引用本文： 陳偉彬, 趙明威, 苗恒. 兔眼玻璃體腔連續注射不同劑量更昔洛韋視網膜毒性研究. 中華眼底病雜志, 2022, 38(11): 916-924. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20211201-00672 復制
更昔洛韋在治療巨細胞病毒性視網膜炎（CMVR）、急性視網膜壞死等病毒性視網膜炎中具有重要作用。但長期、大量、全身應用會帶來骨髓抑制等毒副作用，因此玻璃體腔注射更昔洛韋（IVG）成為越來越多臨床醫生的選擇。目前，IVG治療CMVR的最佳劑量和頻率尚存在爭議。經典治療劑量為單次2～3 mg/0.05 ml[1-5]。但也有學者建議使用大劑量IVG以避免耐藥性并降低注藥頻率、減少注藥次數[6-8]。IVG對視網膜是否存在毒性作用及其最大安全劑量尚不明確。有研究表明，IVG 300～600 μg即可導致兔眼電生理出現異常[9]，但也有兔眼單次IVG 400 μg甚至2 mg后仍未觀察到視網膜功能異常的報道[10]。另有研究顯示，硅油填充兔眼IVG 200 μg也未觀察到視網膜組織學結構和電生理指標異常[11]。此外，現有相關研究均為觀察單次玻璃體腔注射的藥物毒性，并不能真實反應臨床上連續多次玻璃體腔注藥的劑量累積效應帶來的潛在毒性作用。本研究擬初步探索兔眼玻璃體腔單次注射更昔洛韋的安全劑量范圍，并模擬兩種IVG方案，觀察不同劑量更昔洛韋連續玻璃體腔注射對健康兔眼視網膜形態和功能的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雄性新西蘭無色素兔，體重1.5～2.0 kg，由北京大學人民醫院動物房提供[合格證號：SYXK（京）2021-0011]，散瞳后裂隙燈顯微鏡和間接檢眼鏡檢查確定雙眼均為健康眼。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得北京大學人民醫院實驗動物倫理委員會許可（倫理編號：2021PHE043）。
采用隨機數字表法將10只健康新西蘭無色素兔平均分為5組，每組各2只兔，分別給予兔眼玻璃體腔注射1 mg/0.025 ml、2 mg/0.025 ml、5 mg/0.025 ml、10 mg/0.025 ml更昔洛韋及0.025 ml生理鹽水（對照組）。注藥過程中，肌肉注射7.5 mg/kg鹽酸替來他明與鹽酸唑拉西泮（1∶1，法國維克有限公司）麻醉兔，結膜囊滴用聚維酮碘（上海利康消毒高科技有限公司）1滴，30 s后生理鹽水沖洗。1 ml無菌胰島素注射器抽取不同劑量更昔洛韋或生理鹽水，于兔眼鼻上方角膜緣后2.5 mm垂直穿刺進入玻璃體腔，向眼球中心方向進針4 mm，將藥液或生理鹽水緩慢注入玻璃體腔，拔出針頭后局部棉簽壓迫，結膜囊涂氧氟沙星眼膏。
注藥1周后對兔眼行超廣角眼底照相（UWF，英國Optos公司200Tx激光掃描檢眼鏡視網膜成像系統）、光相干斷層掃描（OCT，北京圖湃公司TOPI BM-400K系統）、全視野視網膜電圖（ERG，德國Roland公司RETI眼電生理診斷系統）檢查。按照國際臨床視覺電生理學會推薦標準設定ERG檢查程序及反應參數[12]，并按照國際推薦動物ERG檢查方案進行操作[13]。暗適應條件下測定視桿細胞-視錐細胞最大混合反應（Max-R），明適應條件下測定視錐細胞反應（Cone-R）和30 Hz閃爍反應（30 Hz-R）。三項檢查指標的光強度級差均為0 dB。選取ERG波形，記錄Max-R和Cone-R a、b波振幅以及30 Hz-R振幅。
采用隨機數字表法將24只健康新西蘭無色素兔平均分為大劑量實驗組、大劑量對照組和小劑量實驗組、小劑量對照組，每組6只兔，以右眼為實驗眼。大劑量實驗組兔眼連續注射80 mg/ml更昔洛韋0.025 ml（含更昔洛韋2 mg），1次/周，共4次；大劑量對照組兔眼玻璃體腔注射生理鹽水0.025 ml，注射頻率同大劑量實驗組。小劑量實驗組兔眼注射40 mg/ml更昔洛韋0.025 ml（含更昔洛韋1 mg），誘導期為2次/周，共4次，維持期為1次/周，共2次；小劑量對照組兔眼玻璃體腔注射生理鹽水0.025 ml，注射頻率同小劑量實驗組。
