引用本文： 李冠峰, 周鐘強, 唐賀, 魏圓夢, 彭海鷹, 史平玲, 梁迎娟, 孫先桃, 盧躍兵. Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲一家系CACNA1F基因突變分析. 中華眼底病雜志, 2021, 37(11): 860-864. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210930-00560 復制
先天性靜止性夜盲（CSNB）是一種少見的主要以視桿細胞功能異常為特征的遺傳性視網膜病變[1-2]。根據臨床表現分為正常眼底CSNB和眼底異常CSNB。正常眼底的CSNB按照遺傳方式可分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳三種[1]。按照視網膜電圖（ERG）特征可分為Riggs型和Schubert-Bornschein型CSNB[1,3]。根據視桿細胞是否存在功能又可將Schubert-Bornschein型CSNB分為完全型和不完全型CSNB[1,3]。目前已發現21個與之相關的致病基因[3-4]，以及超過300個與之相關的致病突變位點[3,5-7]。有研究表明，電壓依賴鈣離子通道α1F亞基（CACNA1F）基因突變與不完全型CSNB有關，該基因編碼視網膜特異表達的L型鈣離子通道的α1亞單位[8]。本研究采用全外顯子測序對一個漢族CSNB家系進行基因突變分析，發現一個新的CACNA1F基因突變位點。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省人民醫院倫理委員會審批［批文號：HNEECKY-2019（15號）］；嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則；所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。
2021年2月在河南省人民醫院眼科經臨床、基因檢查確診的Schubert-Bornschein型不完全型CSNB一家系的1例患者（先證者）和其父母、兄長納入本研究。詳細詢問和記錄家族史，繪制家系圖（圖1）。受試者均行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、醫學驗光、眼底彩色照相、色覺、頻域光相干斷層掃描（OCT）、全視野ERG（ff-ERG）檢查。先證者眼底檢查采用廣角數碼視網膜成像系統進行。
圖1
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲患者家系圖。□：正常男性；?：女性X連鎖隱性基因攜帶者；↗：先證者；M1：CACNA1F基因c.1761dupC
采集受試者外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。CACNA1F基因取受試者基因組DNA進行文庫構建，采用聚合全外顯子探針進行捕獲，美國Illumina公司NovaSeq6000測序儀進行文庫測序，全外顯子測序超過95%達到20×，深度（100±20）×。測序結果使用Burrows-Wheeler Alignment Tool整理后與人基因組進行比對，使用GATK4消除假陽性、校正質量值并檢測和過濾單核苷酸多態性（SNP）和缺失變異（InDel）結果。使用Annovar對SNP、InDel結果進行注釋并關聯到多個數據庫。對原始變異數據進行正常人群頻率、變異功能等篩選條件進行篩選，篩選出與先證者臨床癥狀相關性的潛在致病性變異位點，并對先證者全外顯子檢測結果進行基于外顯子捕獲測序深度的基因拷貝數多態（CNV）分析。檢測出的可疑致病突變均通過Sanger測序進行驗證。
應用蛋白功能預測軟件MutationTaster（http://www.mutationtaster.org/）預測氨基酸突變對蛋白功能的影響。通過美國國家生物技術信息中心數據庫對新發現的變異進行氨基酸保守性分析。應用千人基因組計劃、外顯子組集合聯合數據庫（ExAc）、ESP6500數據庫收錄的信息進行對比。參考美國遺傳學和基因組學學會（ACMG）標準和指南[9]，對所有變異位點進行致病等級評估。PVS1證據定義為無義突變導致功能喪失；PM2證據定義為正常人群未出現。
2 結果
先證者（Ⅱ2），男，5歲。發現眼斜1年就診。否認畏光、夜盲。雙眼眼球運動正常，未見眼球震顫；33 cm角膜映光－15°。右眼、左眼BCVA分別為+0.00/－2.00×180→0.4、－0.75/－2.50×165→ 0.4。色覺檢查，雙眼均不能辨認紅色。雙眼眼前節未見明顯異常。視盤顏色右眼稍淡，左眼正常，邊界均清楚；雙眼視網膜動脈未見明顯變細，靜脈未見明顯紆曲，動靜脈比約2∶3，未見明顯色素沉著，黃斑中心凹反光可見。頻域OCT檢查，雙眼黃斑中心凹外層視網膜厚度變薄（圖2）。ff-ERG檢查，雙眼暗適應0.01b波振幅明顯降低；暗適應3.0、10.0 a波振幅正常，b波振幅明顯降低，呈負波形；暗適應3.0震蕩電位振幅嚴重降低；明適應3.0 a、b波振幅嚴重降低；明適應30 Hz閃爍光反應振幅嚴重降低，呈雙波峰（圖3）。先證者母親（Ⅰ2），35歲。雙眼視力、色覺、眼前節、眼底、OCT檢查均未見明顯異常。ff-ERG檢查，各反應振幅輕度降低；暗適應震蕩電位振幅明顯降低（圖4）。先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1）眼部檢查未見明顯異常。先證者父母及兄長均無CSNB典型臨床特征，符合隱性遺傳模式。
