引用本文： 姚舜, 楊名珠, 李亞, 雷博. Leber遺傳性視神經病變患者永生化皮膚成纖維細胞線粒體功能探討. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 675-680. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220627-00385 復制
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一類常見的嚴重遺傳性視網膜疾病[1]。線粒體DNA突變是LHON的分子基礎，約20個線粒體基因變異可引起LHON；在所有相關已知突變位點中，11778G＞A、14484T＞C、3460G＞A等3個位點最常見，約占所有LHON病例的95%，也被稱為原發性突變[2-4]。多數突變基因編碼的蛋白為線粒體呼吸鏈中復合物Ⅰ的亞基，如11778G＞A/MT-ND4、14484T＞C/MT-ND6、3460G＞A/MT-ND1。這些變異蛋白可能引起線粒體呼吸鏈功能異常、能量合成障礙，成為LHON發病的驅動因素。目前，對于該疾病的研究一直缺乏理想模型[5]。患者來源的成纖維細胞有著與患者相同的致病突變和遺傳背景，以及容易獲取和培養等特點，近年來被用于不同遺傳病和LHON的研究[6-8]。但LHON患者來源的皮膚成纖維細胞能否很好反映線粒體功能鮮見報道。本研究構建m.G11778A患者的永生化皮膚成纖維細胞，并對其線粒體功能進行檢測，通過分析明確與LHON相關線粒體基因突變位點，初步探索該細胞作為LHON細胞模型的可行性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
本研究方案經河南省立眼科醫院倫理委員會審核［批準號：HNEECKY-2019（12）］；所有受試者均獲知情并簽署書面知情同意書。
通過河南省立眼科醫院遺傳門診招募2例LHON患者和2名健康志愿者。受試者均行最佳矯正視力、色覺、視野、超生生物顯微鏡、眼壓、掃頻源光相干斷層掃描檢查。采用二代測序技術行基因檢測，2例LHON患者均攜帶m.G11778A突變，且眼科檢查各項結果均異常。其中1例患者雙眼裸眼視力均為0.15；鼻側視野缺損；視盤邊界不清；鼻側、顳側視神經纖維層萎縮。另1例患者雙眼裸眼視力為數指/10 cm；無法行視野檢查；視盤邊界不清；鼻側、顳側視神經纖維層萎縮嚴重[9]。2名健康志愿者未發現LHON致病變異；雙眼裸眼視力均在1.0以上；視神經纖維層厚度正常。
永生化皮膚成纖維細胞構建。獲取2例患者和2名志愿者的2 mm2上臂皮膚組織，75%酒精浸泡2 min后剪碎，反復清洗棄上清，置于含完全培養基的培養皿中，37 ℃孵育30～60 min。將小塊組織夾入培養瓶中，倒置于5% CO2培養箱中孵育2 h，加入2 ml成纖維細胞完全培養基，置培養箱中培養，每隔3天換液。待組織塊周圍生長的細胞融合成片，去除組織塊，胰蛋白酶消化細胞，重新鋪瓶培養。使用SV40過表達慢病毒（EF1α-SV40-IRES-puromycin）感染細胞。待長滿后使用濃度為3 μg/ml的嘌呤霉素處理。2 d后去除死細胞，更換新鮮培養基，繼續培養24 h。重復使用3 μg/ ml的嘌呤霉素處理，直至細胞耐受。挑選單克隆細胞并擴大培養，進行后續實驗。共構建4株永生化皮膚成纖維細胞，分別為2名健康志愿者細胞（NC-1、NC-2細胞），2例攜帶m.G11778A突變的LHON患者細胞（LHON-1、LHON-2細胞）。透射電子顯微鏡觀察LHON、NC細胞線粒體結構。
活性氧（ROS）水平檢測。將細胞接種于6孔板中培養過夜。1∶1 000比例無血清Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）稀釋2＇，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，S0033S，上海碧云天生物技術有限公司），配置成工作液。將DCFH-DA工作液加入6孔板中，37 ℃培養箱中培養40 min。無血清培養基洗滌3次，熒光顯微鏡捕捉熒光圖像。