每次IVG前1 d及末次IVG后1周行全視野ERG檢查；IVG前1 d及末次IVG后1周行超廣角彩色眼底照相（UWF）、光相干斷層掃描（OCT）檢查。末次IVG后1周深度麻醉處死各組實驗兔，摘除眼球。玻璃體腔注入2.5%戊二醛0.2 ml，4 ℃，固定15 min。沿角膜緣剪除角膜，取出晶狀體、玻璃體等眼內容物，室溫下將眼球浸泡于10%中性甲醛緩沖溶液中固定，常規石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察。
采用SPSS22.0軟件行統計分析。單個樣本數據正態分布采用Kolmogorov-Smirnov檢驗。呈正態分布的數據以均數±標準差（
±s）表示，采用Student t檢驗；非正態分布的數據以中位數（范圍）[M（IQR）]表示，采用兩獨立樣本非參數檢驗。所有檢驗采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
UWF及OCT檢查結果顯示，健康兔眼單次IVG 1 mg或2 mg后1周，視網膜未見出血、滲出，視網膜各層清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常；單次IVG 5 mg后1周，可見眼底血管堵塞，伴視網膜前出血，OCT檢查可見視網膜前強反射條帶；單次IVG 10 mg后1周，可見眼底血管堵塞、視網膜前出血或視網膜壞死，伴滲出性改變，OCT檢查可見壞死區域視網膜組織水腫、層次不清（圖1，2）。
圖1
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周超廣角彩色眼底像。1A、1B、1C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，均未見出現、滲出或其他異常改變；1D示IVG 5 mg，可見血管堵塞、視網膜前出血；1E示IVG 10 mg，可見血管堵塞、視網膜前出血；1F示IVG 10 mg，可見視網膜壞死，伴滲出性改變。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
圖2
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周光相干斷層掃描像。2A、2B、2C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，視網膜各層結構清晰連續，無水腫、滲出等改變；2D示單次IVG 5 mg，視網膜前強反射條帶；2E示單次IVG 10 mg，壞死區域視網膜層次不清、水腫、滲出。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
與對照組相比，兔眼單次IVG 1、2 mg后1周，未見ERG波形和振幅有明顯異常；單次IVG 5 mg后1周，ERG振幅稍有下降；單次IVG 10 mg后1周，ERG振幅下降更明顯（圖3）。
圖3
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周全視野ERG像。上中下圖分別代表Max-R、Cone-R、30 Hz-R。3A、3B、3C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，波形及振幅未見異常；3D示單次IVG 5 mg，振幅稍有下降；3E示單次IVG 10 mg，振幅下降明顯。ERG：視網膜電圖；IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
兔眼連續IVG后1周，與IVG前比較，小劑量實驗組、大劑量實驗組兔眼視網膜均未見出血、滲出（圖4）；視網膜各層結構清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常（圖5）。
