Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種母系遺傳性視神經疾病，由線粒體DNA突變導致視網膜神經節細胞退行性改變。目前該病治療手段有限，早期進行對癥支持治療以及藥物治療可能對患者視力有所改善。基因治療近年來進展迅速，多項臨床研究已證實其安全性和有效性。單眼基因治療對LHON患者視功能改善有一定幫助，且可以提高未注射眼視力，安全性和耐受性較好。未來需要更大樣本量、更長隨訪時間的研究來進一步驗證基因治療的療效及安全性。基因治療有望成為一種安全有效的治療方式，為LHON患者帶來希望。
引用本文： 繆青梅, 陳長征, 元佳佳. Leber遺傳性視神經病變的基因治療. 中華眼底病雜志, 2022, 38(12): 1031-1034. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220127-00049 復制
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種母系遺傳性線粒體疾病，與線粒體DNA點突變導致視網膜神經節細胞（RGC）退行性改變有關。據報道，95%以上的患者都攜帶m.11778G>A、m.3460G>A、m.14484T>C原發突變基因中的一個[1]。另有少數患者攜帶其他罕見原發突變基因，如m.3700G>A、m.3733G>A、m.4171C>A和m.10663T>C等[2]。LHON具有不完全外顯率，約50%男性和90%女性攜帶者可終生不發病，患者多為年輕男性[3]。其一般表現為雙眼先后或同時出現無痛性視力下降，最佳矯正視力（BCVA）通常在0.1以下，視力預后較差，少數患者有輕度自發性視力提高[4]。目前該病治療手段有限，早期進行對癥支持治療以及藥物治療可能對患者視力有所改善[5]。短鏈輔酶Q10類似物艾地苯醌于2015年被歐洲藥品管理局批準用于LHON的治療。多項研究表明，口服艾地苯醌900 mg/d對LHON患者視力改善有一定幫助，尤其對攜帶m.11778G>A突變的患者療效更佳[6-9]。近年來，LHON的基因治療有了新的進展，現就這些治療進展作一綜述，以期為臨床醫生治療LHON提供幫助。
1 機制
LHON最常見的病因是線粒體NADH脫氫酶亞單位4（ND4）基因11778位核苷酸位點的DNA點突變，導致電子呼吸鏈復合體Ⅰ活性下降，電子傳遞受影響，線粒體功能障礙。由于m.11778G>A突變自發緩解率最低、預后最差，能更好地評估基因治療的有效性，因此目前基因治療主要針對攜帶m.11778G>A突變的患者[10-12]。線粒體疾病的基因治療包括細胞核內外源性ND4基因表達、線粒體內外源性ND4基因表達和細胞質線粒體置換，但無法將DNA直接導入人體線粒體以及倫理問題等，目前多使用細胞核內外源性ND4基因表達技術[13-15]。腺相關病毒（AAV）載體具有宿主范圍廣、免疫原性低和長期表達等優勢，且AAV2型載體易感染RGC，是基因治療中最常用的載體[16-18]。玻璃體腔注射攜帶野生型ND4基因的病毒載體，可靶向轉染黃斑區RGC。AAV2載體將ND4基因攜帶至細胞核，在細胞核中轉錄成信使RNA（mRNA），在線粒體靶向序列的作用下，mRNA直接進入線粒體外膜的核糖體進行翻譯。修飾后的ND4蛋白通過線粒體內膜進入線粒體基質，整合到復合體Ⅰ上，與內源性突變型ND4蛋白競爭，從而改善線粒體功能[13,19-20]。
2 動物實驗