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態（NAD+）、還原態（NADH）水平檢測。將細胞接種于6孔板中培養過夜。收集細胞，細胞線粒體分離試劑盒（C3601，上海碧云天生物技術有限公司）提純線粒體。使用NAD+/NADH檢測試劑盒（S0175，上海碧云天生物技術有限公司）檢測線粒體中NAD+、NADH水平。步驟如下：收集1×107個左右的細胞（約2個10 cm細胞培養皿），使用線粒體分離試劑盒提取線粒體。將提純的線粒體置于冰上，使用60 μl NAD+/NADH提取液裂解10 min。隨后，4 ℃條件下，12 000×g離心10 min。期間制備濃度為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μmol/L的NADH標準品，以及乙醇脫氫酶工作液。取20 μl樣本上清于96孔板中，加入90 μl乙醇脫氫酶工作液，37 ℃孵育10 min。孵育完成后繼續向孔中加入10 μl顯色液，37 ℃避光孵育60 min。使用酶標儀測量450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。此時檢測的為樣本中NAD+和NADH總量。取30 μl裂解上清于新的離心管中，置于60 ℃孵育30 min。隨后取20 μl樣本加至96孔板中，并按上述步驟檢測450 nm處A值。此時檢測的為樣本中NADH含量。另取10 μl裂解上清，使用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。最后，計算每個樣本中每μg蛋白中NAD+和NADH含量。每個樣本設置3個重復孔。
三磷酸腺苷（ATP）水平檢測。使用增強型ATP檢測試劑盒（S0027，上海碧云天生物技術有限公司）檢測細胞中ATP水平。步驟如下：將細胞接種于6孔板中培養過夜。向孔中加入200 μl裂解液，冰上靜置10 min。4 ℃條件下，以12 000×g離心5 min。離心期間制備濃度分別為0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L的ATP標準品，以及ATP檢測液。取50 μl裂解上清于96孔板中，向孔中加入100 μl ATP檢測液，室溫靜置5 min。使用化學發光儀測定化學發光強度，根據標準曲線計算每個樣本中ATP含量。同時，取10 μl裂解上清，通過BCA法測定蛋白濃度，計算每個樣本中每μg蛋白中ATP含量。每個樣本設置3個重復。
Seahorse線粒體壓力檢測。采用XFe96分析儀（美國Agilent公司）測量細胞耗氧率（OCR）。將細胞接種于培養板（102601-100，美國Agilent公司）中，8 000個/孔，孵育過夜。將細胞培養基替換為含2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸和10 mmol/L葡萄糖的XF培養基（103334-100，美國Agilent公司），37 ℃無CO2培養箱中孵育1 h。將線粒體壓力測試試劑盒（103015-100，美國Agilent公司）中4個檢測藥物溶解為以下濃度并在檢測時注入探針板：寡霉素（Oligomycin，15 μmol/L）、線粒體解耦聯劑（FCCP，20 μmol/L）、魚藤酮（Rotenone，5 μmol/L）聯合抗霉素（Antimycin A，5 μmol/L）的混合物。將探針板置于培養板上面，上機檢測。加入Oligomycin抑制ATP合酶后，減少的OCR值即為ATP相關耗氧量；加入FCCP后，計算細胞最大耗氧量。