圖4
兔眼連續IVG前后超廣角彩色眼底像。4A、4B和4C、4D分別示小劑量實驗組、大劑量實驗組IVG前、IVG后7 d。與IVG前比較，IVG后視網膜均未見出血、滲出或其他異常改變。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
圖5
兔眼連續IVG前后光相干斷層掃描像。5A、5B和5C、5D分別示小劑量實驗組、大劑量實驗組IVG前、IVG后7 d。與IVG前比較，IVG后視網膜各層結構清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
全視野ERG檢測結果顯示，每次IVG前1 d及末次IVG后1周，小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼Max-R、Cone-R的a波、b波振幅以及30 Hz-R振幅比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
小劑量實驗組、小劑量對照組兔眼初始及IVG后不同時間ERG振幅比較[μV，M（Q）]
表2
大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼初始及IVG不同時間ERG振幅比較[μV，M（Q）]
末次IVG后1周，小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼視網膜神經纖維層排列完整；外核層、內核層細胞排列致密，無明顯疏松改變，無破碎或細胞核減少；視網膜各層未見壞死、出血或其余病理改變（圖6）。
圖6
兔眼末次IVG后1周視網膜病理組織光學顯微鏡像。6A、6B和6C、6D分別示小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組。視網膜神經纖維層排列完整；外核層、內核層細胞排列致密，無明顯疏松改變，無破碎或細胞核減少；視網膜各層未見壞死、出血。 蘇木精-伊紅染色 ×100。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
3 討論
更昔洛韋是一種無環嘌呤核苷類似物，經病毒激酶催化產生更昔洛韋-5’-三磷酸，通過特異性結合CMV的DNA聚合酶抑制CMV-DNA復制，對單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒和CMV等均具有抗病毒活性[14-15]。但其全身應用可導致白細胞、血小板減少以及肝腎功能異常等并發癥[16]。因此對于血液CMV-DNA陰性患者，IVG已成為治療CMVR最重要的治療手段[4]。由于更昔洛韋在人眼玻璃體腔中的半衰期約為18.8 h且對CMV的50%抑制濃度（IC50）約為1 mg/L[17]，單次2 mg IVG后7 d時玻璃體腔藥物濃度低于1 mg/L，因此2 mg IVG每周1次作為維持治療被廣泛應用于各種皰疹病毒性視網膜炎，而誘導階段則需加倍給藥頻率以迅速提高眼內藥物濃度。雖然已有研究證實該方案的有效性和安全性[2-3]，但該方案依然存在較多不足：（1）注藥頻率較高，特別是誘導階段，而頻繁診治過程會給全身情況不佳的免疫缺陷人群帶來諸多不便和負擔；（2）IVG 2 mg后5 d眼內藥物濃度即降至CMV的IC50的量級左右，極大地降低了眼內病毒復制的抑制作用；（3）持續較低濃度的更昔洛韋更易引起病毒耐藥[18-19]。因此，大劑量、低頻率的治療方案被越來越多學者提出并推薦[7]。