此前已有多項動物研究證實，通過AAV2載體介導的ND4異位表達是安全有效的。Guy等[21]向70只小鼠右眼注射攜帶野生型ND4基因的重組AAV2（rAAV2-WT-ND4FLAG），左眼注射AAV-綠色熒光蛋白；結果顯示，正常人ND4基因在小鼠線粒體中的異位表達并未導致RGC丟失、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成障礙或圖形視網膜電圖振幅下降，表明同種異體ND4基因治療LHON患者可能是安全的。考慮到鼠眼和人眼之間的差異較大，Shi等[22]采用與人眼體積和形狀更接近的兔眼進行研究，將36只兔隨機分為3組，分別進行玻璃體腔注射重組AAV（rAAV）2-ND4、rAAV2-綠色熒光蛋白（GFP）和rAAV2，觀察1個月，3組均未出現并發癥，且各組兔視網膜神經纖維層（RNFL）厚度和視覺誘發電位（VEP）的P100波潛伏期無明顯差異。此外，免疫熒光、實時定量聚合酶鏈反應、免疫印跡試驗驗證了ND4基因在兔眼RGC中穩定表達。該研究結果提示，玻璃體腔注射rAAV2-ND4是安全有效的。常規rAAV為單鏈DNA，需先合成為雙鏈DNA，因此表達較慢。Koilkonda等[23]使用自身互補雙鏈AAV（scAAV2）作為載體進行研究，以期提高其在細胞中的表達效率。15只小鼠接受右眼注射scAAV2-WT-ND4FLAG，左眼注射scAAV2-GFP，72 h后雙眼同時注射攜帶突變型ND4基因的AAV2載體（ssAAV2-MT-ND4FLAG）。1周后，幾乎所有小鼠RGC均表達ND4基因，且ND4基因整合到小鼠線粒體復合體Ⅰ上。雙眼對比發現，野生型ND4基因可有效防止ATP合成障礙、抑制視力喪失、減少RGC凋亡以及防止視神經軸突死亡。綜上所述，通過rAAV2和scAAV2載體介導的ND4基因在小鼠RGC的異位表達具有較高安全性和有效性，為LHON患者基因治療的可行性提供了重要依據。
3 臨床試驗
3.1 有效性
目前國內外3個團隊的基因治療研究對象均為攜帶m.11778G>A突變的患者，其使用的AAV載體稍有不同，分別為rAAV2、scAAV2和rAAV2/2。研究發現，基因治療可以顯著改善患者注射眼的視力，療效持久[24]。李斌教授團隊進行了一項前瞻性試驗，在2011年至2012年共納入9例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，病程超過1年，視力較差側眼接受玻璃體腔注射rAAV2-ND4。Wan等[25]對這9例患者隨訪了9個月，6例患者注射眼視力明顯改善[BCVA提高≥0.3個最小分辨角對數（logMAR）]。Yang等[26]對這9例患者繼續隨訪至3年，4例患者視力仍有顯著改善。Yuan等[24]對其中8例患者隨訪75～90個月，結果顯示4例患者的BCVA保持顯著改善。2017年，李斌教授團隊招募了149例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，視力較差側眼接受玻璃體腔注射rAAV2-ND4，這是目前樣本量最大的一項研究。Liu等[27]在注射前和注射后3 d對所有患者進行了眼科檢查，其中43例患者（28.86%，43/149）注射眼視力迅速顯著改善，這些患者在后續多次隨訪中仍保持視力改善。Zhang等[28]對其中53例患者進行了回顧性分析，在基因治療后1、3個月，BCVA改善分別為24、28只眼。美國John Guy教授團隊于2014年進行了一項Ⅰ期臨床試驗，共納入5例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，前3例患者接受低劑量scAAV2-P1ND4v2載體（5×109 vg），第4例患者接受中劑量載體（2.46×1010 vg），第5例患者接受低劑量載體。隨訪90 d，第4例和第5例患者視力分別提高7、15個字母[29]。隨后該研究團隊于2020年又納入9例LHON患者加入該劑量遞增試驗，共計14例患者。隨訪18個月，5例患者視力顯著改善，平均BCVA提高0.45個logMAR單位[30]。