細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測細胞活力。將細胞接種于96孔板中培養過夜。不含血清的DMEM培養基按1∶100稀釋CCK-8，制備成工作液。將其加入細胞孔中，100 μl/孔，孵育3 h。0、12、24、48 h時測定細胞活力。加入氧化磷酸化抑制劑羰基氰化物間氯苯腙（CCCP，40 μmol/L）處理細胞6 h，分別在處理前和處理后測定細胞活力。酶標儀測定波長450 nm處A值。以0 h處值為原點，計算各時間點的相對值并繪制生長曲線。
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（
）表示。LHON和NC細胞中ROS、NAD+、NADH和ATP水平，以及基礎呼吸值、最大呼吸值、ATP偶聯呼吸值、細胞存活率之間的比較行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，與NC細胞比較，LHON細胞線粒體嵴數量明顯減少，結構不完整（圖1）。
圖1
NC、LHON細胞中線粒體微結構透射電子顯微鏡像及兩種細胞中線粒體嵴數量比較。1A示NC細胞透射電子顯微鏡像，可見線粒體形態正常，內有線粒體嵴均勻分布且結構清晰（黑箭） 標尺：0.1 μm。1B示LHON細胞透射電子顯微鏡像，可見線粒體形態正常，但線粒體嵴發生異常，數量明顯減少，形態不完整 標尺：0.1 μm。1C示兩種細胞中線粒體嵴數量比較（n=3），**P≤0.01。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變
ROS水平檢測結果顯示，LHON細胞中ROS水平較NC細胞明顯增加（圖2）。
圖2
永生化皮膚成纖維細胞熒光顯微鏡像及兩種細胞相對熒光強度比較。2A、2B分別示NC、LHON細胞中ROS水平，可見LHON細胞中ROS水平（綠色熒光）高于NC細胞 ×40。2C示兩種細胞相對熒光強度比較（n=3），*P≤0.05。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變；ROS：活性氧
與NC細胞比較，LHON細胞中線粒體NAD+水平顯著下降（F=70.63），NADH水平提高（F=12.42），NAD+/NADH比值顯著下降（F=17.37），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3A～3C）；ATP水平明顯降低，差異有統計學意義（F=40.36，P＜0.05）（圖3D）；細胞基礎耗氧量（F=115.80）、ATP相關耗氧量（F=190.00）、細胞最大耗氧量（F=414.20）均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3E，3F）。
圖3
NC-1、NC-2、LHON-1、LHON-2永生化皮膚成纖維細胞線粒體功能檢測。3A～3C分別示NAD+、NADH水平以及NAD+/NADH比值比較（n=3）；3D示ATP水平比較（n=3）；3E示OCR變化曲線（n=6）；3F示基礎耗氧量、ATP相關耗氧量和最大耗氧量比較。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變；NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態；NADH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態；ATP：三磷酸腺苷；OCR：細胞耗氧率；Oligomycin：寡霉素；FCCP：線粒體解耦聯劑；Rotenone＋Antimycin A：魚藤酮＋抗霉素A
無刺激條件下，不同來源細胞活力相似（圖4A）。加入氧化磷酸化抑制劑CCCP（40 μmol/L）時，與NC細胞相比，LHON細胞活力受到更顯著的抑制（圖4B）。在刺激因子存在的情況下，LHON來源的永生化成纖維細胞更易受到損傷。
圖4
