蠟黃，視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區視網膜脈絡膜萎縮呈“金箔樣”改變（圖3A，3B）。眼底AF檢查，雙眼視網膜大片弱AF（圖3C，3D）。先證者父母因居住農村未行特殊檢查，自述身體健康，無其他不適。擬診LCA。
圖3
家系2先證者（F2-Ⅱ-1）彩色眼底像和AF像。患者男，27歲，臨床擬診LCA。3A、3B分別示右眼、左眼彩色眼底像，雙眼視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區萎縮呈“金箔樣”改變；3C、3D分別示右眼、左眼眼底AF像，雙眼后極部大片弱AF。AF：自身熒光；LCA：Leber先天性黑矇
基因檢測結果顯示，F1-Ⅱ-3攜帶GUCY2D基因c.835G>A（p.D279N）（M1）雜合錯義突變，同時其等位基因9～19號外顯子缺失（M2）（圖4A）。M1錯義突變導致第279號氨基酸由天冬氨酸變異為天冬酰胺。該變異在人群中發生率極低，相關研究證實與LCA相關[7]，HGMD已收錄。生物信息學重復缺失分析及qPCR驗證，F1-Ⅱ-3 GUCY2D基因存在M2（圖4B），導致該區域氨基酸翻譯缺失，依據ACMG指南，該變異為疑似致病突變。GUCY2D基因M2突變未見數據庫收錄及文獻報道。家系共分離驗證結果顯示，其父親（F1-Ⅱ-1）、母親（F1-Ⅱ-2）分別攜帶M2雜合突變和M1雜合突變。結合臨床表現、F-VEP及基因檢測結果，最終診斷為LCA1型。
圖4
家系1先證者（F1-Ⅱ-3）GUCY2D基因外顯子9～19雜合缺失突變生物信息學分析及qPCR驗證。4A示生物信息學分析，先證者GUCY2D基因外顯子9～19雜合缺失（紅色線圈內）。4B示在缺失片段范圍內分別設計兩處引物，引物1擴展范圍chr17-7917900-7918100，引物2擴展范圍chr17-7918170-7918370，選擇SYBR Green I/HRM Dye（465-510）進行qPCR實驗，證實其雜合片段缺失變異來源于其父親（F1-Ⅰ-1）。圖中“對照”為正常人標準樣本。qPCR：實時聚合酶鏈反應
F2-Ⅱ-1攜帶CRB1基因6號外顯子2個復合雜合突變，分別為c.1576C>T（R526X）（M3）和c.1522T>C（C508R）（M4）。M3為無義突變，編碼區第1 576號核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導致氨基酸改變p.R526X，翻譯提前終止，該變異可能導致基因功能喪失。ClinVar數據庫對該位點的致病性分析為致病性，在正常人群數據庫中頻率為0.000 3，為低頻變異，已有文獻報道該位點與LCA相關[8]。根據ACMG指南，PVS1+PS1+PM2.5，該變異初步判定為致病變異。M4為錯義突變，編碼區第1 522號核苷酸由胸腺嘧啶變異為胞嘧啶，導致第508號氨基酸由半胱氨酸變異為精氨酸。生物信息學蛋白預測軟件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、GERP++、REVEL預測其分別為良性、有害、有害、保守（保守性值＞2)、有害。ClinVar數據庫中無該位點致病性分析。該變異在正常人群數據庫中未見收錄。依據ACMG指南，M4突變滿足證據PM2+PM3+PP3，初步判定為疑似致病突變。家系共分離驗證結果顯示，其父親（F2-Ⅰ-1）、母親（F2-Ⅰ-2）分別攜帶M3、M4雜合突變。結合臨床表型及基因檢查結果，最終診斷為LCA8型。
3 討論
本研究2個LCA家系的先證者具有相似的發病特征和不同的眼底表現，F1-Ⅱ-3眼底基本正常，而F2-Ⅱ-1眼底視盤蒼白，視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區“金箔樣”萎縮。基因檢測結果提示，家系1致病基因為GUCY2D，該基因突變導致LCA1型；家系2致病基因為CRB1，該基因突變導致LCA8型。既往研究結果顯示，GUCY2D基因突變所致LCA患者黃斑區存在大量視錐、視桿細胞，眼底“基本正常”，但這些光感受器細胞外節結構缺失[9]。本研究中F1-Ⅱ-3因年齡小且眼球震顫，未能行光相干斷層掃描及視網膜電圖檢查。