葡萄膜黑色素瘤（UM）是眼內侵襲性強且致命的腫瘤。由于UM及其微環境的復雜性和異質性，導致缺乏早期預防和治療轉移的策略。單細胞測序技術通過在單個細胞層面進行基因組學、轉錄組學、表觀遺傳學的分析，為破譯腫瘤內異質性和微環境的復雜性提供了關鍵的視角。通過生物信息分析，并結合人工智能算法，有助于尋找預后相關的分子指標和治療靶點，為指導臨床治療方案的選擇提供依據。但單細胞測序技術也存在一定的局限性，如對樣本要求高、測序花費昂貴和耗時長等。相信隨著科學技術的完善和分析方法的更新，這些缺點可被逐步解決，未來終將攻克這一罕見腫瘤，實現UM患者長期生存的目標。
引用本文： 趙漢卿, 羅婧婷, 李洋, 魏文斌. 單細胞轉錄組測序在葡萄膜黑色素瘤中應用的研究進展. 中華眼底病雜志, 2022, 38(3): 248-252. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220130-00063 復制
葡萄膜黑色素瘤（UM）是成年人眼內最常見的原發性惡性腫瘤，主要來源于脈絡膜黑素細胞（90%），部分來自睫狀體的黑素細胞（6%）或虹膜的黑素細胞（4%）[1]。UM是一種罕見的腫瘤，存在顯著的種族差異和地區差異，發病率約0.3%～8.0%，其中亞洲的發病率顯著低于歐美[2]。由于缺乏精準的分子靶點，UM的治療方式以手術和敷貼放射治療為主。免疫治療和靶向治療的療效常不理想，呈低反應率甚至無反應率[3]。UM的侵襲性極強，約50%的患者在治療后發生轉移[4]。然而對于這種轉移尚無有效的預防和治療方案。單細胞測序技術的發展為突破這一困境帶來了希望。其通過從單個細胞中獲取轉錄組信息，挖掘同一腫瘤內癌細胞基因表達的差異性，揭示腫瘤微環境（TME）的細胞組成，有利于獲取罕見腫瘤的生物學信息。一些基于單細胞測序的研究已取得顯著成果。結合生物信息學和人工智能算法，有助于構建UM發生、發展、復發、轉移和預后相關的分子指標體系，尋找治療靶點，為指導臨床治療方案的選擇提供依據。現就單細胞RNA測序（scRNA-seq）在UM中的應用研究進展作一綜述。
1 單細胞測序的技術特點
單細胞測序是指在單個細胞水平上對轉錄組或基因組進行擴增并測序，以檢測單細胞在基因組、轉錄組、表觀組學和蛋白組學等生物信息的技術。首先從新鮮組織分離單細胞，進行細胞溶解、獲取核酸和擴增，最后進行測序和分析[5]。這種技術能夠探索復雜組織中單個細胞的不同生物學特性，了解細胞亞群對不同微環境的反應，有助于研究細胞分化、增生和腫瘤發生等過程。
傳統測序分析在探究UM的腫瘤特征、分子機制和微環境方面已取得了巨大的突破。最具代表性的是2017年Robertson等[6]的研究，他們對80個原發性UM患者的腫瘤組織進行全面多平臺分析，采用一系列測序技術（包括DNA-seq和RNA-seq），獲取了UM的DNA、mRNA、非編碼RNA表達數據，DNA甲基化、突變和拷貝數的數據綜合分析，最終鑒定并表征了4種不同預后的亞型，即A期：3號染色體二倍體、8q拷貝數正常；B期：3號染色體二倍體，8q拷貝數擴增；C期：單體3、8q拷貝數擴增；D期：單體3、8q拷貝數多倍擴增。從A期到D期患者預后愈差，轉移風險愈高。這80個UM組織的測序信息在癌癥基因組圖譜計劃（TCGA）中公開（https://portal.gdc.cancer.gov/），供研究者下載使用。隨后大量的研究基于TCGA數據庫，探索了UM中的生物學特點，如運用生物信息學分析腫瘤的純度、免疫浸潤特點和免疫相關基因等[7-8]。傳統測序針對的是組織中的所有細胞，獲取全部信息，但只能反映所有細胞的平均變異水平，無法揭示單個細胞的遺傳信息。而且可能遺漏少數的細胞亞型。單細胞測序的出現為破譯這一難題帶來了曙光，能以最小的樣本量，展開高分辨率的分析。從單細胞的角度出發，探測細胞特異性、差異性和細胞間的協同運作方式，揭示每個細胞獨特的遺傳信息，并發現新的細胞類型。