CCK-8測得的細胞活力比較。4A示無刺激條件下細胞生長曲線（n=4）；4B示加入40 μmol/L CCCP刺激前后細胞的存活率比較（n=5）。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。CCK-8：細胞計數試劑盒8；CCCP：氧化磷酸化抑制劑羰基氰化物間氯苯腙；NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變
3 討論
LHON為一類常見眼科遺傳病，主要發病原因為線粒體基因突變導致線粒體功能異常，最終引起視網膜神經節細胞凋亡[10-11]。基因編輯技術可用于構建多種基因變異模型，盡管近年在線粒體基因編輯領域取得可觀的進展[12]，但由于線粒體DNA的特殊性，編輯過程仍有諸多局限，如線粒體鋅指核酸酶技術的有效性和特異性較差，DddA胞嘧啶堿基編輯技術的線粒體轉運性不夠，成簇規律間隔的短回文重復序列-Cpf1技術的活性低及靶點選擇有限等[13-15]。因此，目前仍不易得到模型小鼠和細胞，LHON的研究也一直缺乏十分理想的模型。為此，國內外學者提出了多種替代模型，其中應用最廣泛的是成纖維細胞、淋巴母細胞、雜合細胞和誘導多能干細胞[16-23]。患者皮膚來源的成纖維細胞具有與患者相同的遺傳背景以及容易獲取培養等優勢，近年受到遺傳病研究的重視。由于LHON為線粒體功能異常引起，因此成纖維細胞能否表現出相應的線粒體損傷水平是該細胞可否作為模型細胞的關鍵。但相關研究鮮見詳細報道。
本研究獲取攜帶m.G11778A突變的LHON患者皮膚成纖維細胞，通過SV40病毒感染構建永生化皮膚成纖維細胞系，并對該細胞系的線粒體功能進行了檢測。結果顯示，線粒體形態方面，LHON患者來源的永生化皮膚成纖維細胞（LHON-1、LHON-2細胞）擁有更少的線粒體嵴，與Uittenbogaard等[8]研究結果相似。這提示LHON患者來源的皮膚成纖維細胞線粒體超微結構異常。另外，作為呼吸鏈復合物Ⅰ的亞基，重組人組氨酸脫氫酶鐵硫蛋白-4缺失同樣可引起線粒體嵴形態異常[24]。這表明基因突變引起的復合物Ⅰ功能失調可能會導致線粒體嵴結構的不穩定，但其中的機制尚不清楚，可能和呼吸鏈復合物變異引起的長期質子濃度異常有關。
m.G11778A突變導致呼吸鏈復合物Ⅰ功能異常，這種病變可導致3種分子變化，H+轉導障礙、ATP生成異常以及呼吸水平下降。通過測定NAD+、ATP水平及OCR可綜合評估細胞的呼吸功能，進而反應線粒體損傷水平。本研究同時檢測了LHON細胞（LHON-1、LHON-2細胞）的呼吸鏈功能，結果顯示LHON細胞線粒體中NAD+水平下降，NADH水平上調，ATP水平下調；seahorse線粒體壓力檢測結果也顯示LHON細胞的基礎、ATP相關和最大呼吸水平均明顯低于健康志愿者來源的細胞（NC-1、NC-2細胞）。這些分子水平變化和LHON病理過程一致。
線粒體除了產生細胞生命活動所需的ATP，還在產生ROS和核苷酸代謝等方面發揮著重要作用。LHON中復合體Ⅰ功能障礙使電子泄漏產生過量ROS。線粒體DNA突變引起的氧化應激被認為是視網膜神經節細胞損傷的誘因[25]。我們通過實驗發現LHON細胞中ROS水平顯著高于NC細胞，也進一步說明了線粒體功能障礙。
線粒體除了和能量合成相關，其損傷后還可影響細胞存活和凋亡。本研究檢測了永生化皮膚成纖維細胞的存活能力。結果顯示，LHON-1、LHON-2細胞更易受到刺激因子影響，而在視神經細胞中，這種現象可能同樣存在。這種對刺激因子的強敏感性也可能與感冒、病毒感染、炎癥反應和負面情緒等不良因素加速疾病進展有關，或許是加重LHON癥狀的影響因素。
開發LHON疾病模型對探究其致病機制、發現治療靶點意義重大。近年來基因編輯技術在線粒體基因編輯領域取得了可觀的進展，但依然存在位點選擇限制、脫靶和編輯效率低等問題。盡管如此，仍不可否認基因編輯技術的可行性，這些技術仍然是未來構建基因變異模型甚至扭轉突變基因的強大手段，只是還需要一段時間進行探索研究。用于LHON研究的替代模型多種多樣，它們既有優勢也存在缺點。成纖維細胞由于和神經細胞組織類型不同，因此在神經遺傳病中的應用，不能很好地反映神經細胞中分子變化，也不能很好地模擬軸突變性、神經細胞凋亡等過程。但本研究發現m.G11778A突變LHON患者的永生化皮膚成纖維細胞線粒體形態異常、呼吸能力下降、ATP合成抑制，且對不良刺激更為敏感，說明在線粒體功能和能量合成代謝方面的研究中，該細胞可作為一種替代細胞模型。
