引用本文： 郭慶歌, 李亞, 游雅, 劉長庚, 李舒茵, 雷博. CEP290基因新變異相關單純視錐視桿細胞營養不良基因型與臨床表型分析. 中華眼底病雜志, 2022, 38(8): 650-655. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220706-00396 復制
CEP290基因變異導致的遺傳性視網膜疾病具有高度表型異質性，既可表現為非綜合征眼病，也可表現為累及全身的綜合征，臨床診斷較為困難。CEP290基因位于染色體12q21.32，跨越54個外顯子，其編碼一種相對分子質量290×103的中心體蛋白，參與纖毛的組裝和運輸。表型的異質性可能與變異蛋白對纖毛結構產生不同的影響有關[1-6]。CEP290基因變異所致的非綜合征眼病多數為Leber先天性黑矇（LCA）。但近年國外已有部分表型較輕的單純性CEP290基因相關視網膜變性報道，如早發性嚴重性視網膜營養不良（EOSRD）、視網膜色素變性（RP）、視錐視桿細胞營養不良（CORD）等[6-11]。而國內相關研究尚少。我們在一癥狀較輕的CORD家系中發現了CEP290基因2個新的變異位點，并通過生物信息學分析其致病性，同時對患者的臨床表型進行了觀察。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審核[批準號：HNEECKY-2019（15）]。研究過程遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年12月于河南省立眼科醫院就診并經基因檢查確診的1個CORD家系中的2例患者及2名家系成員納入本研究。詳細詢問病史和家族史，繪制家系圖（圖1）。受檢者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼壓、裂隙燈顯微鏡、彩色眼底照相、自身熒光（AF）、掃頻源光相干斷層掃描（SS-OCT）、自適應光學眼底成像、靜態閾值視野、全視野和多焦視網膜電圖（ERG）檢查。
圖1
CORD家系圖。采集受檢者的外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用自主設計研發的包含有376個遺傳性視網膜疾病致病基因的檢測試劑盒（PS400）對先證者行外顯子區和相鄰內含子區域（50 bp）及已知內含子突變檢測[12-15]。構建目的基因DNA文庫（150～200 bp），富集后應用美國Illumina公司Illumina NovaSeq 6000測序儀進行雙端測序，平均測序深度200×。采用BWA軟件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）對測序數據進行比對拼接，參考人類基因組為hg19，提取單核苷酸多態性、刪除和插入變異、錯義突變。應用人群基因頻率數據庫（gnomAD，https://gnomad.broadinstitute.org/）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）收錄信息進行對比。采用在線分析工具Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）對變異位點的致病性進行預測；采用GERP++、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、Weblogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）等軟件對變異位點進行保守性分析。對候選致病基因變異采用Sanger測序，進一步在家系成員中進行基因型和表型的共分離驗證。參照美國醫學遺傳學和基因組學學會（ACMG）指南[16]對變異位點的致病性進行分析。
2 結果