目前大規模運用的單細胞測序平臺有Illumina、BD Rhapsody、10x Chromium、ICELL8 和C1?單細胞全自動制備系統。應用廣泛的單細胞測序技術包括單細胞基因組測序、scRNA-seq和表觀遺傳測序。scRNA-seq通過提取RNA，將捕獲的信使RNA反轉錄為cDNA，再進行全轉錄組的測序分析。其可以直觀地反應基因表達情況，解釋細胞種類、亞型、狀態和發展軌跡[9]。
2 scRNA-seq分析在UM中的應用
2.1 揭示腫瘤的異質性
腫瘤異質性是指腫瘤在生長過程中，經過多次分裂增生，子細胞在分子生物學或基因層面的改變，從而導致生長速度、侵襲能力、藥敏性和預后等各方面產生差異[10]。異質性不僅存在于腫瘤之間，也存在于一個腫瘤內。
2020年Durante等[11]的研究為scRNA-seq分析揭示UM生物學特征拉開了序幕。這項重要的研究分別對8個原發性UM腫瘤和3個轉移性UM腫瘤，共計59 915個細胞行scRNA-seq分析，揭露了腫瘤和免疫細胞復雜的生態環境。對細胞亞群進行分類發現，從原位腫瘤到轉移腫瘤，細胞類型的復雜度增加。其中基因表達譜（GEP）分型為2類的原發腫瘤和轉移腫瘤中含有豐富的浸潤性免疫細胞，通過剖析這類腫瘤尋找線索，可為開發免疫療法提供重要信息。然而這項研究并未深入分析原發性和轉移性UM之間的細胞類型和分子表達的差異。
2021年Pandiani等[12]對6個原發性UM腫瘤，共計7 890個單細胞行scRNA-seq并進行多尺度分析，揭示了腫瘤內異質性，深入研究了UM轉移過程中的調節機制，推斷出3種轉錄狀態的特征：（1）與細胞特異性有關，包括基因SOX9、SOX10和PAX3；（2）與免疫反應和炎癥有關，包括基因BCL3、CEBPB和AP1成員（JUNB、JUND、FOS和FOSB）；（3）與腫瘤的侵襲性有關。值得注意的是，被歸類為與預后良好患者的腫瘤中，也可檢測到預后不良的腫瘤細胞。
兩項研究均通過推斷染色體拷貝數變異，強調基因組異質性，發現了一些傳統測序未檢測到的基因組改變[12-13]。而Bertolotto[13]認為，染色體拷貝數變異識別的隱匿性改變可能由拓撲相關結構域或染色質納米結構域水平上的轉錄調控引起。
2.1.1 探索復雜的TME
腫瘤組織并非只有腫瘤細胞，還包括免疫和炎癥細胞、腫瘤相關的成纖維細胞、附近的微血管及細胞因子等統稱為TME[14]。浸潤到腫瘤內部的淋巴細胞介導了免疫相關的TME，表現出免疫抑制，有利于惡性腫瘤的發生、發展和免疫逃逸。腫瘤相關的成纖維細胞和血管內皮細胞、基質細胞構成腫瘤非免疫微環境。腫瘤細胞和TME兩者相輔相成，TME在腫瘤的發展、免疫反應和治療療效中發揮關鍵的作用。
與皮膚黑色素瘤相比，UM具有較低的腫瘤突變負擔和促瘤的免疫微環境[15]。眼睛作為免疫特權部位，抑制免疫，限制淋巴循環，最終導致CD8+ T細胞的耗竭。UM免疫微環境含有大量的M2型巨噬細胞和CD8+ T細胞[16]，其中CD8+ T細胞代表UM患者的不良預后[15]。在單體3腫瘤中，含有更多的M2型巨噬細胞浸潤[17]，染色體8q的擴增可能和巨噬細胞增多有關[18]，大量T細胞浸潤與BAP1基因缺失有關[19]。