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一類常見的嚴重遺傳性視網膜疾病[1]。線粒體DNA突變是LHON的分子基礎，約20個線粒體基因變異可引起LHON；在所有相關已知突變位點中，11778G＞A、14484T＞C、3460G＞A等3個位點最常見，約占所有LHON病例的95%，也被稱為原發性突變[2-4]。多數突變基因編碼的蛋白為線粒體呼吸鏈中復合物Ⅰ的亞基，如11778G＞A/MT-ND4、14484T＞C/MT-ND6、3460G＞A/MT-ND1。這些變異蛋白可能引起線粒體呼吸鏈功能異常、能量合成障礙，成為LHON發病的驅動因素。目前，對于該疾病的研究一直缺乏理想模型[5]。患者來源的成纖維細胞有著與患者相同的致病突變和遺傳背景，以及容易獲取和培養等特點，近年來被用于不同遺傳病和LHON的研究[6-8]。但LHON患者來源的皮膚成纖維細胞能否很好反映線粒體功能鮮見報道。本研究構建m.G11778A患者的永生化皮膚成纖維細胞，并對其線粒體功能進行檢測，通過分析明確與LHON相關線粒體基因突變位點，初步探索該細胞作為LHON細胞模型的可行性。現將結果報道如下。
1 材料和方法
本研究方案經河南省立眼科醫院倫理委員會審核［批準號：HNEECKY-2019（12）］；所有受試者均獲知情并簽署書面知情同意書。
通過河南省立眼科醫院遺傳門診招募2例LHON患者和2名健康志愿者。受試者均行最佳矯正視力、色覺、視野、超生生物顯微鏡、眼壓、掃頻源光相干斷層掃描檢查。采用二代測序技術行基因檢測，2例LHON患者均攜帶m.G11778A突變，且眼科檢查各項結果均異常。其中1例患者雙眼裸眼視力均為0.15；鼻側視野缺損；視盤邊界不清；鼻側、顳側視神經纖維層萎縮。另1例患者雙眼裸眼視力為數指/10 cm；無法行視野檢查；視盤邊界不清；鼻側、顳側視神經纖維層萎縮嚴重[9]。2名健康志愿者未發現LHON致病變異；雙眼裸眼視力均在1.0以上；視神經纖維層厚度正常。
永生化皮膚成纖維細胞構建。獲取2例患者和2名志愿者的2 mm2上臂皮膚組織，75%酒精浸泡2 min后剪碎，反復清洗棄上清，置于含完全培養基的培養皿中，37 ℃孵育30～60 min。將小塊組織夾入培養瓶中，倒置于5% CO2培養箱中孵育2 h，加入2 ml成纖維細胞完全培養基，置培養箱中培養，每隔3天換液。待組織塊周圍生長的細胞融合成片，去除組織塊，胰蛋白酶消化細胞，重新鋪瓶培養。使用SV40過表達慢病毒（EF1α-SV40-IRES-puromycin）感染細胞。待長滿后使用濃度為3 μg/ml的嘌呤霉素處理。2 d后去除死細胞，更換新鮮培養基，繼續培養24 h。重復使用3 μg/ ml的嘌呤霉素處理，直至細胞耐受。挑選單克隆細胞并擴大培養，進行后續實驗。共構建4株永生化皮膚成纖維細胞，分別為2名健康志愿者細胞（NC-1、NC-2細胞），2例攜帶m.G11778A突變的LHON患者細胞（LHON-1、LHON-2細胞）。透射電子顯微鏡觀察LHON、NC細胞線粒體結構。
活性氧（ROS）水平檢測。將細胞接種于6孔板中培養過夜。1∶1 000比例無血清Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）稀釋2＇，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，S0033S，上海碧云天生物技術有限公司），配置成工作液。將DCFH-DA工作液加入6孔板中，37 ℃培養箱中培養40 min。無血清培養基洗滌3次，熒光顯微鏡捕捉熒光圖像。