先證者（Ⅱ-1），男，29歲。雙眼視力下降20年。全身系統性檢查無異常。雙眼無明顯眼球震顫。BCVA：右眼＋0.5/－0.75×20→0.3，左眼＋0.25/－0.5×165→0.4。雙眼眼前節無明顯異常。雙眼黃斑區顏色晦暗，中心凹反光消失；視網膜未見明顯色素沉著（圖2A）。眼底AF檢查，雙眼黃斑中心凹弱熒光背景下強熒光斑點（圖2B）。SS-OCT檢查，雙眼黃斑區外核層變薄，橢圓體帶及嵌合體帶光反射信號減弱（圖2C）。自適應光學眼底成像，雙眼黃斑中心10°視角內視錐細胞光反射信號失常、密度降低，部分區域視錐細胞萎縮透見視網膜色素上皮細胞（圖2D，2E）。靜態閾值視野檢查，雙眼呈不規則暗點（圖2F）。全視野、多焦ERG檢查，雙眼視錐細胞功能嚴重降低，視桿細胞功能中度降低（圖2G，2H）。其弟弟（Ⅱ-2），21歲。雙眼視力下降10余年。全身系統性檢查無異常。左眼眼球震顫。BCVA：右眼－5.25/－2×10→0.7，左眼－5.5/－2×180→0.4。雙眼呈豹紋狀眼底改變，其余表現同先證者。其父親（Ⅰ-1）全身及眼部檢查無異常；母親（Ⅰ-2）除雙眼高度近視外，其余眼部及全身檢查無明顯異常。
圖2
CORD家系先證者（Ⅱ-1）左眼眼部檢查像。2A示彩色眼底像，視網膜無明顯色素沉著。2B示AF像，黃斑中心凹表現為弱熒光背景下的強熒光斑點。2C示SS-OCT像，黃斑區橢圓體帶及嵌合體帶光反射信號減弱。2D示自適應光學眼底成像，黃斑中心10°視角內視錐細胞光反射信號失常、密度降低；2E為2D右下角紅色方框4°視角的放大像，部分區域視錐細胞萎縮透見RPE（白箭）。2F示視野檢查灰度圖，30°視野內多個不規則暗點。2G示多焦ERG檢查結果，視錐細胞功能嚴重降低。2H示全視野ERG檢查結果，視錐細胞功能嚴重降低，視桿細胞功能中度降低。CORD：視錐視桿細胞營養不良；AF：自身熒光；SS-OCT：掃頻源光相干斷層掃描；RPE：視網膜色素上皮；ERG：視網膜電圖
基因檢測結果顯示，先證者（Ⅱ-1）及其弟弟（Ⅱ-2）均攜帶CEP290 c.950T>A（p.Leu317*）（M1）、c.4144_4149del （p.Tyr1382_Glu1383del）（M2）復合雜合突變。其父親、母親（Ⅰ-1、Ⅰ-2）分別攜帶M2、M1（圖3）。M1、M2在gnomAD、ExAC、千人基因組計劃等數據庫中未見。M1為新發現無義突變，M2為新發現缺失突變，分別位于chr12-88520208、chr12-88481601。M1：Mutation Taster、CADD軟件預測該變異位點為有害，GERP++顯示其影響的氨基酸高度保守（圖4）。根據ACMG指南，評估該變異位點為疑似致病性變異（PVS1+PM2）。M2根據ACMG指南，評估其致病性為臨床意義未明變異（PM4+PM2）。先證者父母臨床表型未見明顯異常。Sanger測序驗證，符合家系共分離。
圖3
CORD家系先證者及其家系成員基因Sanger測序圖。3A示先證者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其母親（I-2）均攜帶M1：CEP290 c.950T＞A（p.Leu317*）變異；3B示先證者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其父親（I-1）均攜帶M2：CEP290 c.4144_4149del（p.Tyr1382_Glu1383del）變異。CORD：視錐視桿細胞營養不良
圖4
物種間序列保守性分析。4A、4B分別示Clustal Omega、Weblogo的分析結果。CEP290 p.Leu317*、p.Tyr1382_Glu1383del分別所對應的第317、1 382～1 383號氨基酸序列位點在斑馬魚、雞、小鼠、大鼠、豬、牛、人、狗、馬等物種中高度保守（紅色線框、紅箭）
3 討論
本研究中2例CORD患者均攜帶M1、M2復合雜合突變，但眼部表型較輕，相對于CEP290基因相關的LCA或EOSRD，患者具有更好的視力及可記錄到的ERG波形；SS-OCT檢查可見黃斑部結構輕度異常。
CEP290基因變異所致的非綜合征眼病多為LCA，多數患者出生時或出生不久即已失明，相對較輕的表型稱為EOSRD[2-3, 6]。目前已發現，與LCA相關的14個致病基因中CEP290較為常見[17]。CEP290基因最常見突變位點是c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）內含子變異，主要出現在歐洲西北部和美國，占所有LCA患者的26%[3, 18]。該突變位點常導致較重的表型[2]，患者出生后即表現出嚴重視力損害、眼球震顫、遠視、不可記錄的ERG波形、異常瞳孔反應以及明顯的眼底異常[19-20]，但病程進展緩慢[21-22]。國內該突變位點出現較少[20]。