Pandiani等[12]研究發現，原發性UM僅有少量的免疫浸潤，這符合主流的觀點。而Durante等[11]研究卻發現，有少數UM患者存在大量免疫浸潤，且GEP分型為2類腫瘤者免疫浸潤水平更高，與Robertson等[6]的研究結果一致。Durante等[11]還發現，淋巴細胞活化蛋白（LAG3）T細胞的抑制性免疫檢查點才是UM中的主要衰竭指標，而非程序性死亡受體1（PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CLAT-4）。這可部分解釋抗PD-1和抗CTLA-4治療失敗的事實。實際上，Triozzi等[18]在2014年就已發現UM的腫瘤浸潤淋巴細胞含有高表達的LAG3。現有大量臨床試驗評估LAG-3抑制劑在多種癌癥中的治療效果，其中有一項臨床研究（NCT02519322）應用relatlimab（LAG-3抑制劑）治療晚期UM[13]。
總之，兩項研究都在單細胞水平上探索，但側重方向不同。Durante等[11]的研究關注TME和免疫浸潤環境；而Pandiani等[12]的研究關注基因組和轉錄組層面腫瘤的異質性，以及不同轉錄狀態的特征。兩項研究互為驗證，相互補充，有助于全面地理解UM的轉移和免疫浸潤。
2.1.2 探索UM肝轉移瘤的異質性
2021年Lin等[20]利用scRNA-seq和拷貝數改變分析1例UM患者2個并發的肝轉移灶，發現肝轉移瘤之間存在顯著的異質性。其中一個轉移灶由梭形細胞和上皮樣細胞組成，另一個轉移灶只含上皮樣細胞。含有梭形細胞的轉移灶能觀察到染色體9p缺失和染色體8q擴增，這與2019年Shain等[21]提出的轉移性UM的特征一致。僅含上皮樣細胞的肝轉移灶中T細胞高表達LAG3基因，這種轉移灶之間差異性可能會指導不同的治療決策。
Pandiani等[12]的研究證明了HES6基因能夠增強腫瘤生長和侵襲能力，作為潛在的治療靶點。雖然Lin等[20]也證實HES6基因在兩個肝轉移灶中表達增加，含梭形細胞的肝轉移灶中HES6基因的表達較低，說明UM并非完全依賴HES6基因信號，還有其他信號可驅動腫瘤轉移。這項研究證實了UM肝轉移灶的復雜性，擴寬了UM單細胞層面的轉錄組圖譜，強調了準確評估腫瘤特點，及時為患者提供個性化治療決策的重要性。
2.2 揭示新的發病機制
2021年，Bakhoum等[22]通過整合單細胞水平上的信息，探索染色體不穩定性和表觀遺傳學與腫瘤進展和轉移的關系，揭示了UM進展的關鍵步驟，即由Polycomb抑制復合物1（PRC1）缺失驅動一系列分子的改變，從而將表觀遺傳學、組織學和轉錄特征聯系起來。Polycomb蛋白家族是一類通過表觀遺傳修飾調控靶基因的轉錄因子。主要功能是對轉錄調節的作用，通過抑制靶基因轉錄使靶基因沉默。此外，Polycomb蛋白家族構成高級染色質結構，因此它們的缺失可使基因組拓撲結構的錯構導致染色體不穩定。PRC1的缺失導致靶基因轉錄去抑制，使染色體分離錯誤，促進利于轉移的慢性炎癥信號。此外，PRC1的缺失使核增大并向上皮樣形態轉變，通常認為上皮樣細胞型UM比梭形細胞型UM的預后更差[23]。
這項研究反對獨立克隆起源的觀點，對UM進展的分子機制提出了新的觀點。隨著時間推移，最初預后良好的UM可能獲得惡性的表型。未來還需要探索PRC1缺失的下游通路，尋找治療的潛在靶點。
2.3 完善預后預測的工具
美國癌癥聯合委員會（AJCC）第八版[24]根據腫瘤的大小（直徑和厚度）、解剖范圍（睫狀體受累和鞏膜外延伸）對UM分類。隨著細胞遺傳學的發展，發現3號染色體的缺失和8號染色體的增加與預后差相關[25]。因此Dogrus?z等[26]和Bagger等[27]將染色體信息加入AJCC分期系統進一步完善預后的預測。2004年，Onken等[28]采用原發性UM轉錄組分析中的無監督聚類揭示了基于GEP的兩個分類，預后較好的1類和預后較差的2類。隨著二代測序技術的應用，補充了驅動基因層面的研究，鑒定了UM的初級驅動基因（GNAQ、GNA11）和次級驅動基因（BAP1、SF3B1、EIF1MX）。約90%的UM存在GNAQ、GNA11基因突變，激活腫瘤的發生。BAP1基因突變臨床預后最差，SF3B1次之，EIF1MX最佳[29]。