Zhang等[5]對于CMVR的治療方案是單次IVG 3 mg，2次/周，共4次（誘導階段），其后1次/周（維持階段）。Qian等[7]則采用首次6 mg的治療方案以減少注藥次數。Arevalo等[6]也建議使用5 mg治療劑量以減少CMV耐藥性的產生。不過大劑量IVG是否對視網膜存在毒性依然存在爭議。雖然已有基于人眼的臨床研究表明，單次IVG 6 mg通常不會帶來明顯的視網膜毒性作用[7, 20]；但也有學者認為，高劑量（4～6 mg）IVG可導致眼內結晶形成，甚至直接導致黃斑部光感受器損傷和視野缺損[21]。動物實驗方面，IVG 300～600 μg即可引起兔眼電生理和視網膜結構改變[9]。但Berthe等[22]則指出兔眼IVG 500 μg后，電生理及視網膜組織病理檢查未見異常。狄宇等[10]發現兔眼IVG 400 μg未見視網膜毒性，但劑量增加至2 mg時則可見組織學變化。值得注意的是，上述研究設計均未考慮人眼與兔眼玻璃體腔容積的差異而帶來的注藥后眼內藥物濃度的差異，也未考慮或描述眼內注藥時進針深度對藥物在玻璃體腔內分布的影響，因而無法完全模擬臨床上連續多次玻璃體腔藥物注射的劑量累積效應帶來的潛在視網膜毒性作用。
由于人眼玻璃體腔容積（4.0～4.5 ml）約為兔眼（1.15～1.50 ml）的3倍[23-25]，因此人眼單次IVG 6 mg與兔眼IVG 2 mg后玻璃體腔內藥物濃度大致相當，人眼單次IVG 3 mg與兔眼IVG 1 mg后玻璃體腔內藥物濃度大致相當[26]。因此本研究大劑量實驗組和小劑量實驗組兔眼玻璃體腔注射劑量分別為2 mg和1 mg。兔眼眼軸長度約為（16.31±0.13）mm，晶狀體厚度約為（6.97±0.07）mm，前房深度約為（2.34±0.04）mm[27]。以此計算，兔眼晶狀體后囊至后極部視網膜距離僅約7 mm。因此，本研究兔眼玻璃體腔注射的進針深度為4 mm（此時針尖位于玻璃體腔中心位置）。既往研究表明，IVG治療骨髓移植后CMVR的中位治療時長為4周[5]，因此本研究將兔眼接受注射的總時長也設定為4周。
本研究首先探索了兔眼單次IVG的安全劑量范圍，發現在兔眼單次IVG 5 mg后1周可引起眼底血管堵塞、視網膜前出血；在兔眼單次IVG 10 mg后1周還可引起視網膜壞死及滲出性改變。不過在兔眼連續多次IVG 1 mg或2 mg后，超廣角眼底照相、OCT、視網膜病理組織學均未見視網膜結構改變，提示連續多次IVG 1 mg或2 mg不會對兔眼視網膜造成結構損害。ERG檢查中，Max-R b波振幅變化是判斷視網膜功能最可靠的客觀指標，也是評價玻璃體腔注藥后眼內不良反應的最主要指標[10]，而30 Hz-R是被認為能更早發現視網膜毒性的指標[22, 28]。本研究發現在兔眼連續多次IVG 1 mg或2 mg的干預過程中及干預后各時間節點均未見ERG的振幅較對照組有明顯差異，提示連續多次IVG 1 mg或2 mg未對兔眼視網膜造成功能損害。
狄宇等[10]研究中，IVG 2 mg的組織學變化主要是神經節細胞核周間隙增寬、內叢狀層淺染、內核層細胞排列疏松等內層視網膜的變化，且被認為與內層視網膜更接近玻璃體腔有關。目前IVG繼發視網膜毒性反應僅有少數病例報道[29-30]，且被認為與藥液離子強度和pH值改變（更昔洛韋溶液pH值約為10.14，而玻璃體pH值則在7.00左右）相關，而非更昔洛韋本身的毒性所致[29]。該研究中，玻璃體腔注藥時進針深度為6 mm，考慮到兔眼晶狀體后囊至后極部視網膜距離約7 mm[27]，此時針尖已與視網膜非常接近，注入眼內的藥液未與玻璃體充分混合便被直接推送至視網膜表面，引起局部pH值迅速升高，可對內層視網膜帶來近似堿燒傷的組織損害。本研究考慮兔眼直徑較人眼更小，注藥時注射器僅往玻璃體腔推進4 mm，此時針尖懸停于玻璃體中心位置，緩慢推注藥液時，更昔洛韋可與玻璃體充分混合后再彌散分布至視網膜內表面，極大地避免了局部pH值大幅波動帶來的毒性作用，這可能是本研究未見IVG視網膜毒性的原因之一。
盡管更昔洛韋半衰期僅為18.8 h，理論上每周1次的注射頻率不存在藥物累積，但既往相關實驗均設計為單次給藥后觀察ERG或組織學變化，與臨床實際使用方法存在較大差異。本研究結果顯示，連續多次IVG并未對兔眼視網膜結構和功能造成任何不良影響，且大劑量實驗組和小劑量實驗組均如此，進一步證實IVG重復治療的安全性。