c.2991+1655A>G純合子變異的患者傾向于具有較輕的視網膜表型[19]。但一項針對德裔患者的研究顯示，該純合變異患者較攜帶該內含子變異的復合雜合子患者表現出更嚴重的表型[23]。Chen等[1]報道1例攜帶CEP290 c.3310-1_3313delGCTTA、c.1666dupA復合雜合變異的LCA女性患兒，出生后5個月即檢測到ERG嚴重異常。而Vilaplana等[6]報道1例CEP290 c.4028delA、c.5254C>T復合雜合致病變異相關CORD女性患者，57歲時仍保留20/100的視力。 Rafalska等[24]發現，CEP290基因4號內含子C.250+2T>C和第51外顯子c.7027del復合雜合變異女性RP患者，30歲時仍有較好的黃斑中心凹解剖結構及中心視力。Barny等[25]報道攜帶c.1824+3A>G、c.6869dup 復合雜合變異的兩兄妹具有相對輕微的視網膜營養不良表現，保留較好的中心視力。Birtel等[26]報道1例12號外顯子c.982C>T和26號內含子c.2991+1655A>G復合雜合變異的女性患者，27歲時診斷為RP，70歲時視力仍有光感。
CEP290基因相關視網膜變性患者的視力與基因型、年齡、黃斑中心殘留光感受器層厚度無顯著相關性[27-28]。但也有研究顯示，不伴眼球震顫的患者中央視網膜厚度保留更多，具有更好的視力[2]。盡管CEP290基因突變引起不同表型的原因尚不明確，但有研究者認為，CEP290基因多效性的起源不是突變對蛋白質功能的影響，而是與攜帶CEP290基因變異的細胞中保存部分或者全長CEP290蛋白的表達量有關[11, 29-30]。在c.2991+1655A>G變異的LCA患者淋巴母細胞或成纖維細胞中檢測到的功能性CEP290蛋白含量減少約50% [19]。攜帶CEP290基因變異的成纖維細胞形成纖毛結構的能力降低，而慢病毒載體轉導的CEP290基因能夠彌補這種纖毛形成的缺陷[31]。
CEP290基因突變導致的遺傳性視網膜疾病具有高度表型異質性。本研究確定了CEP290基因相關CORD新的復合雜合變異，拓寬了CEP290基因的致病基因譜。患者臨床表型較輕，視錐、視桿細胞功能下降，黃斑區視錐細胞出現結構異常和密度下降時僅有輕度視覺損傷。相比國外發生率較高的內含子變異，本研究報道的新變異可引起相對較輕但在高分辨率影像檢查中可見的視網膜結構改變。
CEP290基因變異導致的遺傳性視網膜疾病具有高度表型異質性，既可表現為非綜合征眼病，也可表現為累及全身的綜合征，臨床診斷較為困難。CEP290基因位于染色體12q21.32，跨越54個外顯子，其編碼一種相對分子質量290×103的中心體蛋白，參與纖毛的組裝和運輸。表型的異質性可能與變異蛋白對纖毛結構產生不同的影響有關[1-6]。CEP290基因變異所致的非綜合征眼病多數為Leber先天性黑矇（LCA）。但近年國外已有部分表型較輕的單純性CEP290基因相關視網膜變性報道，如早發性嚴重性視網膜營養不良（EOSRD）、視網膜色素變性（RP）、視錐視桿細胞營養不良（CORD）等[6-11]。而國內相關研究尚少。我們在一癥狀較輕的CORD家系中發現了CEP290基因2個新的變異位點，并通過生物信息學分析其致病性，同時對患者的臨床表型進行了觀察。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性研究。本研究經河南省立眼科醫院倫理委員會審核[批準號：HNEECKY-2019（15）]。研究過程遵循《赫爾辛基宣言》原則；所有受檢者均獲知情并簽署書面知情同意書。
2021年12月于河南省立眼科醫院就診并經基因檢查確診的1個CORD家系中的2例患者及2名家系成員納入本研究。詳細詢問病史和家族史，繪制家系圖（圖1）。受檢者均行最佳矯正視力（BCVA）、眼壓、裂隙燈顯微鏡、彩色眼底照相、自身熒光（AF）、掃頻源光相干斷層掃描（SS-OCT）、自適應光學眼底成像、靜態閾值視野、全視野和多焦視網膜電圖（ERG）檢查。
圖1