Pandiani等[12]對6個原發性UM腫瘤行scRNA-seq分析，針對1 000個最多變基因行主成分分析，將細胞和基因按照主成分（PC）分數排序，構建了基于PC值的預后預測模型。采用TCGA數據庫進行Kaplan-Meier驗證，PC值高的基因與總體存活率低相關。其中，組織相容性復合體Ⅰ類成分β2-微球蛋白和人類白細胞抗原（HLA）-A都是PC值高的基因，而在UM中HLA Ⅰ類或HLA Ⅱ類抗原的高表達預示預后差[30]。
Strub等[13]評價了4種預后模型對生存率的預測能力，包括單體3、基于基因表達和DNA 甲基化譜提取出的11個預后相關基因簽名[31]、GEP分型[28]、單細胞分析構建的PC1模型。通過繪制受試者工作特征曲線評價每種預后分型的靈敏度和特異性。它們的受試者工作特征曲線下面積分別是0.79、077、0.85、0.85，證實了基于PC值的簽名預測預后更加準確。
Liu等[32]使用GSE139839數據集（Durante的單細胞測序數據）探索與UM免疫環境相關的m6A調節因子和長鏈非編碼RNA，開發基于m6A的基因簽名有助于提高對患者的預后預測。
CD8+ T細胞被認為是UM不良預后的指標[33]。Sun等[34]探索了CD8+ T細胞在UM中預測預后和對免疫治療反應的作用。通過結合GSE139839數據集（Durante的單細胞測序數據），篩選出與CD8+ T細胞相關的免疫相關基因，采用多種機器學習的算法構建了CD8+ T細胞相關的基因簽名，包括3個與腫瘤或免疫反應相關基因IFNGR1、ANXA6和TANK。這種基因簽名可促進免疫監測，拯救耗盡的CD8+ T細胞，提高免疫檢查點抑制劑的治療療效。
綜上所述，在單細胞水平上，從RNA甲基化、免疫等不同角度挖掘預后的生物學特征，結合人工智能方法，可以輔助完善預后相關的分子指標體系。
2.4 scRNA-seq有助于尋找治療靶點
Gαq信號通路的激活是UM進展中常見的早期事件，主要特點是GNAQ或GNA11基因突變，還包括較罕見的基因CYSLTR2[35]。基因CYSLTR2編碼G蛋白偶聯受體半胱氨酸白三烯受體2（CysLT2R），該受體參與白三烯介導的信號傳導[36]。CYSLTR2基因突變導致內源性Gαq信號激活，從而刺激與GNAQ和GNA11中致癌突變相同的途徑[37]。
Nell等[38]用數字型聚合酶鏈反應結合公共數據庫分析發現，CYSLTR2基因參與UM的早期和晚期進展。其中，CYSLTR2p.L129Q突變可能是起始致癌事件。隨著腫瘤進展，CYSLTR2突變等位基因的表達豐度不斷增加，結果說明突變型CysLT2R可能是潛在的治療靶點。
Pandiani等[12]發現轉錄因子HES6在UM中具有驅動腫瘤的侵襲性和不良預后等重要作用；該研究運用雞胚絨毛尿囊膜試驗證實，HES6的缺失會在體外和體內抑制腫瘤增生、遷移和轉移播散。這提示，HES6及其靶基因可能作為治療的靶點。
3 不足與展望
單細胞技術存在一定的局限性，如對樣本要求高、測序花費昂貴和耗時長等。隨著科學技術的完善和分析方法的更新，這些缺點可被逐步解決。目前公開的僅有17個UM樣本的單細胞測序數據，樣本量較小，研究結果具有局限性，不適用于所有患者。此外，除了已經闡明的研究問題，還可對公開的單細胞數據挖掘，更加細致的研究腫瘤的起源、進展和免疫浸潤。最終，將研究結果回歸臨床，開發出有效的診斷、預后分級和治療腫瘤轉移的方法，才能最大地發揮單細胞測序的優勢。