本研究不足是未能對6 mm進針和4 mm進針的差異進行觀察，且實驗組兔眼未行電子顯微鏡觀察。考慮大小劑量實驗組兔眼OCT、ERG和組織病理切片均未見顯著異常改變，即便超微結構存在細微差異也不足以影響視網膜功能，因此本研究結果切實可信。盡管動物實驗不能完全取代臨床試驗，但本研究結果依然為臨床上IVG的應用提供了更多參考依據。
更昔洛韋在治療巨細胞病毒性視網膜炎（CMVR）、急性視網膜壞死等病毒性視網膜炎中具有重要作用。但長期、大量、全身應用會帶來骨髓抑制等毒副作用，因此玻璃體腔注射更昔洛韋（IVG）成為越來越多臨床醫生的選擇。目前，IVG治療CMVR的最佳劑量和頻率尚存在爭議。經典治療劑量為單次2～3 mg/0.05 ml[1-5]。但也有學者建議使用大劑量IVG以避免耐藥性并降低注藥頻率、減少注藥次數[6-8]。IVG對視網膜是否存在毒性作用及其最大安全劑量尚不明確。有研究表明，IVG 300～600 μg即可導致兔眼電生理出現異常[9]，但也有兔眼單次IVG 400 μg甚至2 mg后仍未觀察到視網膜功能異常的報道[10]。另有研究顯示，硅油填充兔眼IVG 200 μg也未觀察到視網膜組織學結構和電生理指標異常[11]。此外，現有相關研究均為觀察單次玻璃體腔注射的藥物毒性，并不能真實反應臨床上連續多次玻璃體腔注藥的劑量累積效應帶來的潛在毒性作用。本研究擬初步探索兔眼玻璃體腔單次注射更昔洛韋的安全劑量范圍，并模擬兩種IVG方案，觀察不同劑量更昔洛韋連續玻璃體腔注射對健康兔眼視網膜形態和功能的影響。現將結果報道如下。
1 材料和方法
健康雄性新西蘭無色素兔，體重1.5～2.0 kg，由北京大學人民醫院動物房提供[合格證號：SYXK（京）2021-0011]，散瞳后裂隙燈顯微鏡和間接檢眼鏡檢查確定雙眼均為健康眼。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得北京大學人民醫院實驗動物倫理委員會許可（倫理編號：2021PHE043）。
采用隨機數字表法將10只健康新西蘭無色素兔平均分為5組，每組各2只兔，分別給予兔眼玻璃體腔注射1 mg/0.025 ml、2 mg/0.025 ml、5 mg/0.025 ml、10 mg/0.025 ml更昔洛韋及0.025 ml生理鹽水（對照組）。注藥過程中，肌肉注射7.5 mg/kg鹽酸替來他明與鹽酸唑拉西泮（1∶1，法國維克有限公司）麻醉兔，結膜囊滴用聚維酮碘（上海利康消毒高科技有限公司）1滴，30 s后生理鹽水沖洗。1 ml無菌胰島素注射器抽取不同劑量更昔洛韋或生理鹽水，于兔眼鼻上方角膜緣后2.5 mm垂直穿刺進入玻璃體腔，向眼球中心方向進針4 mm，將藥液或生理鹽水緩慢注入玻璃體腔，拔出針頭后局部棉簽壓迫，結膜囊涂氧氟沙星眼膏。
注藥1周后對兔眼行超廣角眼底照相（UWF，英國Optos公司200Tx激光掃描檢眼鏡視網膜成像系統）、光相干斷層掃描（OCT，北京圖湃公司TOPI BM-400K系統）、全視野視網膜電圖（ERG，德國Roland公司RETI眼電生理診斷系統）檢查。按照國際臨床視覺電生理學會推薦標準設定ERG檢查程序及反應參數[12]，并按照國際推薦動物ERG檢查方案進行操作[13]。暗適應條件下測定視桿細胞-視錐細胞最大混合反應（Max-R），明適應條件下測定視錐細胞反應（Cone-R）和30 Hz閃爍反應（30 Hz-R）。三項檢查指標的光強度級差均為0 dB。選取ERG波形，記錄Max-R和Cone-R a、b波振幅以及30 Hz-R振幅。
采用隨機數字表法將24只健康新西蘭無色素兔平均分為大劑量實驗組、大劑量對照組和小劑量實驗組、小劑量對照組，每組6只兔，以右眼為實驗眼。大劑量實驗組兔眼連續注射80 mg/ml更昔洛韋0.025 ml（含更昔洛韋2 mg），1次/周，共4次；大劑量對照組兔眼玻璃體腔注射生理鹽水0.025 ml，注射頻率同大劑量實驗組。小劑量實驗組兔眼注射40 mg/ml更昔洛韋0.025 ml（含更昔洛韋1 mg），誘導期為2次/周，共4次，維持期為1次/周，共2次；小劑量對照組兔眼玻璃體腔注射生理鹽水0.025 ml，注射頻率同小劑量實驗組。