CORD家系圖。采集受檢者的外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用自主設計研發的包含有376個遺傳性視網膜疾病致病基因的檢測試劑盒（PS400）對先證者行外顯子區和相鄰內含子區域（50 bp）及已知內含子突變檢測[12-15]。構建目的基因DNA文庫（150～200 bp），富集后應用美國Illumina公司Illumina NovaSeq 6000測序儀進行雙端測序，平均測序深度200×。采用BWA軟件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）對測序數據進行比對拼接，參考人類基因組為hg19，提取單核苷酸多態性、刪除和插入變異、錯義突變。應用人群基因頻率數據庫（gnomAD，https://gnomad.broadinstitute.org/）、千人基因組計劃數據庫（http://www.1000genomes.org/）、ExAC數據庫（http://exac.broadinstitute.org/）收錄信息進行對比。采用在線分析工具Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）對變異位點的致病性進行預測；采用GERP++、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、Weblogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）等軟件對變異位點進行保守性分析。對候選致病基因變異采用Sanger測序，進一步在家系成員中進行基因型和表型的共分離驗證。參照美國醫學遺傳學和基因組學學會（ACMG）指南[16]對變異位點的致病性進行分析。
2 結果
先證者（Ⅱ-1），男，29歲。雙眼視力下降20年。全身系統性檢查無異常。雙眼無明顯眼球震顫。BCVA：右眼＋0.5/－0.75×20→0.3，左眼＋0.25/－0.5×165→0.4。雙眼眼前節無明顯異常。雙眼黃斑區顏色晦暗，中心凹反光消失；視網膜未見明顯色素沉著（圖2A）。眼底AF檢查，雙眼黃斑中心凹弱熒光背景下強熒光斑點（圖2B）。SS-OCT檢查，雙眼黃斑區外核層變薄，橢圓體帶及嵌合體帶光反射信號減弱（圖2C）。自適應光學眼底成像，雙眼黃斑中心10°視角內視錐細胞光反射信號失常、密度降低，部分區域視錐細胞萎縮透見視網膜色素上皮細胞（圖2D，2E）。靜態閾值視野檢查，雙眼呈不規則暗點（圖2F）。全視野、多焦ERG檢查，雙眼視錐細胞功能嚴重降低，視桿細胞功能中度降低（圖2G，2H）。其弟弟（Ⅱ-2），21歲。雙眼視力下降10余年。全身系統性檢查無異常。左眼眼球震顫。BCVA：右眼－5.25/－2×10→0.7，左眼－5.5/－2×180→0.4。雙眼呈豹紋狀眼底改變，其余表現同先證者。其父親（Ⅰ-1）全身及眼部檢查無異常；母親（Ⅰ-2）除雙眼高度近視外，其余眼部及全身檢查無明顯異常。
圖2
CORD家系先證者（Ⅱ-1）左眼眼部檢查像。2A示彩色眼底像，視網膜無明顯色素沉著。2B示AF像，黃斑中心凹表現為弱熒光背景下的強熒光斑點。2C示SS-OCT像，黃斑區橢圓體帶及嵌合體帶光反射信號減弱。2D示自適應光學眼底成像，黃斑中心10°視角內視錐細胞光反射信號失常、密度降低；2E為2D右下角紅色方框4°視角的放大像，部分區域視錐細胞萎縮透見RPE（白箭）。2F示視野檢查灰度圖，30°視野內多個不規則暗點。2G示多焦ERG檢查結果，視錐細胞功能嚴重降低。2H示全視野ERG檢查結果，視錐細胞功能嚴重降低，視桿細胞功能中度降低。CORD：視錐視桿細胞營養不良；AF：自身熒光；SS-OCT：掃頻源光相干斷層掃描；RPE：視網膜色素上皮；ERG：視網膜電圖
基因檢測結果顯示，先證者（Ⅱ-1）及其弟弟（Ⅱ-2）均攜帶CEP290 c.950T>A（p.Leu317*）（M1）、c.4144_4149del （p.Tyr1382_Glu1383del）（M2）復合雜合突變。其父親、母親（Ⅰ-1、Ⅰ-2）分別攜帶M2、M1（圖3）。M1、M2在gnomAD、ExAC、千人基因組計劃等數據庫中未見。M1為新發現無義突變，M2為新發現缺失突變，分別位于chr12-88520208、chr12-88481601。M1：Mutation Taster、CADD軟件預測該變異位點為有害，GERP++顯示其影響的氨基酸高度保守（圖4）。根據ACMG指南，評估該變異位點為疑似致病性變異（PVS1+PM2）。M2根據ACMG指南，評估其致病性為臨床意義未明變異（PM4+PM2）。先證者父母臨床表型未見明顯異常。Sanger測序驗證，符合家系共分離。
圖3