UM是成人眼內最常見的惡性腫瘤，因其易轉移、對化學治療、免疫治療和靶向治療均不敏感的特點，使得轉移的早期診斷、治療和干預都十分困難。腫瘤的異質性增加了探索UM生物學特征的復雜性。對UM的研究面臨著許多挑戰，許多問題至今還在探索中，例如如何識別腫瘤轉移早期，如何有效治療腫瘤轉移且顯著延長患者的生存期等。單細胞測序技術的發展為研究者和患者帶來了希望，隨著技術的更新和不斷完善，未來終將攻克這一罕見腫瘤，實現UM患者長期生存的目標。
葡萄膜黑色素瘤（UM）是成年人眼內最常見的原發性惡性腫瘤，主要來源于脈絡膜黑素細胞（90%），部分來自睫狀體的黑素細胞（6%）或虹膜的黑素細胞（4%）[1]。UM是一種罕見的腫瘤，存在顯著的種族差異和地區差異，發病率約0.3%～8.0%，其中亞洲的發病率顯著低于歐美[2]。由于缺乏精準的分子靶點，UM的治療方式以手術和敷貼放射治療為主。免疫治療和靶向治療的療效常不理想，呈低反應率甚至無反應率[3]。UM的侵襲性極強，約50%的患者在治療后發生轉移[4]。然而對于這種轉移尚無有效的預防和治療方案。單細胞測序技術的發展為突破這一困境帶來了希望。其通過從單個細胞中獲取轉錄組信息，挖掘同一腫瘤內癌細胞基因表達的差異性，揭示腫瘤微環境（TME）的細胞組成，有利于獲取罕見腫瘤的生物學信息。一些基于單細胞測序的研究已取得顯著成果。結合生物信息學和人工智能算法，有助于構建UM發生、發展、復發、轉移和預后相關的分子指標體系，尋找治療靶點，為指導臨床治療方案的選擇提供依據。現就單細胞RNA測序（scRNA-seq）在UM中的應用研究進展作一綜述。
1 單細胞測序的技術特點
單細胞測序是指在單個細胞水平上對轉錄組或基因組進行擴增并測序，以檢測單細胞在基因組、轉錄組、表觀組學和蛋白組學等生物信息的技術。首先從新鮮組織分離單細胞，進行細胞溶解、獲取核酸和擴增，最后進行測序和分析[5]。這種技術能夠探索復雜組織中單個細胞的不同生物學特性，了解細胞亞群對不同微環境的反應，有助于研究細胞分化、增生和腫瘤發生等過程。
傳統測序分析在探究UM的腫瘤特征、分子機制和微環境方面已取得了巨大的突破。最具代表性的是2017年Robertson等[6]的研究，他們對80個原發性UM患者的腫瘤組織進行全面多平臺分析，采用一系列測序技術（包括DNA-seq和RNA-seq），獲取了UM的DNA、mRNA、非編碼RNA表達數據，DNA甲基化、突變和拷貝數的數據綜合分析，最終鑒定并表征了4種不同預后的亞型，即A期：3號染色體二倍體、8q拷貝數正常；B期：3號染色體二倍體，8q拷貝數擴增；C期：單體3、8q拷貝數擴增；D期：單體3、8q拷貝數多倍擴增。從A期到D期患者預后愈差，轉移風險愈高。這80個UM組織的測序信息在癌癥基因組圖譜計劃（TCGA）中公開（https://portal.gdc.cancer.gov/），供研究者下載使用。隨后大量的研究基于TCGA數據庫，探索了UM中的生物學特點，如運用生物信息學分析腫瘤的純度、免疫浸潤特點和免疫相關基因等[7-8]。傳統測序針對的是組織中的所有細胞，獲取全部信息，但只能反映所有細胞的平均變異水平，無法揭示單個細胞的遺傳信息。而且可能遺漏少數的細胞亞型。單細胞測序的出現為破譯這一難題帶來了曙光，能以最小的樣本量，展開高分辨率的分析。從單細胞的角度出發，探測細胞特異性、差異性和細胞間的協同運作方式，揭示每個細胞獨特的遺傳信息，并發現新的細胞類型。
目前大規模運用的單細胞測序平臺有Illumina、BD Rhapsody、10x Chromium、ICELL8 和C1?單細胞全自動制備系統。應用廣泛的單細胞測序技術包括單細胞基因組測序、scRNA-seq和表觀遺傳測序。scRNA-seq通過提取RNA，將捕獲的信使RNA反轉錄為cDNA，再進行全轉錄組的測序分析。其可以直觀地反應基因表達情況，解釋細胞種類、亞型、狀態和發展軌跡[9]。