法國GenSight Biologics公司于2014年開展rAAV2/2-ND4（GS010）載體Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，共納入15例攜帶m.11778G>A突變的患者，隨訪96周，6例患者注射眼視力顯著改善[30]。Vignal-Clermont等[31]對其中12例患者隨訪至5年，注射眼平均BCVA較基線改善0.44個logMAR單位，整個隨訪期間視力改善保持穩定。兩項隨機、雙盲、多中心、Ⅲ期臨床試驗分別對39例病程≤6個月的患者和37例病程6～12個月的患者隨訪96周。Newman等[32]發現，39例急性期患者從基線視力至24周視力逐漸惡化，24～48周穩定，48～96周稍有改善；96周時，與最差視力比較，平均BCVA提高0.53個logMAR單位，63%的患者視力顯著改善。Yu-Wai-Man等[33]發現，37例亞急性期患者在96周時的視力較基線提高0.308個logMAR單位，35%的患者視力顯著改善；96周時，與最差視力相比，平均BCVA提高0.507個logMAR單位，76%的患者視力顯著改善。由于以上兩項研究納入的患者均為急性期或亞急性期，仍處于視力持續惡化階段，所以治療后初期視力會有所下降。Biousse等[34]對其中多數患者繼續隨訪至發病后52個月，患者視力仍逐步持續改善。以上研究均表明單眼基因治療可在一定程度上提高LHON患者注射眼視力，在治療后數年仍保持視力改善。
臨床試驗中發現，給予單眼基因治療后，部分患者表現為雙眼視力改善。Yang等[26]發現，9例患者在單眼玻璃體腔注射rAAV2-ND4后36個月，5例患者未注射眼視力明顯改善。Yuan等[24]繼續隨訪至75～90個月，5例患者未注射眼視力保持顯著改善。Liu等[27]納入的149例患者中，基因治療后3 d，28例患者未注射眼視力顯著改善。Yu-Wai-Man等[33]研究表明，在單側基因治療后96周，27%的患者未注射眼視力顯著改善。以上多項研究提示，單眼基因治療對雙眼視力均有一定改善。對側眼視力改善的機制目前尚未明確，是基因治療的結果，還是自發改善，目前存在明顯爭議，尚需大樣本長期隨訪以進一步明確。動物實驗提示可能與病毒載體通過前視覺通路的軸突或神經膠質細胞進行轉移有關[35]。也有學者認為病毒載體通過突觸傳遞機制跨神經元轉移[36]。未來可對該機制進一步深入研究，有利于未來視神經病變的基因治療研究設計。
同時，Yang等[26]發現，1例患者接受雙側基因治療后視功能惡化。該患者左眼接受基因治療12個月后，右眼也接受了同樣治療；3個月后，左眼視力下降0.6個logMAR單位；12個月后右眼視力開始下降，雙側視野、VEP均惡化。具體原因尚不明確，需要進一步的研究，因此目前不推薦雙眼基因治療。
部分研究分析了視力預后與基線特征的關系。Liu等[27]研究發現，注射眼視力迅速改善與年齡、病程和基線BCVA有關，與基線視野指數（VFI）和RNFL厚度無關。該研究認為這可能是因為基線BCVA更好的患者，其處于無功能狀態的RGC越多；病程較長的患者，RGC處于穩定狀態，在注射rAAV2-ND4后，這些無功能的RGC迅速恢復功能，使患者視力顯著提高。這一發現與Yuan等[24]的研究結果一致，該研究發現年齡較小以及病程為1～2年的患者視力恢復最為顯著。而Zhang等[28]發現，視力預后與年齡和病程無關，與基線BCVA、VFI和平均偏差有關。Logistic回歸分析提示，基線VFI和BCVA是影響視力預后的獨立因素，基線BCVA和VFI與視力預后成正相關。此外，Yang等[37]分析了多個線粒體突變對基因治療的影響，其發現多位點突變對療效無明顯影響。在基因治療前只需對3種主要突變進行檢測，而無需對整個線粒體基因組進行測序。
3.2 安全性
