引用本文： 周玲玲, 童妍, 嚴江波, 沈吟. 精母細胞相關蛋白基因變異致象限性視網膜色素變性伴黃斑營養不良一家系臨床表型及基因型分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 643-649. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211206-00683 復制
視網膜色素變性（RP）是一組具有高度遺傳異質性的神經退行性疾病，以夜盲、視野缺損及視網膜變性為主要特征[1]。其眼底常表現為骨細胞樣色素沉著、視網膜血管變細及視盤顏色蠟黃等。象限性RP（sector RP）是一種罕見的非典型性RP，以常染色體顯性遺傳居多，雙眼視網膜變性對稱，主要局限于1～2個象限，以下方（尤其鼻下方）視網膜為主，對應上方視野缺損[2-3]；病變保持靜止或進展緩慢，常可保存較好的中心視力[4]，有文獻報道82%的sector RP患者視力≥0.5[5]。基因突變是sector RP發病的主要危險因素，目前已證實與sector RP相關的致病基因11個[6]，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X染色體連鎖遺傳。目前針對sector RP的研究較少且不夠深入，其致病機制仍不清楚。精母細胞相關蛋白7（SPATA7，OMIM: 609868）基因，位于染色體14q31.3，包含12個外顯子，編碼599個氨基酸的蛋白質，在進化中高度保守，依據3號外顯子的可變剪接編碼2種蛋白亞型，其中包含3號外顯子編碼的亞型主要表達于視網膜和腦[7]，對光感受器內外節的物質運輸起著重要作用。其突變與常染色體隱性Leber先天性黑矇（LCA）和青少年性RP有關[8]；此外，還可造成錐桿細胞營養不良（CRD）[9]。本研究對由SPATA7基因所致sector RP的1個家系的基因型和臨床表型進行分析，以期為進一步對特定基因的潛在致病機制及治療方案的研究提供新線索。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究遵循《赫爾辛基宣言》原則，經武漢大學人民醫院倫理委員會審批（批準號：WDRY2019-K032）；受檢者及監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年4月于武漢大學人民醫院眼科就診的1個sector RP家系中先證者及其父母納入研究。詳細詢問患者病史和家族史，并行最佳矯正視力（BCVA）、眼底彩色照相、自身熒光（AF）、視野、頻域光相干斷層掃描（SD-OCT）、視網膜電圖（ERG）、熒光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青綠血管造影（ICGA）檢查。
采集先證者及其父母外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國Qiagen公司QiAamp? Blood Mini Kit試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，應用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000分光光度計對基因組DNA質量和數量進行評估。采用美國NEB公司NEBNext dsDNA Fragmentase打碎DNA序列，美國IDT公司xGen? Exome Research Panel v1.0試劑盒對DNA目標區域進行捕獲，建立DNA文庫；采用美國Illumina公司Illumina NovaSeq6000高通量測序儀對DNA樣本進行測序。測序數據處理包括序列生成、序列比對（GRCh37）、變異識別（包括單核苷酸突變、刪除和插入變異）、變異篩選、變異注釋、變異優化，所有確定變異的致病性預測根據美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）指南[10]進行評估。
采用拷貝數變異（CNV）kit試劑盒檢測CNV，CNV參考序列由內部樣本建立。CNV識別中，采用循環二元分割算法對CNV變異進行分割，閾值參數設置為“－1.6、－0.8、0.5、1.0”。拷貝數結果以log2拷貝率的計算值呈現；B等位基因頻率由Samtools的mpileup計算得出，利用AnnotSV及其注釋數據庫對檢測到的CNV進行注釋。