每次IVG前1 d及末次IVG后1周行全視野ERG檢查；IVG前1 d及末次IVG后1周行超廣角彩色眼底照相（UWF）、光相干斷層掃描（OCT）檢查。末次IVG后1周深度麻醉處死各組實驗兔，摘除眼球。玻璃體腔注入2.5%戊二醛0.2 ml，4 ℃，固定15 min。沿角膜緣剪除角膜，取出晶狀體、玻璃體等眼內容物，室溫下將眼球浸泡于10%中性甲醛緩沖溶液中固定，常規石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察。
采用SPSS22.0軟件行統計分析。單個樣本數據正態分布采用Kolmogorov-Smirnov檢驗。呈正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，采用Student t檢驗；非正態分布的數據以中位數（范圍）[M（IQR）]表示，采用兩獨立樣本非參數檢驗。所有檢驗采用雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
UWF及OCT檢查結果顯示，健康兔眼單次IVG 1 mg或2 mg后1周，視網膜未見出血、滲出，視網膜各層清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常；單次IVG 5 mg后1周，可見眼底血管堵塞，伴視網膜前出血，OCT檢查可見視網膜前強反射條帶；單次IVG 10 mg后1周，可見眼底血管堵塞、視網膜前出血或視網膜壞死，伴滲出性改變，OCT檢查可見壞死區域視網膜組織水腫、層次不清（圖1，2）。
圖1
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周超廣角彩色眼底像。1A、1B、1C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，均未見出現、滲出或其他異常改變；1D示IVG 5 mg，可見血管堵塞、視網膜前出血；1E示IVG 10 mg，可見血管堵塞、視網膜前出血；1F示IVG 10 mg，可見視網膜壞死，伴滲出性改變。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
圖2
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周光相干斷層掃描像。2A、2B、2C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，視網膜各層結構清晰連續，無水腫、滲出等改變；2D示單次IVG 5 mg，視網膜前強反射條帶；2E示單次IVG 10 mg，壞死區域視網膜層次不清、水腫、滲出。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
與對照組相比，兔眼單次IVG 1、2 mg后1周，未見ERG波形和振幅有明顯異常；單次IVG 5 mg后1周，ERG振幅稍有下降；單次IVG 10 mg后1周，ERG振幅下降更明顯（圖3）。
圖3
兔眼玻璃體腔單次注藥后1周全視野ERG像。上中下圖分別代表Max-R、Cone-R、30 Hz-R。3A、3B、3C分別示玻璃體腔注射生理鹽水及IVG 1、2 mg，波形及振幅未見異常；3D示單次IVG 5 mg，振幅稍有下降；3E示單次IVG 10 mg，振幅下降明顯。ERG：視網膜電圖；IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
兔眼連續IVG后1周，與IVG前比較，小劑量實驗組、大劑量實驗組兔眼視網膜均未見出血、滲出（圖4）；視網膜各層結構清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常（圖5）。
圖4