目前已有多項研究對基因治療的安全性進行了評價。對接受基因治療的9例患者隨訪9個月，均未發生眼部或全身不良事件[25]；在后續長達7年的隨訪中仍未觀察到不良事件的發生[24]。在另一項前瞻性研究中，14例患者單眼接受玻璃體腔注射AAV2-P1ND4v2，在第18個月時，2例患者出現無癥狀葡萄膜炎，隨后自愈，其余患者未發生不良事件[38]。Vignal等[30]對15例接受單眼注射rAAV2/2-ND4（GS010）的患者隨訪96周，評估不同劑量的安全性和耐受性。15例患者治療期間共出現56次眼部不良事件（TEAE），最常見為眼壓升高和眼內炎癥，多數程度較輕。在96周時，眼部TEAE在降眼壓或抗炎治療后均消失，眼底檢查未發現解剖后遺癥。對以上15例患者的TEAE結果進行二次分析，13例接受不同劑量注射的患者均出現輕度眼內炎癥，表明炎癥反應與劑量無關。Duncan[39]分析了上述15例患者眼內炎癥與免疫反應的關系，計算患者綜合眼部炎癥評分（OIS），結果顯示OIS與注射劑量無關，免疫反應與注射劑量以及患者基線免疫狀態無關，OIS與血清中和抗體之間無顯著關聯。Vignal-Clermont等[31]對這15例患者繼續隨訪至5年，共出現91次眼部TEAE，多為輕度眼內炎癥或眼壓輕度升高，且抗炎或降眼壓治療后均消退。以上研究結果提示，單眼玻璃體腔注射病毒載體安全性較高，患者在基因治療后不良反應較輕，對癥治療后均可緩解。
4 小結與展望
目前LHON的基因治療僅針對攜帶m.11778G>A突變的患者，利用同樣的原理，可開展rAAV2-ND1、rAAV2-ND6治療其他兩個主要原發突變的研究，具體可行性有待驗證。多項研究均表明，單眼基因治療可提高雙眼BCVA。由于LHON有一定的自發緩解率，需更大樣本量以及與自然病程組對照研究來明確視力改善是否是基因治療的作用。此外，對側眼視力改善機制尚未明確。另外，將外源性野生型ND4基因直接導入線粒體基因可能提高療效，如何實現將是未來的一大難題。雖然限制性內切酶技術、鋅指核酸酶技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術技術等傳統基因編輯方法及改良的成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9系統已取得一定進展，但仍存在缺陷，未來進一步研究或許可為遺傳性線粒體疾病的治療提供新的見解[40]。
單眼基因治療對LHON患者視功能改善有一定幫助，且可以提高未注射眼視力，治療后7年仍保持視力改善；患者未發生眼部或全身嚴重不良事件，安全性和耐受性好。未來需要更大樣本量、更長隨訪時間的研究來進一步驗證基因治療的療效及安全性。基因治療有望成為一種安全有效的治療方式，為LHON患者帶來希望。
Leber遺傳性視神經病變（LHON）是一種母系遺傳性線粒體疾病，與線粒體DNA點突變導致視網膜神經節細胞（RGC）退行性改變有關。據報道，95%以上的患者都攜帶m.11778G>A、m.3460G>A、m.14484T>C原發突變基因中的一個[1]。另有少數患者攜帶其他罕見原發突變基因，如m.3700G>A、m.3733G>A、m.4171C>A和m.10663T>C等[2]。LHON具有不完全外顯率，約50%男性和90%女性攜帶者可終生不發病，患者多為年輕男性[3]。其一般表現為雙眼先后或同時出現無痛性視力下降，最佳矯正視力（BCVA）通常在0.1以下，視力預后較差，少數患者有輕度自發性視力提高[4]。目前該病治療手段有限，早期進行對癥支持治療以及藥物治療可能對患者視力有所改善[5]。短鏈輔酶Q10類似物艾地苯醌于2015年被歐洲藥品管理局批準用于LHON的治療。多項研究表明，口服艾地苯醌900 mg/d對LHON患者視力改善有一定幫助，尤其對攜帶m.11778G>A突變的患者療效更佳[6-9]。近年來，LHON的基因治療有了新的進展，現就這些治療進展作一綜述，以期為臨床醫生治療LHON提供幫助。
1 機制