既往研究發現，GUCY2D基因主要存在于視錐、視桿細胞內，編碼視網膜鳥苷酸環化酶（GC）1，能將三磷酸鳥苷催化為環磷酸鳥苷（cGMP）的蛋白酶，是光感受器細胞光-電生理信號轉換的關節部分[10]。GC1能夠恢復細胞質cGMP的水平，使細胞恢復到黑暗時的狀態，其基因突變導致光感受器細胞發生快速變性。迄今已報道100多個GUCY2D基因致病突變位點，該蛋白包括前導序列、細胞外結構域、跨膜結構域、近膜結構域、激酶同源結構域（KHD）、二聚化結構域（DD）、環化酶催化結構域（CCD）等7個功能區域[11]。KHD是GC家族中最保守的區域，是三磷酸腺苷結合位點，與酶的催化活性相關，該區域的功能完整對cGMP的合成至關重要。CCD區域是GC1的關鍵功能區域，可能是合成cGMP的催化單元的重要活性位點[12]。本研究發現的M2片段缺失突變正是于該區域發生，該突變可能導致KHD、DD、CCD結構缺失，影響其蛋白結構功能，進而造成GC1功能障礙。CRB1基因位于1q31.1，包含12個外顯子編碼1 406個氨基酸，其蛋白質結構包括胞外的19個上皮生長因子樣結構域和3個球狀層粘連蛋白A結構域，以及胞內的一個短的尾部結構[13]。CRB1基因控制細胞內的信息傳遞和細胞極性以及維持上皮細胞的粘附連接，在光感受器細胞發育和功能維持中發揮關鍵作用[14-15]。目前，CRB1基因已報道超過300個致病突變，包含錯義突變、剪切突變和無義突變，其中錯義突變最為常見約占60%[16]。M3和M4突變均位于粘連蛋白A結構域內，這些結構域高度保守，可作為蛋白質相互作用模塊，這些突變可能影響了蛋白質的相互作用[17]。CUCY2D基因突變和CRB1基因突變所致疾病具有遺傳異質性和臨床異質性。CUCY2D基因突變的部分患者表現為LCA，也有部分患者表現為遺傳性錐桿細胞營養不良6型、先天性靜止性夜盲2型、中心暈輪狀脈絡膜營養不良；CRB1基因突變可導致LCA8型，亦可導致視網膜色素變性12型、早發型錐桿細胞營養不良、常染色體顯性靜脈旁脈絡膜視網膜萎縮、常染色體隱性視網膜色素變性、錐桿細胞營養不良、常染色體隱性黃斑劈裂，故對該類疾病患者進行基因檢測明確診斷具有重要意義。
本研究通過生物信息學分析以及Sanger測序驗證及家系內共分離驗證，發現在GUCY2D基因上存在M1和M2突變，CRB1基因上存在M3和M4突變，其中M2和M4為首次報道。M1為雜合錯義突變，在dbSNP、千人基因組計劃數據庫、ExAC_ALL、ESP6500si等數據庫中為低頻變異；保守性分析顯示突變位點在多物種間高度保守（GERP++保守性值：4.53）；SIFT、Polyphen2、Mutation Taster生物信息學預測軟件分析具有致病性。M2為雜合外顯子缺失突變，導致基因表達局部缺失，進而導致蛋白功能障礙。M3為雜合無義突變，使得蛋白翻譯提前終止，進而影響其功能。M4為雜合錯義突變，突變位點在多物種間高度保守（GERP++保守性值：3.53），Mutation Taster、Polyphen2分析為具有致病性。
LCA是一種具有高度遺傳和臨床異質性的單基因遺傳病。目前，對該病的基因型和臨床表型間的相關信息了解仍然很少，對于每個基因突變熱點和突變體蛋白的致病機制尚不十分清楚。在所有致病基因中，GUCY2D基因是國人發生LCA的最多見致病基因[18]。該基因編碼跨膜蛋白GC，突變后導致光感受器細胞變性，造成視網膜光電轉換功能障礙，視力嚴重損害，同時GUCY2D基因突變導致LCA1型。CRB1是第2位LCA致病基因，該基因編碼的蛋白質表達在哺乳動物的光感受器內節，在胚胎上皮發育中起決定和維持頂端極性和粘附連接作用，與眼極性正常發育相關，CRB1基因突變導致LCA8型[6, 14-15]。LCA表型復雜，臨床差異較大，對不同基因型導致的臨床表型分析，有助于增強對該病的認識。對國人常見LCA致病基因CUCY2D和CRB1變異位點的鑒定，不僅可以闡明其在LCA1型和LCA8型發病中的作用，也有助于臨床診斷和尋找致病原因。
本研究通過對不同表型LCA家系的分析及基因檢測，擴大了CUCY2D和CRB1基因突變譜的認知，進一步闡明了分子機制，有利于提高該病的精準診斷效率。