對SPATA7錯義突變采用Sanger測序并進行家系共分離驗證。Sanger測序中，應用Primer 5.0引物設計軟件設計引物，以基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應（PCR）擴增含有變異的外顯子片段，對PCR擴增的目的DNA片段進行純化并測序，Chromas軟件分析測序結果。CNV采用實時定量PCR（qPCR）進行驗證，美國Thermo Fisher Scientific公司Applied Biosystems? 7500 qPCR系統進行qPCR反應。
致病變異位點篩選原則：外顯子測序項目（ESP）數據庫（https://esp.gs.washington.edu/drupal/）、篩選ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、人群基因頻率數據庫（gnomAD）中未見正常人攜帶或攜帶頻率小于5%的變異。通過人類基因致病性突變數據庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、Clinvar數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）及PubMed數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢是否有相關論文報道，已報道的相關致病變異確定為致病性變異。在線軟件SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster （https://www.mutationtaster.org/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/index.php）對點突變蛋白功能進行預測；在線軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/）對多物種蛋白質氨基酸序列進行比對，Weblogo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）繪制序列標識圖，Mutation Taster預測軟件中的Phylop值評估突變位點的保守性；采用Swiss-PdbViewer軟件分析變異位點氨基酸序列對SPATA7蛋白結構造成的影響。
2 結果
先證者，男，17歲。雙眼視力漸進性下降2年，無明顯夜盲癥狀。雙眼BCVA均為0.4。雙眼眼底可見視網膜血管變細，黃斑區營養不良樣改變，周邊視網膜顏色灰暗，未見明顯色素沉著（圖1A）。眼底AF檢查，雙眼鼻下象限對稱性弱AF，包繞黃斑區，黃斑中心凹呈“花瓣狀”強AF，其余象限未見明顯異常AF（圖1B）。視野檢查，與變性區對應的顳上方視野缺失（圖1C）。SD-OCT檢查，雙眼中心凹以外變性區光感受器層消失，中心凹區域外層視網膜結構紊亂；右眼黃斑顳側視網膜光感受器層結構存在（圖1D）。FFA檢查，雙眼視網膜動脈細，視盤周圍、鼻下方視網膜色素上皮（RPE）萎縮，可見明顯透見熒光，顳側及上方視網膜遠端未見明顯透見熒光，黃斑中心凹被強熒光包繞（圖2A，2B）。ICGA檢查，雙眼下方RPE及脈絡膜萎縮，中晚期明顯弱熒光（圖2C，2D）。ERG檢查，雙眼暗適應波幅降低、明適應呈熄滅狀態（圖3）。其父母眼部表型正常。
圖1
象限性RP患者右眼彩色眼底、AF、視野、SD-OCT像。1A示彩色眼底像，黃斑區營養不良樣改變，周邊視網膜顏色灰暗，無明顯色素沉著；1B示眼底AF像，鼻下象限視網膜弱AF，黃斑中心凹強AF，黃斑和視盤周圍弱AF區域與鼻下方視網膜之間存在分界（白箭）；1C示視野檢查像，顳上方視野缺損；1D示SD-OCT像，黃斑區光感受器層缺失伴中心凹下方外層視網膜結構紊亂，黃斑顳側可見光感受器層結構存在（白箭）。RP：視網膜色素變性；AF：自身熒光；SD-OCT：頻域光相干斷層掃描
圖2
象限性RP患者FFA、ICGA像。2A、2B分別示右眼、左眼FFA拼圖像，雙眼視網膜動脈細，視盤周圍及鼻下方視網膜RPE萎縮，可見明顯透見熒光，顳側及上方離病灶較遠處的視網膜無明顯透見熒光，黃斑中心凹周圍被強熒光包繞。2C、2D分別示右眼ICGA中期、晚期像。雙眼下方RPE及脈絡膜萎縮，呈弱熒光。RP：視網膜色素變性；RPE：視網膜色素上皮；FFA：熒光素眼底血管造影；ICGA：吲哚青綠血管造影
圖3
象限性RP患者ERG檢查結果。3A～3C分別為右眼、左眼暗適應ERG，雙眼0.01、3.0 ERG振幅降低，3.0 ERG振蕩電位波形呈熄滅狀態；3D、3E分別示右眼、左眼明適應ERG，雙眼3.0 ERG、3.0閃光ERG波形呈熄滅狀態。RP：視網膜色素變性；ERG：視網膜電圖