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態（NAD+）、還原態（NADH）水平檢測。將細胞接種于6孔板中培養過夜。收集細胞，細胞線粒體分離試劑盒（C3601，上海碧云天生物技術有限公司）提純線粒體。使用NAD+/NADH檢測試劑盒（S0175，上海碧云天生物技術有限公司）檢測線粒體中NAD+、NADH水平。步驟如下：收集1×107個左右的細胞（約2個10 cm細胞培養皿），使用線粒體分離試劑盒提取線粒體。將提純的線粒體置于冰上，使用60 μl NAD+/NADH提取液裂解10 min。隨后，4 ℃條件下，12 000×g離心10 min。期間制備濃度為0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μmol/L的NADH標準品，以及乙醇脫氫酶工作液。取20 μl樣本上清于96孔板中，加入90 μl乙醇脫氫酶工作液，37 ℃孵育10 min。孵育完成后繼續向孔中加入10 μl顯色液，37 ℃避光孵育60 min。使用酶標儀測量450 nm處吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。此時檢測的為樣本中NAD+和NADH總量。取30 μl裂解上清于新的離心管中，置于60 ℃孵育30 min。隨后取20 μl樣本加至96孔板中，并按上述步驟檢測450 nm處A值。此時檢測的為樣本中NADH含量。另取10 μl裂解上清，使用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。最后，計算每個樣本中每μg蛋白中NAD+和NADH含量。每個樣本設置3個重復孔。
三磷酸腺苷（ATP）水平檢測。使用增強型ATP檢測試劑盒（S0027，上海碧云天生物技術有限公司）檢測細胞中ATP水平。步驟如下：將細胞接種于6孔板中培養過夜。向孔中加入200 μl裂解液，冰上靜置10 min。4 ℃條件下，以12 000×g離心5 min。離心期間制備濃度分別為0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L的ATP標準品，以及ATP檢測液。取50 μl裂解上清于96孔板中，向孔中加入100 μl ATP檢測液，室溫靜置5 min。使用化學發光儀測定化學發光強度，根據標準曲線計算每個樣本中ATP含量。同時，取10 μl裂解上清，通過BCA法測定蛋白濃度，計算每個樣本中每μg蛋白中ATP含量。每個樣本設置3個重復。
Seahorse線粒體壓力檢測。采用XFe96分析儀（美國Agilent公司）測量細胞耗氧率（OCR）。將細胞接種于培養板（102601-100，美國Agilent公司）中，8 000個/孔，孵育過夜。將細胞培養基替換為含2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸和10 mmol/L葡萄糖的XF培養基（103334-100，美國Agilent公司），37 ℃無CO2培養箱中孵育1 h。將線粒體壓力測試試劑盒（103015-100，美國Agilent公司）中4個檢測藥物溶解為以下濃度并在檢測時注入探針板：寡霉素（Oligomycin，15 μmol/L）、線粒體解耦聯劑（FCCP，20 μmol/L）、魚藤酮（Rotenone，5 μmol/L）聯合抗霉素（Antimycin A，5 μmol/L）的混合物。將探針板置于培養板上面，上機檢測。加入Oligomycin抑制ATP合酶后，減少的OCR值即為ATP相關耗氧量；加入FCCP后，計算細胞最大耗氧量。
細胞計數試劑盒8（CCK-8）檢測細胞活力。將細胞接種于96孔板中培養過夜。不含血清的DMEM培養基按1∶100稀釋CCK-8，制備成工作液。將其加入細胞孔中，100 μl/孔，孵育3 h。0、12、24、48 h時測定細胞活力。加入氧化磷酸化抑制劑羰基氰化物間氯苯腙（CCCP，40 μmol/L）處理細胞6 h，分別在處理前和處理后測定細胞活力。酶標儀測定波長450 nm處A值。以0 h處值為原點，計算各時間點的相對值并繪制生長曲線。