Leber先天性黑矇（LCA）是臨床罕見且嚴重損害視力的遺傳性視網膜疾病，患兒出生時或出生后不久即可發病[1]。臨床特征包括眼球震顫、畏光、指壓眼征；視網膜表型多樣，個體差異較大。視網膜電圖波幅平緩甚至消失是其典型表現。目前已發現與LCA相關的致病基因29個[2]，其中GUCY2D占國人LCA致病基因的首位（10%～16%），其次為CRB1（7%～11%）[3-4]。LCA1型由GUCY2D基因突變所致，患者眼底無明顯異常[5]；而LCA8型由CRB1基因突變所致，因該基因表達于光感受器細胞頂端質膜，可導致患者黃斑區萎縮、視網膜小動脈狹窄、Coats樣改變以及“錢幣樣”、椒鹽狀或骨細胞樣視網膜色素沉著[6]。本研究采用新一代目標區域捕獲測序技術對2個LCA家系患者進行了致病基因突變檢測，明確其致病基因變異，同時分析其與臨床表型的關系。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經天津醫科大學眼科醫院倫理委員會批準（批文號：2018KY-13）；遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有受檢者和未成年患者監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2019年至2020年于天津醫科大學眼科醫院眼底病科與神經眼科檢查確診的LCA患者2例及其家系成員6名納入本研究。2例患者來自2個無血緣關系家系（圖1），均為先證者。
圖1
LCA家系圖。1A、1B分別示家系1、2。LCA：Leber先天性黒矇；↗：先證者；○：正常女性；患者均經基因檢測檢出相關致病基因的致病性變異。排除梅毒感染及既往有特殊藥物使用病史者。患者均行視力、裂隙燈顯微鏡、超廣角眼底照相、眼底自身熒光（AF）、B型超聲、閃光視覺誘發電位（F-VEP）、頭顱核磁共振成像（MRI）檢查；家系成員經裂隙燈顯微鏡檢查排除眼底病變。
采集受檢者外周靜脈血3～5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司的全血液基因組DNA提取試劑盒，按照操作規程提取全基因組DNA。應用北京邁基諾基因科技股份有限公司的遺傳性視網膜疾病區域捕獲基因試劑盒對已知的381個致病基因外顯子及相鄰的內含子區域捕獲測序。測序數據經Bcl2Fastq軟件除去低質量及短序列數據后，與人類基因組（hg19）進行對比，提取單核苷酸多態性、刪除和插入變異、錯義突變。應用堿基突變耐受性分類（SIFT，http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.Edu/pph2/）、Mutation Taster（http://www.mutation-taster.org/）軟件預測錯義氨基酸突變對蛋白質功能的影響；應用GERP++預測氨基酸突變位點保守性；應用人類基因突變數據庫（HGMD，http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）、ClinVar數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、歐裔及非裔美國正常人數據庫收錄信息進行對比。對候選致病突變進行Sanger測序及家系內共分離驗證。在外顯子缺失區域設計引物，實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）驗證基因片段缺失。對數據的分析解讀參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）相關指南。
2 結果
家系1先證者（F1-Ⅱ-3），男，3歲。自幼雙眼視物不見伴指壓眼征。雙眼眼球震顫，眼窩凹陷。雙眼視力疑似光感（欠配合）；眼前節檢查未見明顯異常。眼底視盤邊界清楚，視網膜血管走行正常，黃斑中心凹未見異常（圖2A，2B）。F-VEP檢查，雙眼最大正向波隱含期大致正常，振幅大幅下降（圖2C，2D）。頭顱MRI檢查，雙側頂葉區片狀強信號，考慮髓鞘發育延遲；顱腦MRI增強未見腦膜異常強化影。就診期間多次至兒科及神經內科就診，排除顱內病變導致視力損害。先證者父母及姐姐眼部表型未見異常。擬診LCA。
圖2
家系1先證者（F1-Ⅱ-3）彩色眼底像和F-VEP檢查結果。患兒男，3歲，臨床擬診LCA。2A、2B分別示右眼、左眼彩色眼底像，雙眼眼底基本正常；2C、2D分別示右眼、左眼F-VEP檢查結果，最大正向波P2隱含期大致正常，振幅重度下降。F-VEP：閃光視覺誘發電位；LCA：Leber先天性黑矇