患者全外顯子序列平均測序深度為120×，99.09%的目標區域覆率＞20×，99.08%的目標區域覆率＞30×。先證者SPATA7基因第10號外顯子存在一錯義突變c.1112T>C（p.Ile371Thr），導致編碼的SPATA7蛋白第371號氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸；其母親攜帶c.1112T>C雜合突變（圖4）。此變異在gnomAD中最小等位基因頻率為0.000 6，ESP數據庫、千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫中正常對照人群中未發現此變異，Clinvar數據庫報道為意義不明確突變，PubMed數據庫報道為可能致病突變[11]，根據ACMG指南該變異為意義不明確變異；同源染色體存在一CNV，導致SPATA7基因第10號外顯子缺失，根據ACMG指南，該變異為可能致病變異。qPCR驗證結果顯示，先證者CNV來源于父親，其父親為雜合缺失（圖5）。父母均無臨床表型，符合家系遺傳共分離。
圖4
象限性RP家系先證者及父母基因測序圖。4A示先證者，SPATA7基因第10號外顯子的c.1112T>C錯義突變（紅箭）；4B示先證者母親，c.1112T>C雜合突變（紅箭）；4C示先證者父親，該位點不存在突變（紅箭）。RP：視網膜色素變性
圖5
象限性RP家系先證者及父母拷貝數變異驗證結果。5A～5C分別示先證者及其父母，先證者目標區域拷貝數與其父親一致，為雜合缺失，母親拷貝數正常。圖中“對照”為正常人標準樣本。RP：視網膜色素變性
生物信息學分析結果，SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN預測軟件對錯義突變造成的氨基酸改變預測分別為有害、可能有害、致病、有害。蛋白序列同源性分析結果顯示，SPATA7基因p.Ile371Thr突變所對應的第371號氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6A），該變異位點及周圍氨基酸序列均為高度保守（圖6B），在線軟件預測結果Phylop值為3.203，提示該變異位點所在區域在生物功能中可能發揮重要作用。Swiss-PdbViewer分析結果顯示，p.Ile371Thr與其附近氨基酸組成α螺旋結構（圖6C），第371位氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸后，其羥基與第368位氨基酸（亮氨酸）形成一個額外氫鍵（圖6D～6E），提示對該區域結構及功能可能產生影響。
圖6
SPATA7基因p.Ile371Thr變異位點的生物信息學分析。6A示SPATA7蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖，變異位點所對應的第371號氨基酸位點在人（Human）、羊（Sheep）、狒狒（Baboon）、馬（Horse）、大象（Elephant）、牛（Bovin）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Guineapig）中均高度保守（黑框內）。6B示變異位點附近氨基酸序列標識圖，圖中字母越大，對應氨基酸越保守。6C～6E為變異位點附近蛋白二級結構預測圖。6C示變異位點（黃色）與周圍氨基酸序列組成α螺旋結構；6D、6E分別示6C圖方框中野生型與突變型氨基酸序列，第371位氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸后，其羥基與第368位氨基酸（亮氨酸）形成一個額外氫鍵
3 討論
本研究中先證者無明顯夜盲，視網膜未見明顯色素沉著，但有研究表明無色素性RP可能是原發性RP的早期表現[12]，因此先證者視網膜色素沉著可能隨病情進展而出現。此類RP早期臨床極易漏診或誤診，應常規行眼底AF、電生理、基因測序等檢查。本例患者眼底AF可見鼻下象限視網膜弱AF；對應顳上方視野缺失；RPE萎縮以視盤周圍及鼻下方視網膜最為嚴重，而顳側及上方離病灶較遠處的視網膜相對正常；ICGA示下方脈絡膜萎縮；ERG視錐、視桿系統反應均降低；且黃斑SD-OCT可見變性區光感受器層消失，而顳側非變性區光感受器結構存在。以上結果說明患者視網膜變性以鼻下象限為主，符合sector RP診斷。作為一種非典型RP，sector RP有更輕的臨床表型和更好的預后，最典型特征是視網膜變性主要局限于1～2個象限，且主要以下方視網膜為主，這可能與日常光照來源于頭頂導致下方視網膜暴露于更多光刺激有關[13-14]。光暴露可引起自由基介導的細胞凋亡[13-16]，在視紫紅質（RHO）基因變異所致RP動物模型中，光剝奪可減緩視網膜變性速度[17]，進一步說明光暴露對光感受器的損傷。這提示因此RP患者應盡量減少暴露于強光中。