LHON最常見的病因是線粒體NADH脫氫酶亞單位4（ND4）基因11778位核苷酸位點的DNA點突變，導致電子呼吸鏈復合體Ⅰ活性下降，電子傳遞受影響，線粒體功能障礙。由于m.11778G>A突變自發緩解率最低、預后最差，能更好地評估基因治療的有效性，因此目前基因治療主要針對攜帶m.11778G>A突變的患者[10-12]。線粒體疾病的基因治療包括細胞核內外源性ND4基因表達、線粒體內外源性ND4基因表達和細胞質線粒體置換，但無法將DNA直接導入人體線粒體以及倫理問題等，目前多使用細胞核內外源性ND4基因表達技術[13-15]。腺相關病毒（AAV）載體具有宿主范圍廣、免疫原性低和長期表達等優勢，且AAV2型載體易感染RGC，是基因治療中最常用的載體[16-18]。玻璃體腔注射攜帶野生型ND4基因的病毒載體，可靶向轉染黃斑區RGC。AAV2載體將ND4基因攜帶至細胞核，在細胞核中轉錄成信使RNA（mRNA），在線粒體靶向序列的作用下，mRNA直接進入線粒體外膜的核糖體進行翻譯。修飾后的ND4蛋白通過線粒體內膜進入線粒體基質，整合到復合體Ⅰ上，與內源性突變型ND4蛋白競爭，從而改善線粒體功能[13,19-20]。
2 動物實驗
此前已有多項動物研究證實，通過AAV2載體介導的ND4異位表達是安全有效的。Guy等[21]向70只小鼠右眼注射攜帶野生型ND4基因的重組AAV2（rAAV2-WT-ND4FLAG），左眼注射AAV-綠色熒光蛋白；結果顯示，正常人ND4基因在小鼠線粒體中的異位表達并未導致RGC丟失、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成障礙或圖形視網膜電圖振幅下降，表明同種異體ND4基因治療LHON患者可能是安全的。考慮到鼠眼和人眼之間的差異較大，Shi等[22]采用與人眼體積和形狀更接近的兔眼進行研究，將36只兔隨機分為3組，分別進行玻璃體腔注射重組AAV（rAAV）2-ND4、rAAV2-綠色熒光蛋白（GFP）和rAAV2，觀察1個月，3組均未出現并發癥，且各組兔視網膜神經纖維層（RNFL）厚度和視覺誘發電位（VEP）的P100波潛伏期無明顯差異。此外，免疫熒光、實時定量聚合酶鏈反應、免疫印跡試驗驗證了ND4基因在兔眼RGC中穩定表達。該研究結果提示，玻璃體腔注射rAAV2-ND4是安全有效的。常規rAAV為單鏈DNA，需先合成為雙鏈DNA，因此表達較慢。Koilkonda等[23]使用自身互補雙鏈AAV（scAAV2）作為載體進行研究，以期提高其在細胞中的表達效率。15只小鼠接受右眼注射scAAV2-WT-ND4FLAG，左眼注射scAAV2-GFP，72 h后雙眼同時注射攜帶突變型ND4基因的AAV2載體（ssAAV2-MT-ND4FLAG）。1周后，幾乎所有小鼠RGC均表達ND4基因，且ND4基因整合到小鼠線粒體復合體Ⅰ上。雙眼對比發現，野生型ND4基因可有效防止ATP合成障礙、抑制視力喪失、減少RGC凋亡以及防止視神經軸突死亡。綜上所述，通過rAAV2和scAAV2載體介導的ND4基因在小鼠RGC的異位表達具有較高安全性和有效性，為LHON患者基因治療的可行性提供了重要依據。
3 臨床試驗
3.1 有效性
目前國內外3個團隊的基因治療研究對象均為攜帶m.11778G>A突變的患者，其使用的AAV載體稍有不同，分別為rAAV2、scAAV2和rAAV2/2。研究發現，基因治療可以顯著改善患者注射眼的視力，療效持久[24]。李斌教授團隊進行了一項前瞻性試驗，在2011年至2012年共納入9例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，病程超過1年，視力較差側眼接受玻璃體腔注射rAAV2-ND4。Wan等[25]對這9例患者隨訪了9個月，6例患者注射眼視力明顯改善[BCVA提高≥0.3個最小分辨角對數（logMAR）]。Yang等[26]對這9例患者繼續隨訪至3年，4例患者視力仍有顯著改善。