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（）表示。LHON和NC細胞中ROS、NAD+、NADH和ATP水平，以及基礎呼吸值、最大呼吸值、ATP偶聯呼吸值、細胞存活率之間的比較行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，與NC細胞比較，LHON細胞線粒體嵴數量明顯減少，結構不完整（圖1）。
圖1
NC、LHON細胞中線粒體微結構透射電子顯微鏡像及兩種細胞中線粒體嵴數量比較。1A示NC細胞透射電子顯微鏡像，可見線粒體形態正常，內有線粒體嵴均勻分布且結構清晰（黑箭） 標尺：0.1 μm。1B示LHON細胞透射電子顯微鏡像，可見線粒體形態正常，但線粒體嵴發生異常，數量明顯減少，形態不完整 標尺：0.1 μm。1C示兩種細胞中線粒體嵴數量比較（n=3），**P≤0.01。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變
ROS水平檢測結果顯示，LHON細胞中ROS水平較NC細胞明顯增加（圖2）。
圖2
永生化皮膚成纖維細胞熒光顯微鏡像及兩種細胞相對熒光強度比較。2A、2B分別示NC、LHON細胞中ROS水平，可見LHON細胞中ROS水平（綠色熒光）高于NC細胞 ×40。2C示兩種細胞相對熒光強度比較（n=3），*P≤0.05。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變；ROS：活性氧
與NC細胞比較，LHON細胞中線粒體NAD+水平顯著下降（F=70.63），NADH水平提高（F=12.42），NAD+/NADH比值顯著下降（F=17.37），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖3A～3C）；ATP水平明顯降低，差異有統計學意義（F=40.36，P＜0.05）（圖3D）；細胞基礎耗氧量（F=115.80）、ATP相關耗氧量（F=190.00）、細胞最大耗氧量（F=414.20）均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖3E，3F）。
圖3
NC-1、NC-2、LHON-1、LHON-2永生化皮膚成纖維細胞線粒體功能檢測。3A～3C分別示NAD+、NADH水平以及NAD+/NADH比值比較（n=3）；3D示ATP水平比較（n=3）；3E示OCR變化曲線（n=6）；3F示基礎耗氧量、ATP相關耗氧量和最大耗氧量比較。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變；NAD+：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態；NADH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態；ATP：三磷酸腺苷；OCR：細胞耗氧率；Oligomycin：寡霉素；FCCP：線粒體解耦聯劑；Rotenone＋Antimycin A：魚藤酮＋抗霉素A
無刺激條件下，不同來源細胞活力相似（圖4A）。加入氧化磷酸化抑制劑CCCP（40 μmol/L）時，與NC細胞相比，LHON細胞活力受到更顯著的抑制（圖4B）。在刺激因子存在的情況下，LHON來源的永生化成纖維細胞更易受到損傷。
圖4
CCK-8測得的細胞活力比較。4A示無刺激條件下細胞生長曲線（n=4）；4B示加入40 μmol/L CCCP刺激前后細胞的存活率比較（n=5）。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。CCK-8：細胞計數試劑盒8；CCCP：氧化磷酸化抑制劑羰基氰化物間氯苯腙；NC：對照；LHON：Leber遺傳性視神經病變