此外，本研究中先證者存在視野缺損、橢圓體帶缺失、ERG異常且ICGA晚期視網膜下方呈片狀弱熒光陰影區域，與急性區域性隱匿性外層視網膜病變（AZOOR）特征較為相似，需與之鑒別。AZOOR是一種視網膜外層功能障礙性病變，好發于年輕女性，多急性起病，多數患者為單眼發病，且超過90%的AZOOR患者FFA無明顯異常[18]。
本研究采用二代測序、Sanger測序及qPCR技術，對先證者相關基因及其突變位點進行鑒定，結果顯示，患者SPATA7基因的第10號外顯子錯義突變c.1112T>C（p.Ile371Thr）和同源染色體第10號外顯子缺失。SPATA7基因在物種進化中具有高度保守性，編碼一種纖毛蛋白，主要表達于光感受器的連接纖毛處，可與另一種纖毛蛋白RPGRIP1的N端區域相互作用形成復合物，對RHO和其他纖毛蛋白起到引導定位作用。此外，光感受器連接纖毛處的纖毛蛋白眾多，如RPGR、USH2A、CEP290、NPHP4等，它們可形成纖毛蛋白復合體，對光感受器內外節之間的物質運輸起著十分重要的作用，任一基因的缺失均有可能引起視網膜病變。研究表明，敲除SPATA7基因可導致其他纖毛蛋白錯誤分布于連接纖毛的近段，并可導致RHO無法被運送至光感受器外節，表現為光感受器的進行性退化，外節無序并縮短，而其他視網膜神經元及RPE層無影響[19-21]。既往有報道SPATA7基因突變與LCA和青少年性RP有關[8, 22]，目前報道的SPATA7基因突變多數為無義突變或移碼突變[23]，錯義突變較少。本例先證者SPATA7基因錯義突變和CNV均位于第10號外顯子，蛋白質變異靠近C末端，而位于SPATA7蛋白C末端的突變可能會導致更輕微的臨床表型[8]。但有學者報道德國一血緣家庭兄妹二人均為SPATA7基因c.1112T>C純和錯義突變，但兩人臨床表型差異大，哥哥表現為嚴重RP，而妹妹僅表現為較輕微的CRD[9]。本研究中先證者也與上述文獻中患者的臨床表型不同。研究結果的多樣性說明SPATA7基因突變所致臨床表型的異質性，即使攜帶相同基因型，臨床表現也不盡相同。
目前已發現與sector RP相關的致病基因11個，包括常染色體顯性遺傳RHO[3, 24-25]、 IMPDH1[6]、RP1[6]；常染色體隱性遺傳USH1C[26]、MYO7A[6]、CDH23[27]、EYS[6, 28]、SAG[29-30]、RDH5[31]；X染色體連鎖遺傳PRPS1[6]、RPGR [24, 32]。3種遺傳模式患者的平均發病年齡分別為38.5、30.5、39.0歲[6]。本研究中先證者發病年齡15歲，遠小于上述文獻報道的發病年齡。此外，先證者近2年視力逐漸下降，雙眼BCVA均為0.4，低于sector RP患者的平均視力[6]，且眼底照相顯示黃斑區營養不良樣改變，眼底AF可見黃斑中心凹及視盤周圍弱AF區域與鼻下方視網膜之間存在明顯分界線，此分界線也成為ICGA晚期低灌注區的分界線。其原因可能與2處視網膜病變進展不同有關，分界線上方病灶存在一定程度RPE萎縮但脈絡膜無明顯萎縮；分界線下方則為RPE-Bruch膜-脈絡膜均萎縮。黃斑中心凹呈強AF，說明中心凹區域為高代謝狀態，意味此區域光感受器細胞可能正在逐漸死亡，導致自體熒光物質（脂褐素）的累積，而ERG檢查示明適應呈熄滅狀態進一步證明視錐細胞數量嚴重減少，我們認為這可能是疾病動態進展的表現。Georgiou等[6]對1例累及黃斑的sector RP患者進行了長達13.5年的隨訪，發現其病情進展及視力損害均更加嚴重。進一步說明當sector RP累及黃斑后，其臨床表現更重，病情進展也更快。
盡管近年來藥物、視網膜假體及干細胞治療等方法快速發展，但目前對于sector RP尚無有效治療方法。隨著測序技術發展和基因治療的進步，針對特定基因突變的編輯技術逐漸受到重視。在SPATA7基因敲除小鼠中行腺相關病毒8載體介導的基因替代治療顯示，與對照組比較，治療組小鼠光感受器存活率增加，ERG反應改善，并可挽救RHO的異常定位[33]，證明基因治療在SPATA7基因突變所致RP中具有治療前景。