Yuan等[24]對其中8例患者隨訪75～90個月，結果顯示4例患者的BCVA保持顯著改善。2017年，李斌教授團隊招募了149例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，視力較差側眼接受玻璃體腔注射rAAV2-ND4，這是目前樣本量最大的一項研究。Liu等[27]在注射前和注射后3 d對所有患者進行了眼科檢查，其中43例患者（28.86%，43/149）注射眼視力迅速顯著改善，這些患者在后續多次隨訪中仍保持視力改善。Zhang等[28]對其中53例患者進行了回顧性分析，在基因治療后1、3個月，BCVA改善分別為24、28只眼。美國John Guy教授團隊于2014年進行了一項Ⅰ期臨床試驗，共納入5例攜帶m.11778G>A突變的LHON患者，前3例患者接受低劑量scAAV2-P1ND4v2載體（5×109 vg），第4例患者接受中劑量載體（2.46×1010 vg），第5例患者接受低劑量載體。隨訪90 d，第4例和第5例患者視力分別提高7、15個字母[29]。隨后該研究團隊于2020年又納入9例LHON患者加入該劑量遞增試驗，共計14例患者。隨訪18個月，5例患者視力顯著改善，平均BCVA提高0.45個logMAR單位[30]。法國GenSight Biologics公司于2014年開展rAAV2/2-ND4（GS010）載體Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，共納入15例攜帶m.11778G>A突變的患者，隨訪96周，6例患者注射眼視力顯著改善[30]。Vignal-Clermont等[31]對其中12例患者隨訪至5年，注射眼平均BCVA較基線改善0.44個logMAR單位，整個隨訪期間視力改善保持穩定。兩項隨機、雙盲、多中心、Ⅲ期臨床試驗分別對39例病程≤6個月的患者和37例病程6～12個月的患者隨訪96周。Newman等[32]發現，39例急性期患者從基線視力至24周視力逐漸惡化，24～48周穩定，48～96周稍有改善；96周時，與最差視力比較，平均BCVA提高0.53個logMAR單位，63%的患者視力顯著改善。Yu-Wai-Man等[33]發現，37例亞急性期患者在96周時的視力較基線提高0.308個logMAR單位，35%的患者視力顯著改善；96周時，與最差視力相比，平均BCVA提高0.507個logMAR單位，76%的患者視力顯著改善。由于以上兩項研究納入的患者均為急性期或亞急性期，仍處于視力持續惡化階段，所以治療后初期視力會有所下降。Biousse等[34]對其中多數患者繼續隨訪至發病后52個月，患者視力仍逐步持續改善。以上研究均表明單眼基因治療可在一定程度上提高LHON患者注射眼視力，在治療后數年仍保持視力改善。
臨床試驗中發現，給予單眼基因治療后，部分患者表現為雙眼視力改善。Yang等[26]發現，9例患者在單眼玻璃體腔注射rAAV2-ND4后36個月，5例患者未注射眼視力明顯改善。Yuan等[24]繼續隨訪至75～90個月，5例患者未注射眼視力保持顯著改善。Liu等[27]納入的149例患者中，基因治療后3 d，28例患者未注射眼視力顯著改善。Yu-Wai-Man等[33]研究表明，在單側基因治療后96周，27%的患者未注射眼視力顯著改善。以上多項研究提示，單眼基因治療對雙眼視力均有一定改善。對側眼視力改善的機制目前尚未明確，是基因治療的結果，還是自發改善，目前存在明顯爭議，尚需大樣本長期隨訪以進一步明確。動物實驗提示可能與病毒載體通過前視覺通路的軸突或神經膠質細胞進行轉移有關[35]。也有學者認為病毒載體通過突觸傳遞機制跨神經元轉移[36]。未來可對該機制進一步深入研究，有利于未來視神經病變的基因治療研究設計。