兔眼連續IVG前后超廣角彩色眼底像。4A、4B和4C、4D分別示小劑量實驗組、大劑量實驗組IVG前、IVG后7 d。與IVG前比較，IVG后視網膜均未見出血、滲出或其他異常改變。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
圖5
兔眼連續IVG前后光相干斷層掃描像。5A、5B和5C、5D分別示小劑量實驗組、大劑量實驗組IVG前、IVG后7 d。與IVG前比較，IVG后視網膜各層結構清晰連續，未見視網膜水腫或其他結構異常。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
全視野ERG檢測結果顯示，每次IVG前1 d及末次IVG后1周，小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼Max-R、Cone-R的a波、b波振幅以及30 Hz-R振幅比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表1，2）。
表1
小劑量實驗組、小劑量對照組兔眼初始及IVG后不同時間ERG振幅比較[μV，M（Q）]
表2
大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼初始及IVG不同時間ERG振幅比較[μV，M（Q）]
末次IVG后1周，小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組兔眼視網膜神經纖維層排列完整；外核層、內核層細胞排列致密，無明顯疏松改變，無破碎或細胞核減少；視網膜各層未見壞死、出血或其余病理改變（圖6）。
圖6
兔眼末次IVG后1周視網膜病理組織光學顯微鏡像。6A、6B和6C、6D分別示小劑量實驗組、小劑量對照組和大劑量實驗組、大劑量對照組。視網膜神經纖維層排列完整；外核層、內核層細胞排列致密，無明顯疏松改變，無破碎或細胞核減少；視網膜各層未見壞死、出血。 蘇木精-伊紅染色 ×100。IVG：玻璃體腔注射更昔洛韋
3 討論
更昔洛韋是一種無環嘌呤核苷類似物，經病毒激酶催化產生更昔洛韋-5’-三磷酸，通過特異性結合CMV的DNA聚合酶抑制CMV-DNA復制，對單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒和CMV等均具有抗病毒活性[14-15]。但其全身應用可導致白細胞、血小板減少以及肝腎功能異常等并發癥[16]。因此對于血液CMV-DNA陰性患者，IVG已成為治療CMVR最重要的治療手段[4]。由于更昔洛韋在人眼玻璃體腔中的半衰期約為18.8 h且對CMV的50%抑制濃度（IC50）約為1 mg/L[17]，單次2 mg IVG后7 d時玻璃體腔藥物濃度低于1 mg/L，因此2 mg IVG每周1次作為維持治療被廣泛應用于各種皰疹病毒性視網膜炎，而誘導階段則需加倍給藥頻率以迅速提高眼內藥物濃度。雖然已有研究證實該方案的有效性和安全性[2-3]，但該方案依然存在較多不足：（1）注藥頻率較高，特別是誘導階段，而頻繁診治過程會給全身情況不佳的免疫缺陷人群帶來諸多不便和負擔；（2）IVG 2 mg后5 d眼內藥物濃度即降至CMV的IC50的量級左右，極大地降低了眼內病毒復制的抑制作用；（3）持續較低濃度的更昔洛韋更易引起病毒耐藥[18-19]。因此，大劑量、低頻率的治療方案被越來越多學者提出并推薦[7]。
Zhang等[5]對于CMVR的治療方案是單次IVG 3 mg，2次/周，共4次（誘導階段），其后1次/周（維持階段）。Qian等[7]則采用首次6 mg的治療方案以減少注藥次數。Arevalo等[6]也建議使用5 mg治療劑量以減少CMV耐藥性的產生。不過大劑量IVG是否對視網膜存在毒性依然存在爭議。雖然已有基于人眼的臨床研究表明，單次IVG 6 mg通常不會帶來明顯的視網膜毒性作用[7, 20]；但也有學者認為，高劑量（4～6 mg）IVG可導致眼內結晶形成，甚至直接導致黃斑部光感受器損傷和視野缺損[21]。動物實驗方面，IVG 300～600 μg即可引起兔眼電生理和視網膜結構改變[9]。但Berthe等[22]則指出兔眼IVG 500 μg后，電生理及視網膜組織病理檢查未見異常。狄宇等[10]發現兔眼IVG 400 μg未見視網膜毒性，但劑量增加至2 mg時則可見組織學變化。值得注意的是，上述研究設計均未考慮人眼與兔眼玻璃體腔容積的差異而帶來的注藥后眼內藥物濃度的差異，也未考慮或描述眼內注藥時進針深度對藥物在玻璃體腔內分布的影響，因而無法完全模擬臨床上連續多次玻璃體腔藥物注射的劑量累積效應帶來的潛在視網膜毒性作用。