CORD家系先證者及其家系成員基因Sanger測序圖。3A示先證者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其母親（I-2）均攜帶M1：CEP290 c.950T＞A（p.Leu317*）變異；3B示先證者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其父親（I-1）均攜帶M2：CEP290 c.4144_4149del（p.Tyr1382_Glu1383del）變異。CORD：視錐視桿細胞營養不良
圖4
物種間序列保守性分析。4A、4B分別示Clustal Omega、Weblogo的分析結果。CEP290 p.Leu317*、p.Tyr1382_Glu1383del分別所對應的第317、1 382～1 383號氨基酸序列位點在斑馬魚、雞、小鼠、大鼠、豬、牛、人、狗、馬等物種中高度保守（紅色線框、紅箭）
3 討論
本研究中2例CORD患者均攜帶M1、M2復合雜合突變，但眼部表型較輕，相對于CEP290基因相關的LCA或EOSRD，患者具有更好的視力及可記錄到的ERG波形；SS-OCT檢查可見黃斑部結構輕度異常。
CEP290基因變異所致的非綜合征眼病多為LCA，多數患者出生時或出生不久即已失明，相對較輕的表型稱為EOSRD[2-3, 6]。目前已發現，與LCA相關的14個致病基因中CEP290較為常見[17]。CEP290基因最常見突變位點是c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）內含子變異，主要出現在歐洲西北部和美國，占所有LCA患者的26%[3, 18]。該突變位點常導致較重的表型[2]，患者出生后即表現出嚴重視力損害、眼球震顫、遠視、不可記錄的ERG波形、異常瞳孔反應以及明顯的眼底異常[19-20]，但病程進展緩慢[21-22]。國內該突變位點出現較少[20]。
c.2991+1655A>G純合子變異的患者傾向于具有較輕的視網膜表型[19]。但一項針對德裔患者的研究顯示，該純合變異患者較攜帶該內含子變異的復合雜合子患者表現出更嚴重的表型[23]。Chen等[1]報道1例攜帶CEP290 c.3310-1_3313delGCTTA、c.1666dupA復合雜合變異的LCA女性患兒，出生后5個月即檢測到ERG嚴重異常。而Vilaplana等[6]報道1例CEP290 c.4028delA、c.5254C>T復合雜合致病變異相關CORD女性患者，57歲時仍保留20/100的視力。 Rafalska等[24]發現，CEP290基因4號內含子C.250+2T>C和第51外顯子c.7027del復合雜合變異女性RP患者，30歲時仍有較好的黃斑中心凹解剖結構及中心視力。Barny等[25]報道攜帶c.1824+3A>G、c.6869dup 復合雜合變異的兩兄妹具有相對輕微的視網膜營養不良表現，保留較好的中心視力。Birtel等[26]報道1例12號外顯子c.982C>T和26號內含子c.2991+1655A>G復合雜合變異的女性患者，27歲時診斷為RP，70歲時視力仍有光感。
CEP290基因相關視網膜變性患者的視力與基因型、年齡、黃斑中心殘留光感受器層厚度無顯著相關性[27-28]。但也有研究顯示，不伴眼球震顫的患者中央視網膜厚度保留更多，具有更好的視力[2]。盡管CEP290基因突變引起不同表型的原因尚不明確，但有研究者認為，CEP290基因多效性的起源不是突變對蛋白質功能的影響，而是與攜帶CEP290基因變異的細胞中保存部分或者全長CEP290蛋白的表達量有關[11, 29-30]。在c.2991+1655A>G變異的LCA患者淋巴母細胞或成纖維細胞中檢測到的功能性CEP290蛋白含量減少約50% [19]。攜帶CEP290基因變異的成纖維細胞形成纖毛結構的能力降低，而慢病毒載體轉導的CEP290基因能夠彌補這種纖毛形成的缺陷[31]。
CEP290基因突變導致的遺傳性視網膜疾病具有高度表型異質性。本研究確定了CEP290基因相關CORD新的復合雜合變異，拓寬了CEP290基因的致病基因譜。患者臨床表型較輕，視錐、視桿細胞功能下降，黃斑區視錐細胞出現結構異常和密度下降時僅有輕度視覺損傷。相比國外發生率較高的內含子變異，本研究報道的新變異可引起相對較輕但在高分辨率影像檢查中可見的視網膜結構改變。