本研究發現SPATA7基因可能與常染色體隱性sector RP相關，擴大了sector RP的基因突變頻譜，增加了SPATA7基因突變的臨床表型異質性，同時還觀察到sector RP可累及黃斑，造成黃斑營養不良，導致更嚴重的臨床表型，為sector RP的后續研究提供了思路。本課題組將繼續對此家系進行長期跟蹤隨訪，觀察病情進展，同時收集其他非典型RP家系資料，以進一步探索此類病變的形成機制。
視網膜色素變性（RP）是一組具有高度遺傳異質性的神經退行性疾病，以夜盲、視野缺損及視網膜變性為主要特征[1]。其眼底常表現為骨細胞樣色素沉著、視網膜血管變細及視盤顏色蠟黃等。象限性RP（sector RP）是一種罕見的非典型性RP，以常染色體顯性遺傳居多，雙眼視網膜變性對稱，主要局限于1～2個象限，以下方（尤其鼻下方）視網膜為主，對應上方視野缺損[2-3]；病變保持靜止或進展緩慢，常可保存較好的中心視力[4]，有文獻報道82%的sector RP患者視力≥0.5[5]。基因突變是sector RP發病的主要危險因素，目前已證實與sector RP相關的致病基因11個[6]，遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X染色體連鎖遺傳。目前針對sector RP的研究較少且不夠深入，其致病機制仍不清楚。精母細胞相關蛋白7（SPATA7，OMIM: 609868）基因，位于染色體14q31.3，包含12個外顯子，編碼599個氨基酸的蛋白質，在進化中高度保守，依據3號外顯子的可變剪接編碼2種蛋白亞型，其中包含3號外顯子編碼的亞型主要表達于視網膜和腦[7]，對光感受器內外節的物質運輸起著重要作用。其突變與常染色體隱性Leber先天性黑矇（LCA）和青少年性RP有關[8]；此外，還可造成錐桿細胞營養不良（CRD）[9]。本研究對由SPATA7基因所致sector RP的1個家系的基因型和臨床表型進行分析，以期為進一步對特定基因的潛在致病機制及治療方案的研究提供新線索。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究遵循《赫爾辛基宣言》原則，經武漢大學人民醫院倫理委員會審批（批準號：WDRY2019-K032）；受檢者及監護人均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年4月于武漢大學人民醫院眼科就診的1個sector RP家系中先證者及其父母納入研究。詳細詢問患者病史和家族史，并行最佳矯正視力（BCVA）、眼底彩色照相、自身熒光（AF）、視野、頻域光相干斷層掃描（SD-OCT）、視網膜電圖（ERG）、熒光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青綠血管造影（ICGA）檢查。
采集先證者及其父母外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用德國Qiagen公司QiAamp? Blood Mini Kit試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA，應用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000分光光度計對基因組DNA質量和數量進行評估。采用美國NEB公司NEBNext dsDNA Fragmentase打碎DNA序列，美國IDT公司xGen? Exome Research Panel v1.0試劑盒對DNA目標區域進行捕獲，建立DNA文庫；采用美國Illumina公司Illumina NovaSeq6000高通量測序儀對DNA樣本進行測序。測序數據處理包括序列生成、序列比對（GRCh37）、變異識別（包括單核苷酸突變、刪除和插入變異）、變異篩選、變異注釋、變異優化，所有確定變異的致病性預測根據美國醫學遺傳學和基因組學學院（ACMG）指南[10]進行評估。
采用拷貝數變異（CNV）kit試劑盒檢測CNV，CNV參考序列由內部樣本建立。CNV識別中，采用循環二元分割算法對CNV變異進行分割，閾值參數設置為“－1.6、－0.8、0.5、1.0”。拷貝數結果以log2拷貝率的計算值呈現；B等位基因頻率由Samtools的mpileup計算得出，利用AnnotSV及其注釋數據庫對檢測到的CNV進行注釋。