2 scRNA-seq分析在UM中的應用
2.1 揭示腫瘤的異質性
腫瘤異質性是指腫瘤在生長過程中，經過多次分裂增生，子細胞在分子生物學或基因層面的改變，從而導致生長速度、侵襲能力、藥敏性和預后等各方面產生差異[10]。異質性不僅存在于腫瘤之間，也存在于一個腫瘤內。
2020年Durante等[11]的研究為scRNA-seq分析揭示UM生物學特征拉開了序幕。這項重要的研究分別對8個原發性UM腫瘤和3個轉移性UM腫瘤，共計59 915個細胞行scRNA-seq分析，揭露了腫瘤和免疫細胞復雜的生態環境。對細胞亞群進行分類發現，從原位腫瘤到轉移腫瘤，細胞類型的復雜度增加。其中基因表達譜（GEP）分型為2類的原發腫瘤和轉移腫瘤中含有豐富的浸潤性免疫細胞，通過剖析這類腫瘤尋找線索，可為開發免疫療法提供重要信息。然而這項研究并未深入分析原發性和轉移性UM之間的細胞類型和分子表達的差異。
2021年Pandiani等[12]對6個原發性UM腫瘤，共計7 890個單細胞行scRNA-seq并進行多尺度分析，揭示了腫瘤內異質性，深入研究了UM轉移過程中的調節機制，推斷出3種轉錄狀態的特征：（1）與細胞特異性有關，包括基因SOX9、SOX10和PAX3；（2）與免疫反應和炎癥有關，包括基因BCL3、CEBPB和AP1成員（JUNB、JUND、FOS和FOSB）；（3）與腫瘤的侵襲性有關。值得注意的是，被歸類為與預后良好患者的腫瘤中，也可檢測到預后不良的腫瘤細胞。
兩項研究均通過推斷染色體拷貝數變異，強調基因組異質性，發現了一些傳統測序未檢測到的基因組改變[12-13]。而Bertolotto[13]認為，染色體拷貝數變異識別的隱匿性改變可能由拓撲相關結構域或染色質納米結構域水平上的轉錄調控引起。
2.1.1 探索復雜的TME
腫瘤組織并非只有腫瘤細胞，還包括免疫和炎癥細胞、腫瘤相關的成纖維細胞、附近的微血管及細胞因子等統稱為TME[14]。浸潤到腫瘤內部的淋巴細胞介導了免疫相關的TME，表現出免疫抑制，有利于惡性腫瘤的發生、發展和免疫逃逸。腫瘤相關的成纖維細胞和血管內皮細胞、基質細胞構成腫瘤非免疫微環境。腫瘤細胞和TME兩者相輔相成，TME在腫瘤的發展、免疫反應和治療療效中發揮關鍵的作用。
與皮膚黑色素瘤相比，UM具有較低的腫瘤突變負擔和促瘤的免疫微環境[15]。眼睛作為免疫特權部位，抑制免疫，限制淋巴循環，最終導致CD8+ T細胞的耗竭。UM免疫微環境含有大量的M2型巨噬細胞和CD8+ T細胞[16]，其中CD8+ T細胞代表UM患者的不良預后[15]。在單體3腫瘤中，含有更多的M2型巨噬細胞浸潤[17]，染色體8q的擴增可能和巨噬細胞增多有關[18]，大量T細胞浸潤與BAP1基因缺失有關[19]。
Pandiani等[12]研究發現，原發性UM僅有少量的免疫浸潤，這符合主流的觀點。而Durante等[11]研究卻發現，有少數UM患者存在大量免疫浸潤，且GEP分型為2類腫瘤者免疫浸潤水平更高，與Robertson等[6]的研究結果一致。Durante等[11]還發現，淋巴細胞活化蛋白（LAG3）T細胞的抑制性免疫檢查點才是UM中的主要衰竭指標，而非程序性死亡受體1（PD-1）和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CLAT-4）。這可部分解釋抗PD-1和抗CTLA-4治療失敗的事實。實際上，Triozzi等[18]在2014年就已發現UM的腫瘤浸潤淋巴細胞含有高表達的LAG3。現有大量臨床試驗評估LAG-3抑制劑在多種癌癥中的治療效果，其中有一項臨床研究（NCT02519322）應用relatlimab（LAG-3抑制劑）治療晚期UM[13]。