3 討論
LHON為一類常見眼科遺傳病，主要發病原因為線粒體基因突變導致線粒體功能異常，最終引起視網膜神經節細胞凋亡[10-11]。基因編輯技術可用于構建多種基因變異模型，盡管近年在線粒體基因編輯領域取得可觀的進展[12]，但由于線粒體DNA的特殊性，編輯過程仍有諸多局限，如線粒體鋅指核酸酶技術的有效性和特異性較差，DddA胞嘧啶堿基編輯技術的線粒體轉運性不夠，成簇規律間隔的短回文重復序列-Cpf1技術的活性低及靶點選擇有限等[13-15]。因此，目前仍不易得到模型小鼠和細胞，LHON的研究也一直缺乏十分理想的模型。為此，國內外學者提出了多種替代模型，其中應用最廣泛的是成纖維細胞、淋巴母細胞、雜合細胞和誘導多能干細胞[16-23]。患者皮膚來源的成纖維細胞具有與患者相同的遺傳背景以及容易獲取培養等優勢，近年受到遺傳病研究的重視。由于LHON為線粒體功能異常引起，因此成纖維細胞能否表現出相應的線粒體損傷水平是該細胞可否作為模型細胞的關鍵。但相關研究鮮見詳細報道。
本研究獲取攜帶m.G11778A突變的LHON患者皮膚成纖維細胞，通過SV40病毒感染構建永生化皮膚成纖維細胞系，并對該細胞系的線粒體功能進行了檢測。結果顯示，線粒體形態方面，LHON患者來源的永生化皮膚成纖維細胞（LHON-1、LHON-2細胞）擁有更少的線粒體嵴，與Uittenbogaard等[8]研究結果相似。這提示LHON患者來源的皮膚成纖維細胞線粒體超微結構異常。另外，作為呼吸鏈復合物Ⅰ的亞基，重組人組氨酸脫氫酶鐵硫蛋白-4缺失同樣可引起線粒體嵴形態異常[24]。這表明基因突變引起的復合物Ⅰ功能失調可能會導致線粒體嵴結構的不穩定，但其中的機制尚不清楚，可能和呼吸鏈復合物變異引起的長期質子濃度異常有關。
m.G11778A突變導致呼吸鏈復合物Ⅰ功能異常，這種病變可導致3種分子變化，H+轉導障礙、ATP生成異常以及呼吸水平下降。通過測定NAD+、ATP水平及OCR可綜合評估細胞的呼吸功能，進而反應線粒體損傷水平。本研究同時檢測了LHON細胞（LHON-1、LHON-2細胞）的呼吸鏈功能，結果顯示LHON細胞線粒體中NAD+水平下降，NADH水平上調，ATP水平下調；seahorse線粒體壓力檢測結果也顯示LHON細胞的基礎、ATP相關和最大呼吸水平均明顯低于健康志愿者來源的細胞（NC-1、NC-2細胞）。這些分子水平變化和LHON病理過程一致。
線粒體除了產生細胞生命活動所需的ATP，還在產生ROS和核苷酸代謝等方面發揮著重要作用。LHON中復合體Ⅰ功能障礙使電子泄漏產生過量ROS。線粒體DNA突變引起的氧化應激被認為是視網膜神經節細胞損傷的誘因[25]。我們通過實驗發現LHON細胞中ROS水平顯著高于NC細胞，也進一步說明了線粒體功能障礙。
線粒體除了和能量合成相關，其損傷后還可影響細胞存活和凋亡。本研究檢測了永生化皮膚成纖維細胞的存活能力。結果顯示，LHON-1、LHON-2細胞更易受到刺激因子影響，而在視神經細胞中，這種現象可能同樣存在。這種對刺激因子的強敏感性也可能與感冒、病毒感染、炎癥反應和負面情緒等不良因素加速疾病進展有關，或許是加重LHON癥狀的影響因素。
開發LHON疾病模型對探究其致病機制、發現治療靶點意義重大。近年來基因編輯技術在線粒體基因編輯領域取得了可觀的進展，但依然存在位點選擇限制、脫靶和編輯效率低等問題。盡管如此，仍不可否認基因編輯技術的可行性，這些技術仍然是未來構建基因變異模型甚至扭轉突變基因的強大手段，只是還需要一段時間進行探索研究。用于LHON研究的替代模型多種多樣，它們既有優勢也存在缺點。成纖維細胞由于和神經細胞組織類型不同，因此在神經遺傳病中的應用，不能很好地反映神經細胞中分子變化，也不能很好地模擬軸突變性、神經細胞凋亡等過程。但本研究發現m.G11778A突變LHON患者的永生化皮膚成纖維細胞線粒體形態異常、呼吸能力下降、ATP合成抑制，且對不良刺激更為敏感，說明在線粒體功能和能量合成代謝方面的研究中，該細胞可作為一種替代細胞模型。