對SPATA7錯義突變采用Sanger測序并進行家系共分離驗證。Sanger測序中，應用Primer 5.0引物設計軟件設計引物，以基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應（PCR）擴增含有變異的外顯子片段，對PCR擴增的目的DNA片段進行純化并測序，Chromas軟件分析測序結果。CNV采用實時定量PCR（qPCR）進行驗證，美國Thermo Fisher Scientific公司Applied Biosystems? 7500 qPCR系統進行qPCR反應。
致病變異位點篩選原則：外顯子測序項目（ESP）數據庫（https://esp.gs.washington.edu/drupal/）、篩選ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、人群基因頻率數據庫（gnomAD）中未見正常人攜帶或攜帶頻率小于5%的變異。通過人類基因致病性突變數據庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）、Clinvar數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）及PubMed數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢是否有相關論文報道，已報道的相關致病變異確定為致病性變異。在線軟件SIFT（http://sift.jcvi.org/）、Polyphen2 （http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster （https://www.mutationtaster.org/）、PROVEAN（http://provean.jcvi.org/index.php）對點突變蛋白功能進行預測；在線軟件Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/）對多物種蛋白質氨基酸序列進行比對，Weblogo（http://weblogo.berkeley. edu/logo.cgi）繪制序列標識圖，Mutation Taster預測軟件中的Phylop值評估突變位點的保守性；采用Swiss-PdbViewer軟件分析變異位點氨基酸序列對SPATA7蛋白結構造成的影響。
2 結果
先證者，男，17歲。雙眼視力漸進性下降2年，無明顯夜盲癥狀。雙眼BCVA均為0.4。雙眼眼底可見視網膜血管變細，黃斑區營養不良樣改變，周邊視網膜顏色灰暗，未見明顯色素沉著（圖1A）。眼底AF檢查，雙眼鼻下象限對稱性弱AF，包繞黃斑區，黃斑中心凹呈“花瓣狀”強AF，其余象限未見明顯異常AF（圖1B）。視野檢查，與變性區對應的顳上方視野缺失（圖1C）。SD-OCT檢查，雙眼中心凹以外變性區光感受器層消失，中心凹區域外層視網膜結構紊亂；右眼黃斑顳側視網膜光感受器層結構存在（圖1D）。FFA檢查，雙眼視網膜動脈細，視盤周圍、鼻下方視網膜色素上皮（RPE）萎縮，可見明顯透見熒光，顳側及上方視網膜遠端未見明顯透見熒光，黃斑中心凹被強熒光包繞（圖2A，2B）。ICGA檢查，雙眼下方RPE及脈絡膜萎縮，中晚期明顯弱熒光（圖2C，2D）。ERG檢查，雙眼暗適應波幅降低、明適應呈熄滅狀態（圖3）。其父母眼部表型正常。
圖1
象限性RP患者右眼彩色眼底、AF、視野、SD-OCT像。1A示彩色眼底像，黃斑區營養不良樣改變，周邊視網膜顏色灰暗，無明顯色素沉著；1B示眼底AF像，鼻下象限視網膜弱AF，黃斑中心凹強AF，黃斑和視盤周圍弱AF區域與鼻下方視網膜之間存在分界（白箭）；1C示視野檢查像，顳上方視野缺損；1D示SD-OCT像，黃斑區光感受器層缺失伴中心凹下方外層視網膜結構紊亂，黃斑顳側可見光感受器層結構存在（白箭）。RP：視網膜色素變性；AF：自身熒光；SD-OCT：頻域光相干斷層掃描
圖2
象限性RP患者FFA、ICGA像。2A、2B分別示右眼、左眼FFA拼圖像，雙眼視網膜動脈細，視盤周圍及鼻下方視網膜RPE萎縮，可見明顯透見熒光，顳側及上方離病灶較遠處的視網膜無明顯透見熒光，黃斑中心凹周圍被強熒光包繞。2C、2D分別示右眼ICGA中期、晚期像。雙眼下方RPE及脈絡膜萎縮，呈弱熒光。RP：視網膜色素變性；RPE：視網膜色素上皮；FFA：熒光素眼底血管造影；ICGA：吲哚青綠血管造影
圖3
象限性RP患者ERG檢查結果。3A～3C分別為右眼、左眼暗適應ERG，雙眼0.01、3.0 ERG振幅降低，3.0 ERG振蕩電位波形呈熄滅狀態；3D、3E分別示右眼、左眼明適應ERG，雙眼3.0 ERG、3.0閃光ERG波形呈熄滅狀態。RP：視網膜色素變性；ERG：視網膜電圖