由于人眼玻璃體腔容積（4.0～4.5 ml）約為兔眼（1.15～1.50 ml）的3倍[23-25]，因此人眼單次IVG 6 mg與兔眼IVG 2 mg后玻璃體腔內藥物濃度大致相當，人眼單次IVG 3 mg與兔眼IVG 1 mg后玻璃體腔內藥物濃度大致相當[26]。因此本研究大劑量實驗組和小劑量實驗組兔眼玻璃體腔注射劑量分別為2 mg和1 mg。兔眼眼軸長度約為（16.31±0.13）mm，晶狀體厚度約為（6.97±0.07）mm，前房深度約為（2.34±0.04）mm[27]。以此計算，兔眼晶狀體后囊至后極部視網膜距離僅約7 mm。因此，本研究兔眼玻璃體腔注射的進針深度為4 mm（此時針尖位于玻璃體腔中心位置）。既往研究表明，IVG治療骨髓移植后CMVR的中位治療時長為4周[5]，因此本研究將兔眼接受注射的總時長也設定為4周。
本研究首先探索了兔眼單次IVG的安全劑量范圍，發現在兔眼單次IVG 5 mg后1周可引起眼底血管堵塞、視網膜前出血；在兔眼單次IVG 10 mg后1周還可引起視網膜壞死及滲出性改變。不過在兔眼連續多次IVG 1 mg或2 mg后，超廣角眼底照相、OCT、視網膜病理組織學均未見視網膜結構改變，提示連續多次IVG 1 mg或2 mg不會對兔眼視網膜造成結構損害。ERG檢查中，Max-R b波振幅變化是判斷視網膜功能最可靠的客觀指標，也是評價玻璃體腔注藥后眼內不良反應的最主要指標[10]，而30 Hz-R是被認為能更早發現視網膜毒性的指標[22, 28]。本研究發現在兔眼連續多次IVG 1 mg或2 mg的干預過程中及干預后各時間節點均未見ERG的振幅較對照組有明顯差異，提示連續多次IVG 1 mg或2 mg未對兔眼視網膜造成功能損害。
狄宇等[10]研究中，IVG 2 mg的組織學變化主要是神經節細胞核周間隙增寬、內叢狀層淺染、內核層細胞排列疏松等內層視網膜的變化，且被認為與內層視網膜更接近玻璃體腔有關。目前IVG繼發視網膜毒性反應僅有少數病例報道[29-30]，且被認為與藥液離子強度和pH值改變（更昔洛韋溶液pH值約為10.14，而玻璃體pH值則在7.00左右）相關，而非更昔洛韋本身的毒性所致[29]。該研究中，玻璃體腔注藥時進針深度為6 mm，考慮到兔眼晶狀體后囊至后極部視網膜距離約7 mm[27]，此時針尖已與視網膜非常接近，注入眼內的藥液未與玻璃體充分混合便被直接推送至視網膜表面，引起局部pH值迅速升高，可對內層視網膜帶來近似堿燒傷的組織損害。本研究考慮兔眼直徑較人眼更小，注藥時注射器僅往玻璃體腔推進4 mm，此時針尖懸停于玻璃體中心位置，緩慢推注藥液時，更昔洛韋可與玻璃體充分混合后再彌散分布至視網膜內表面，極大地避免了局部pH值大幅波動帶來的毒性作用，這可能是本研究未見IVG視網膜毒性的原因之一。
盡管更昔洛韋半衰期僅為18.8 h，理論上每周1次的注射頻率不存在藥物累積，但既往相關實驗均設計為單次給藥后觀察ERG或組織學變化，與臨床實際使用方法存在較大差異。本研究結果顯示，連續多次IVG并未對兔眼視網膜結構和功能造成任何不良影響，且大劑量實驗組和小劑量實驗組均如此，進一步證實IVG重復治療的安全性。
本研究不足是未能對6 mm進針和4 mm進針的差異進行觀察，且實驗組兔眼未行電子顯微鏡觀察。考慮大小劑量實驗組兔眼OCT、ERG和組織病理切片均未見顯著異常改變，即便超微結構存在細微差異也不足以影響視網膜功能，因此本研究結果切實可信。盡管動物實驗不能完全取代臨床試驗，但本研究結果依然為臨床上IVG的應用提供了更多參考依據。