總之，兩項研究都在單細胞水平上探索，但側重方向不同。Durante等[11]的研究關注TME和免疫浸潤環境；而Pandiani等[12]的研究關注基因組和轉錄組層面腫瘤的異質性，以及不同轉錄狀態的特征。兩項研究互為驗證，相互補充，有助于全面地理解UM的轉移和免疫浸潤。
2.1.2 探索UM肝轉移瘤的異質性
2021年Lin等[20]利用scRNA-seq和拷貝數改變分析1例UM患者2個并發的肝轉移灶，發現肝轉移瘤之間存在顯著的異質性。其中一個轉移灶由梭形細胞和上皮樣細胞組成，另一個轉移灶只含上皮樣細胞。含有梭形細胞的轉移灶能觀察到染色體9p缺失和染色體8q擴增，這與2019年Shain等[21]提出的轉移性UM的特征一致。僅含上皮樣細胞的肝轉移灶中T細胞高表達LAG3基因，這種轉移灶之間差異性可能會指導不同的治療決策。
Pandiani等[12]的研究證明了HES6基因能夠增強腫瘤生長和侵襲能力，作為潛在的治療靶點。雖然Lin等[20]也證實HES6基因在兩個肝轉移灶中表達增加，含梭形細胞的肝轉移灶中HES6基因的表達較低，說明UM并非完全依賴HES6基因信號，還有其他信號可驅動腫瘤轉移。這項研究證實了UM肝轉移灶的復雜性，擴寬了UM單細胞層面的轉錄組圖譜，強調了準確評估腫瘤特點，及時為患者提供個性化治療決策的重要性。
2.2 揭示新的發病機制
2021年，Bakhoum等[22]通過整合單細胞水平上的信息，探索染色體不穩定性和表觀遺傳學與腫瘤進展和轉移的關系，揭示了UM進展的關鍵步驟，即由Polycomb抑制復合物1（PRC1）缺失驅動一系列分子的改變，從而將表觀遺傳學、組織學和轉錄特征聯系起來。Polycomb蛋白家族是一類通過表觀遺傳修飾調控靶基因的轉錄因子。主要功能是對轉錄調節的作用，通過抑制靶基因轉錄使靶基因沉默。此外，Polycomb蛋白家族構成高級染色質結構，因此它們的缺失可使基因組拓撲結構的錯構導致染色體不穩定。PRC1的缺失導致靶基因轉錄去抑制，使染色體分離錯誤，促進利于轉移的慢性炎癥信號。此外，PRC1的缺失使核增大并向上皮樣形態轉變，通常認為上皮樣細胞型UM比梭形細胞型UM的預后更差[23]。
這項研究反對獨立克隆起源的觀點，對UM進展的分子機制提出了新的觀點。隨著時間推移，最初預后良好的UM可能獲得惡性的表型。未來還需要探索PRC1缺失的下游通路，尋找治療的潛在靶點。
2.3 完善預后預測的工具
美國癌癥聯合委員會（AJCC）第八版[24]根據腫瘤的大小（直徑和厚度）、解剖范圍（睫狀體受累和鞏膜外延伸）對UM分類。隨著細胞遺傳學的發展，發現3號染色體的缺失和8號染色體的增加與預后差相關[25]。因此Dogrus?z等[26]和Bagger等[27]將染色體信息加入AJCC分期系統進一步完善預后的預測。2004年，Onken等[28]采用原發性UM轉錄組分析中的無監督聚類揭示了基于GEP的兩個分類，預后較好的1類和預后較差的2類。隨著二代測序技術的應用，補充了驅動基因層面的研究，鑒定了UM的初級驅動基因（GNAQ、GNA11）和次級驅動基因（BAP1、SF3B1、EIF1MX）。約90%的UM存在GNAQ、GNA11基因突變，激活腫瘤的發生。BAP1基因突變臨床預后最差，SF3B1次之，EIF1MX最佳[29]。
Pandiani等[12]對6個原發性UM腫瘤行scRNA-seq分析，針對1 000個最多變基因行主成分分析，將細胞和基因按照主成分（PC）分數排序，構建了基于PC值的預后預測模型。采用TCGA數據庫進行Kaplan-Meier驗證，PC值高的基因與總體存活率低相關。其中，組織相容性復合體Ⅰ類成分β2-微球蛋白和人類白細胞抗原（HLA）-A都是PC值高的基因，而在UM中HLA Ⅰ類或HLA Ⅱ類抗原的高表達預示預后差[30]。