患者全外顯子序列平均測序深度為120×，99.09%的目標區域覆率＞20×，99.08%的目標區域覆率＞30×。先證者SPATA7基因第10號外顯子存在一錯義突變c.1112T>C（p.Ile371Thr），導致編碼的SPATA7蛋白第371號氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸；其母親攜帶c.1112T>C雜合突變（圖4）。此變異在gnomAD中最小等位基因頻率為0.000 6，ESP數據庫、千人基因組計劃數據庫、ExAC數據庫中正常對照人群中未發現此變異，Clinvar數據庫報道為意義不明確突變，PubMed數據庫報道為可能致病突變[11]，根據ACMG指南該變異為意義不明確變異；同源染色體存在一CNV，導致SPATA7基因第10號外顯子缺失，根據ACMG指南，該變異為可能致病變異。qPCR驗證結果顯示，先證者CNV來源于父親，其父親為雜合缺失（圖5）。父母均無臨床表型，符合家系遺傳共分離。
圖4
象限性RP家系先證者及父母基因測序圖。4A示先證者，SPATA7基因第10號外顯子的c.1112T>C錯義突變（紅箭）；4B示先證者母親，c.1112T>C雜合突變（紅箭）；4C示先證者父親，該位點不存在突變（紅箭）。RP：視網膜色素變性
圖5
象限性RP家系先證者及父母拷貝數變異驗證結果。5A～5C分別示先證者及其父母，先證者目標區域拷貝數與其父親一致，為雜合缺失，母親拷貝數正常。圖中“對照”為正常人標準樣本。RP：視網膜色素變性
生物信息學分析結果，SIFT、Polyphen2、Mutation Taster、PROVEAN預測軟件對錯義突變造成的氨基酸改變預測分別為有害、可能有害、致病、有害。蛋白序列同源性分析結果顯示，SPATA7基因p.Ile371Thr突變所對應的第371號氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6A），該變異位點及周圍氨基酸序列均為高度保守（圖6B），在線軟件預測結果Phylop值為3.203，提示該變異位點所在區域在生物功能中可能發揮重要作用。Swiss-PdbViewer分析結果顯示，p.Ile371Thr與其附近氨基酸組成α螺旋結構（圖6C），第371位氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸后，其羥基與第368位氨基酸（亮氨酸）形成一個額外氫鍵（圖6D～6E），提示對該區域結構及功能可能產生影響。
圖6
SPATA7基因p.Ile371Thr變異位點的生物信息學分析。6A示SPATA7蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖，變異位點所對應的第371號氨基酸位點在人（Human）、羊（Sheep）、狒狒（Baboon）、馬（Horse）、大象（Elephant）、牛（Bovin）、小鼠（Mouse）、豚鼠（Guineapig）中均高度保守（黑框內）。6B示變異位點附近氨基酸序列標識圖，圖中字母越大，對應氨基酸越保守。6C～6E為變異位點附近蛋白二級結構預測圖。6C示變異位點（黃色）與周圍氨基酸序列組成α螺旋結構；6D、6E分別示6C圖方框中野生型與突變型氨基酸序列，第371位氨基酸由異亮氨酸變成蘇氨酸后，其羥基與第368位氨基酸（亮氨酸）形成一個額外氫鍵
3 討論
本研究中先證者無明顯夜盲，視網膜未見明顯色素沉著，但有研究表明無色素性RP可能是原發性RP的早期表現[12]，因此先證者視網膜色素沉著可能隨病情進展而出現。此類RP早期臨床極易漏診或誤診，應常規行眼底AF、電生理、基因測序等檢查。本例患者眼底AF可見鼻下象限視網膜弱AF；對應顳上方視野缺失；RPE萎縮以視盤周圍及鼻下方視網膜最為嚴重，而顳側及上方離病灶較遠處的視網膜相對正常；ICGA示下方脈絡膜萎縮；ERG視錐、視桿系統反應均降低；且黃斑SD-OCT可見變性區光感受器層消失，而顳側非變性區光感受器結構存在。以上結果說明患者視網膜變性以鼻下象限為主，符合sector RP診斷。作為一種非典型RP，sector RP有更輕的臨床表型和更好的預后，最典型特征是視網膜變性主要局限于1～2個象限，且主要以下方視網膜為主，這可能與日常光照來源于頭頂導致下方視網膜暴露于更多光刺激有關[13-14]。光暴露可引起自由基介導的細胞凋亡[13-16]，在視紫紅質（RHO）基因變異所致RP動物模型中，光剝奪可減緩視網膜變性速度[17]，進一步說明光暴露對光感受器的損傷。這提示因此RP患者應盡量減少暴露于強光中。