家系2先證者（F2-Ⅱ-1），男，27歲。主訴自幼視物不見。雙眼視力無光感，眼壓及眼前節檢查正常。雙眼玻璃體輕度混濁；視盤蠟黃，視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區視網膜脈絡膜萎縮呈“金箔樣”改變（圖3A，3B）。眼底AF檢查，雙眼視網膜大片弱AF（圖3C，3D）。先證者父母因居住農村未行特殊檢查，自述身體健康，無其他不適。擬診LCA。
圖3
家系2先證者（F2-Ⅱ-1）彩色眼底像和AF像。患者男，27歲，臨床擬診LCA。3A、3B分別示右眼、左眼彩色眼底像，雙眼視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區萎縮呈“金箔樣”改變；3C、3D分別示右眼、左眼眼底AF像，雙眼后極部大片弱AF。AF：自身熒光；LCA：Leber先天性黑矇
基因檢測結果顯示，F1-Ⅱ-3攜帶GUCY2D基因c.835G>A（p.D279N）（M1）雜合錯義突變，同時其等位基因9～19號外顯子缺失（M2）（圖4A）。M1錯義突變導致第279號氨基酸由天冬氨酸變異為天冬酰胺。該變異在人群中發生率極低，相關研究證實與LCA相關[7]，HGMD已收錄。生物信息學重復缺失分析及qPCR驗證，F1-Ⅱ-3 GUCY2D基因存在M2（圖4B），導致該區域氨基酸翻譯缺失，依據ACMG指南，該變異為疑似致病突變。GUCY2D基因M2突變未見數據庫收錄及文獻報道。家系共分離驗證結果顯示，其父親（F1-Ⅱ-1）、母親（F1-Ⅱ-2）分別攜帶M2雜合突變和M1雜合突變。結合臨床表現、F-VEP及基因檢測結果，最終診斷為LCA1型。
圖4
家系1先證者（F1-Ⅱ-3）GUCY2D基因外顯子9～19雜合缺失突變生物信息學分析及qPCR驗證。4A示生物信息學分析，先證者GUCY2D基因外顯子9～19雜合缺失（紅色線圈內）。4B示在缺失片段范圍內分別設計兩處引物，引物1擴展范圍chr17-7917900-7918100，引物2擴展范圍chr17-7918170-7918370，選擇SYBR Green I/HRM Dye（465-510）進行qPCR實驗，證實其雜合片段缺失變異來源于其父親（F1-Ⅰ-1）。圖中“對照”為正常人標準樣本。qPCR：實時聚合酶鏈反應
F2-Ⅱ-1攜帶CRB1基因6號外顯子2個復合雜合突變，分別為c.1576C>T（R526X）（M3）和c.1522T>C（C508R）（M4）。M3為無義突變，編碼區第1 576號核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，導致氨基酸改變p.R526X，翻譯提前終止，該變異可能導致基因功能喪失。ClinVar數據庫對該位點的致病性分析為致病性，在正常人群數據庫中頻率為0.000 3，為低頻變異，已有文獻報道該位點與LCA相關[8]。根據ACMG指南，PVS1+PS1+PM2.5，該變異初步判定為致病變異。M4為錯義突變，編碼區第1 522號核苷酸由胸腺嘧啶變異為胞嘧啶，導致第508號氨基酸由半胱氨酸變異為精氨酸。生物信息學蛋白預測軟件SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、GERP++、REVEL預測其分別為良性、有害、有害、保守（保守性值＞2)、有害。ClinVar數據庫中無該位點致病性分析。該變異在正常人群數據庫中未見收錄。依據ACMG指南，M4突變滿足證據PM2+PM3+PP3，初步判定為疑似致病突變。家系共分離驗證結果顯示，其父親（F2-Ⅰ-1）、母親（F2-Ⅰ-2）分別攜帶M3、M4雜合突變。結合臨床表型及基因檢查結果，最終診斷為LCA8型。
3 討論