Strub等[13]評價了4種預后模型對生存率的預測能力，包括單體3、基于基因表達和DNA 甲基化譜提取出的11個預后相關基因簽名[31]、GEP分型[28]、單細胞分析構建的PC1模型。通過繪制受試者工作特征曲線評價每種預后分型的靈敏度和特異性。它們的受試者工作特征曲線下面積分別是0.79、077、0.85、0.85，證實了基于PC值的簽名預測預后更加準確。
Liu等[32]使用GSE139839數據集（Durante的單細胞測序數據）探索與UM免疫環境相關的m6A調節因子和長鏈非編碼RNA，開發基于m6A的基因簽名有助于提高對患者的預后預測。
CD8+ T細胞被認為是UM不良預后的指標[33]。Sun等[34]探索了CD8+ T細胞在UM中預測預后和對免疫治療反應的作用。通過結合GSE139839數據集（Durante的單細胞測序數據），篩選出與CD8+ T細胞相關的免疫相關基因，采用多種機器學習的算法構建了CD8+ T細胞相關的基因簽名，包括3個與腫瘤或免疫反應相關基因IFNGR1、ANXA6和TANK。這種基因簽名可促進免疫監測，拯救耗盡的CD8+ T細胞，提高免疫檢查點抑制劑的治療療效。
綜上所述，在單細胞水平上，從RNA甲基化、免疫等不同角度挖掘預后的生物學特征，結合人工智能方法，可以輔助完善預后相關的分子指標體系。
2.4 scRNA-seq有助于尋找治療靶點
Gαq信號通路的激活是UM進展中常見的早期事件，主要特點是GNAQ或GNA11基因突變，還包括較罕見的基因CYSLTR2[35]。基因CYSLTR2編碼G蛋白偶聯受體半胱氨酸白三烯受體2（CysLT2R），該受體參與白三烯介導的信號傳導[36]。CYSLTR2基因突變導致內源性Gαq信號激活，從而刺激與GNAQ和GNA11中致癌突變相同的途徑[37]。
Nell等[38]用數字型聚合酶鏈反應結合公共數據庫分析發現，CYSLTR2基因參與UM的早期和晚期進展。其中，CYSLTR2p.L129Q突變可能是起始致癌事件。隨著腫瘤進展，CYSLTR2突變等位基因的表達豐度不斷增加，結果說明突變型CysLT2R可能是潛在的治療靶點。
Pandiani等[12]發現轉錄因子HES6在UM中具有驅動腫瘤的侵襲性和不良預后等重要作用；該研究運用雞胚絨毛尿囊膜試驗證實，HES6的缺失會在體外和體內抑制腫瘤增生、遷移和轉移播散。這提示，HES6及其靶基因可能作為治療的靶點。
3 不足與展望
單細胞技術存在一定的局限性，如對樣本要求高、測序花費昂貴和耗時長等。隨著科學技術的完善和分析方法的更新，這些缺點可被逐步解決。目前公開的僅有17個UM樣本的單細胞測序數據，樣本量較小，研究結果具有局限性，不適用于所有患者。此外，除了已經闡明的研究問題，還可對公開的單細胞數據挖掘，更加細致的研究腫瘤的起源、進展和免疫浸潤。最終，將研究結果回歸臨床，開發出有效的診斷、預后分級和治療腫瘤轉移的方法，才能最大地發揮單細胞測序的優勢。
UM是成人眼內最常見的惡性腫瘤，因其易轉移、對化學治療、免疫治療和靶向治療均不敏感的特點，使得轉移的早期診斷、治療和干預都十分困難。腫瘤的異質性增加了探索UM生物學特征的復雜性。對UM的研究面臨著許多挑戰，許多問題至今還在探索中，例如如何識別腫瘤轉移早期，如何有效治療腫瘤轉移且顯著延長患者的生存期等。單細胞測序技術的發展為研究者和患者帶來了希望，隨著技術的更新和不斷完善，未來終將攻克這一罕見腫瘤，實現UM患者長期生存的目標。