同時，Yang等[26]發現，1例患者接受雙側基因治療后視功能惡化。該患者左眼接受基因治療12個月后，右眼也接受了同樣治療；3個月后，左眼視力下降0.6個logMAR單位；12個月后右眼視力開始下降，雙側視野、VEP均惡化。具體原因尚不明確，需要進一步的研究，因此目前不推薦雙眼基因治療。
部分研究分析了視力預后與基線特征的關系。Liu等[27]研究發現，注射眼視力迅速改善與年齡、病程和基線BCVA有關，與基線視野指數（VFI）和RNFL厚度無關。該研究認為這可能是因為基線BCVA更好的患者，其處于無功能狀態的RGC越多；病程較長的患者，RGC處于穩定狀態，在注射rAAV2-ND4后，這些無功能的RGC迅速恢復功能，使患者視力顯著提高。這一發現與Yuan等[24]的研究結果一致，該研究發現年齡較小以及病程為1～2年的患者視力恢復最為顯著。而Zhang等[28]發現，視力預后與年齡和病程無關，與基線BCVA、VFI和平均偏差有關。Logistic回歸分析提示，基線VFI和BCVA是影響視力預后的獨立因素，基線BCVA和VFI與視力預后成正相關。此外，Yang等[37]分析了多個線粒體突變對基因治療的影響，其發現多位點突變對療效無明顯影響。在基因治療前只需對3種主要突變進行檢測，而無需對整個線粒體基因組進行測序。
3.2 安全性
目前已有多項研究對基因治療的安全性進行了評價。對接受基因治療的9例患者隨訪9個月，均未發生眼部或全身不良事件[25]；在后續長達7年的隨訪中仍未觀察到不良事件的發生[24]。在另一項前瞻性研究中，14例患者單眼接受玻璃體腔注射AAV2-P1ND4v2，在第18個月時，2例患者出現無癥狀葡萄膜炎，隨后自愈，其余患者未發生不良事件[38]。Vignal等[30]對15例接受單眼注射rAAV2/2-ND4（GS010）的患者隨訪96周，評估不同劑量的安全性和耐受性。15例患者治療期間共出現56次眼部不良事件（TEAE），最常見為眼壓升高和眼內炎癥，多數程度較輕。在96周時，眼部TEAE在降眼壓或抗炎治療后均消失，眼底檢查未發現解剖后遺癥。對以上15例患者的TEAE結果進行二次分析，13例接受不同劑量注射的患者均出現輕度眼內炎癥，表明炎癥反應與劑量無關。Duncan[39]分析了上述15例患者眼內炎癥與免疫反應的關系，計算患者綜合眼部炎癥評分（OIS），結果顯示OIS與注射劑量無關，免疫反應與注射劑量以及患者基線免疫狀態無關，OIS與血清中和抗體之間無顯著關聯。Vignal-Clermont等[31]對這15例患者繼續隨訪至5年，共出現91次眼部TEAE，多為輕度眼內炎癥或眼壓輕度升高，且抗炎或降眼壓治療后均消退。以上研究結果提示，單眼玻璃體腔注射病毒載體安全性較高，患者在基因治療后不良反應較輕，對癥治療后均可緩解。
4 小結與展望
目前LHON的基因治療僅針對攜帶m.11778G>A突變的患者，利用同樣的原理，可開展rAAV2-ND1、rAAV2-ND6治療其他兩個主要原發突變的研究，具體可行性有待驗證。多項研究均表明，單眼基因治療可提高雙眼BCVA。由于LHON有一定的自發緩解率，需更大樣本量以及與自然病程組對照研究來明確視力改善是否是基因治療的作用。此外，對側眼視力改善機制尚未明確。另外，將外源性野生型ND4基因直接導入線粒體基因可能提高療效，如何實現將是未來的一大難題。雖然限制性內切酶技術、鋅指核酸酶技術和轉錄激活因子樣效應物核酸酶技術技術等傳統基因編輯方法及改良的成簇規律間隔的短回文重復序列及其相關蛋白9系統已取得一定進展，但仍存在缺陷，未來進一步研究或許可為遺傳性線粒體疾病的治療提供新的見解[40]。
單眼基因治療對LHON患者視功能改善有一定幫助，且可以提高未注射眼視力，治療后7年仍保持視力改善；患者未發生眼部或全身嚴重不良事件，安全性和耐受性好。未來需要更大樣本量、更長隨訪時間的研究來進一步驗證基因治療的療效及安全性。基因治療有望成為一種安全有效的治療方式，為LHON患者帶來希望。