本研究2個LCA家系的先證者具有相似的發病特征和不同的眼底表現，F1-Ⅱ-3眼底基本正常，而F2-Ⅱ-1眼底視盤蒼白，視網膜骨細胞樣色素沉著，黃斑區“金箔樣”萎縮。基因檢測結果提示，家系1致病基因為GUCY2D，該基因突變導致LCA1型；家系2致病基因為CRB1，該基因突變導致LCA8型。既往研究結果顯示，GUCY2D基因突變所致LCA患者黃斑區存在大量視錐、視桿細胞，眼底“基本正常”，但這些光感受器細胞外節結構缺失[9]。本研究中F1-Ⅱ-3因年齡小且眼球震顫，未能行光相干斷層掃描及視網膜電圖檢查。既往研究發現，GUCY2D基因主要存在于視錐、視桿細胞內，編碼視網膜鳥苷酸環化酶（GC）1，能將三磷酸鳥苷催化為環磷酸鳥苷（cGMP）的蛋白酶，是光感受器細胞光-電生理信號轉換的關節部分[10]。GC1能夠恢復細胞質cGMP的水平，使細胞恢復到黑暗時的狀態，其基因突變導致光感受器細胞發生快速變性。迄今已報道100多個GUCY2D基因致病突變位點，該蛋白包括前導序列、細胞外結構域、跨膜結構域、近膜結構域、激酶同源結構域（KHD）、二聚化結構域（DD）、環化酶催化結構域（CCD）等7個功能區域[11]。KHD是GC家族中最保守的區域，是三磷酸腺苷結合位點，與酶的催化活性相關，該區域的功能完整對cGMP的合成至關重要。CCD區域是GC1的關鍵功能區域，可能是合成cGMP的催化單元的重要活性位點[12]。本研究發現的M2片段缺失突變正是于該區域發生，該突變可能導致KHD、DD、CCD結構缺失，影響其蛋白結構功能，進而造成GC1功能障礙。CRB1基因位于1q31.1，包含12個外顯子編碼1 406個氨基酸，其蛋白質結構包括胞外的19個上皮生長因子樣結構域和3個球狀層粘連蛋白A結構域，以及胞內的一個短的尾部結構[13]。CRB1基因控制細胞內的信息傳遞和細胞極性以及維持上皮細胞的粘附連接，在光感受器細胞發育和功能維持中發揮關鍵作用[14-15]。目前，CRB1基因已報道超過300個致病突變，包含錯義突變、剪切突變和無義突變，其中錯義突變最為常見約占60%[16]。M3和M4突變均位于粘連蛋白A結構域內，這些結構域高度保守，可作為蛋白質相互作用模塊，這些突變可能影響了蛋白質的相互作用[17]。CUCY2D基因突變和CRB1基因突變所致疾病具有遺傳異質性和臨床異質性。CUCY2D基因突變的部分患者表現為LCA，也有部分患者表現為遺傳性錐桿細胞營養不良6型、先天性靜止性夜盲2型、中心暈輪狀脈絡膜營養不良；CRB1基因突變可導致LCA8型，亦可導致視網膜色素變性12型、早發型錐桿細胞營養不良、常染色體顯性靜脈旁脈絡膜視網膜萎縮、常染色體隱性視網膜色素變性、錐桿細胞營養不良、常染色體隱性黃斑劈裂，故對該類疾病患者進行基因檢測明確診斷具有重要意義。
本研究通過生物信息學分析以及Sanger測序驗證及家系內共分離驗證，發現在GUCY2D基因上存在M1和M2突變，CRB1基因上存在M3和M4突變，其中M2和M4為首次報道。M1為雜合錯義突變，在dbSNP、千人基因組計劃數據庫、ExAC_ALL、ESP6500si等數據庫中為低頻變異；保守性分析顯示突變位點在多物種間高度保守（GERP++保守性值：4.53）；SIFT、Polyphen2、Mutation Taster生物信息學預測軟件分析具有致病性。M2為雜合外顯子缺失突變，導致基因表達局部缺失，進而導致蛋白功能障礙。M3為雜合無義突變，使得蛋白翻譯提前終止，進而影響其功能。M4為雜合錯義突變，突變位點在多物種間高度保守（GERP++保守性值：3.53），Mutation Taster、Polyphen2分析為具有致病性。
LCA是一種具有高度遺傳和臨床異質性的單基因遺傳病。目前，對該病的基因型和臨床表型間的相關信息了解仍然很少，對于每個基因突變熱點和突變體蛋白的致病機制尚不十分清楚。在所有致病基因中，GUCY2D基因是國人發生LCA的最多見致病基因[18]。該基因編碼跨膜蛋白GC，突變后導致光感受器細胞變性，造成視網膜光電轉換功能障礙，視力嚴重損害，同時GUCY2D基因突變導致LCA1型。CRB1是第2位LCA致病基因，該基因編碼的蛋白質表達在哺乳動物的光感受器內節，在胚胎上皮發育中起決定和維持頂端極性和粘附連接作用，與眼極性正常發育相關，CRB1基因突變導致LCA8型[6, 14-15]。LCA表型復雜，臨床差異較大，對不同基因型導致的臨床表型分析，有助于增強對該病的認識。對國人常見LCA致病基因CUCY2D和CRB1變異位點的鑒定，不僅可以闡明其在LCA1型和LCA8型發病中的作用，也有助于臨床診斷和尋找致病原因。
本研究通過對不同表型LCA家系的分析及基因檢測，擴大了CUCY2D和CRB1基因突變譜的認知，進一步闡明了分子機制，有利于提高該病的精準診斷效率。