此外，本研究中先證者存在視野缺損、橢圓體帶缺失、ERG異常且ICGA晚期視網膜下方呈片狀弱熒光陰影區域，與急性區域性隱匿性外層視網膜病變（AZOOR）特征較為相似，需與之鑒別。AZOOR是一種視網膜外層功能障礙性病變，好發于年輕女性，多急性起病，多數患者為單眼發病，且超過90%的AZOOR患者FFA無明顯異常[18]。
本研究采用二代測序、Sanger測序及qPCR技術，對先證者相關基因及其突變位點進行鑒定，結果顯示，患者SPATA7基因的第10號外顯子錯義突變c.1112T>C（p.Ile371Thr）和同源染色體第10號外顯子缺失。SPATA7基因在物種進化中具有高度保守性，編碼一種纖毛蛋白，主要表達于光感受器的連接纖毛處，可與另一種纖毛蛋白RPGRIP1的N端區域相互作用形成復合物，對RHO和其他纖毛蛋白起到引導定位作用。此外，光感受器連接纖毛處的纖毛蛋白眾多，如RPGR、USH2A、CEP290、NPHP4等，它們可形成纖毛蛋白復合體，對光感受器內外節之間的物質運輸起著十分重要的作用，任一基因的缺失均有可能引起視網膜病變。研究表明，敲除SPATA7基因可導致其他纖毛蛋白錯誤分布于連接纖毛的近段，并可導致RHO無法被運送至光感受器外節，表現為光感受器的進行性退化，外節無序并縮短，而其他視網膜神經元及RPE層無影響[19-21]。既往有報道SPATA7基因突變與LCA和青少年性RP有關[8, 22]，目前報道的SPATA7基因突變多數為無義突變或移碼突變[23]，錯義突變較少。本例先證者SPATA7基因錯義突變和CNV均位于第10號外顯子，蛋白質變異靠近C末端，而位于SPATA7蛋白C末端的突變可能會導致更輕微的臨床表型[8]。但有學者報道德國一血緣家庭兄妹二人均為SPATA7基因c.1112T>C純和錯義突變，但兩人臨床表型差異大，哥哥表現為嚴重RP，而妹妹僅表現為較輕微的CRD[9]。本研究中先證者也與上述文獻中患者的臨床表型不同。研究結果的多樣性說明SPATA7基因突變所致臨床表型的異質性，即使攜帶相同基因型，臨床表現也不盡相同。
目前已發現與sector RP相關的致病基因11個，包括常染色體顯性遺傳RHO[3, 24-25]、 IMPDH1[6]、RP1[6]；常染色體隱性遺傳USH1C[26]、MYO7A[6]、CDH23[27]、EYS[6, 28]、SAG[29-30]、RDH5[31]；X染色體連鎖遺傳PRPS1[6]、RPGR [24, 32]。3種遺傳模式患者的平均發病年齡分別為38.5、30.5、39.0歲[6]。本研究中先證者發病年齡15歲，遠小于上述文獻報道的發病年齡。此外，先證者近2年視力逐漸下降，雙眼BCVA均為0.4，低于sector RP患者的平均視力[6]，且眼底照相顯示黃斑區營養不良樣改變，眼底AF可見黃斑中心凹及視盤周圍弱AF區域與鼻下方視網膜之間存在明顯分界線，此分界線也成為ICGA晚期低灌注區的分界線。其原因可能與2處視網膜病變進展不同有關，分界線上方病灶存在一定程度RPE萎縮但脈絡膜無明顯萎縮；分界線下方則為RPE-Bruch膜-脈絡膜均萎縮。黃斑中心凹呈強AF，說明中心凹區域為高代謝狀態，意味此區域光感受器細胞可能正在逐漸死亡，導致自體熒光物質（脂褐素）的累積，而ERG檢查示明適應呈熄滅狀態進一步證明視錐細胞數量嚴重減少，我們認為這可能是疾病動態進展的表現。Georgiou等[6]對1例累及黃斑的sector RP患者進行了長達13.5年的隨訪，發現其病情進展及視力損害均更加嚴重。進一步說明當sector RP累及黃斑后，其臨床表現更重，病情進展也更快。
盡管近年來藥物、視網膜假體及干細胞治療等方法快速發展，但目前對于sector RP尚無有效治療方法。隨著測序技術發展和基因治療的進步，針對特定基因突變的編輯技術逐漸受到重視。在SPATA7基因敲除小鼠中行腺相關病毒8載體介導的基因替代治療顯示，與對照組比較，治療組小鼠光感受器存活率增加，ERG反應改善，并可挽救RHO的異常定位[33]，證明基因治療在SPATA7基因突變所致RP中具有治療前景。
本研究發現SPATA7基因可能與常染色體隱性sector RP相關，擴大了sector RP的基因突變頻譜，增加了SPATA7基因突變的臨床表型異質性，同時還觀察到sector RP可累及黃斑，造成黃斑營養不良，導致更嚴重的臨床表型，為sector RP的后續研究提供了思路。本課題組將繼續對此家系進行長期跟蹤隨訪，觀察病情進展，同時收集其他非典型RP家系資料，以進一步探索此類病變的形成機制。