圖2
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者雙眼光相干斷層掃描像。2A示右眼；2B示左眼。雙眼黃斑區視網膜組織形態和組織反射未見明顯異常；黃斑中心凹外層視網膜厚度變薄
圖3
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者全視野視網膜電圖像。雙眼暗適應0.01 b波振幅明顯降低；暗適應3.0、10.0 a波振幅正常，b波振幅明顯降低，呈負波形；暗適應3.0 震蕩電位振幅嚴重降低；明適應3.0 a、b波振幅嚴重降低；明適應30 Hz閃爍光反應振幅嚴重降低，呈雙波峰
圖4
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者母親全視野視網膜電圖像。各反應振幅輕度降低，暗適應震蕩電位振幅降低明顯（未達正常振幅的1/2）
基因突變檢測結果顯示，先證者（Ⅱ2）CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC半合子突變，引起移碼突變；先證者母親（Ⅰ2）CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC （pY588fs）雜合突變；先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1）基因檢測未見異常（圖5）。
圖5
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者和家系成員基因測序圖。5A示先證者（Ⅱ2），CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC（pY588fs）移碼突變（紅箭）； 5B示先證者母親（Ⅰ2），攜帶該位點突變（紅箭）；5C、5D分別示先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1），該位點不存在突變
與千人基因組計劃、ExAc、ESP6500數據庫對比發現，c.1761dupC（pY588fs）未見收錄。蛋白序列同源性分析結果顯示，CACNA1F pY588fs突變所對應的第588位氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6）。第14號外顯子發生重復突變c.1761dupC導致移碼突變，其后第10位變成終止密碼子，翻譯提前終止，無法產生結構功能正常的蛋白產物。MutationTaster預測結果顯示該突變為致病突變。根據ACMG指南，該突變具有1個PVS1證據、1個PM2證據，判斷為可能致病性變異。
圖6
CACNA1F蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。CACNA1F基因c.1761dupC突變所對應第588號氨基酸在人類、獼猴、狼、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚和爪蟾中高度保守
3 討論
典型的CSNB患者大多臨床表現為視力不同程度低下，合并夜盲、眼球震顫、斜視[1-2]，結合病史、眼科檢查及輔助檢查易于診斷。而對于不合并夜盲、眼球震顫、斜視者，臨床易誤診為其他疾病。因此對于視力低下的患者，我們建議除了常規眼部檢查及驗光外，應增加色覺、OCT、ERG等相應的眼科特殊檢查。根據病史、眼科檢查及輔助檢查綜合分析，本家系先證者符合Schubert-Bornschein型不完全型CSNB的診斷[1,3,10-11]。
本研究在一個X隱性遺傳漢族Schubert-Bornschein型不完全型CSNB家系中發現CACNA1F基因新的致病突變c.1761dupC。CACNA1F基因位于人類染色體Xp11.23，基因全長28×103個堿基，包含48個外顯子，編碼一種由1977個氨基酸組成的Cav1.4離子通道的α1F亞基[8]。Cav1.4是L型電壓門控通道，在光感受器中Cav1.4是鈣離子流入和突觸囊泡融合所必需的，其在光感受器突觸末端介導谷氨酸釋放以及與視覺信號傳輸相關的突觸后反應[12]。Cav1.4離子通道中CACNA1F基因編碼的α1F亞基定位在外叢狀層的錐桿細胞末端[13]，參與維持光感受器突觸的結構和功能，介導了在受到光刺激之后光感受器末端神經遞質的釋放[14]。研究發現，Cav1.4中α1F亞基在控制光感受器末端釋放谷氨酸方面可能起著關鍵作用，CACNA1F基因突變會影響光感受器的突觸信號傳遞，甚至影響視錐細胞結構的正常組裝和維護[15-17]。本研究結果顯示，先證者CACNA1F基因的第14號外顯子存在c.1761dupC（pY588fs）半合子突變，引起移碼突變，導致翻譯提前終止，不能得到完整蛋白質。目前CACNA1F基因的突變包括206個致病突變和42個可能致病突變（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=CACNA1F［gene］），但是本研究中的突變未見報道。綜合生物信息學和致病性分析結果，我們認為c.1761dupC（pY588fs）可能是一個新的致病突變，并將進一步研究其對蛋白質功能影響。
先證者母親（I2）為c.1761dupC（pY588fs）雜合突變攜帶者，雖然視力、色覺、眼前節及眼底檢查未見明顯異常，但ff-ERG表現為各個反應振幅的降低，暗適應3.0震蕩電位振幅未達到正常振幅的1/2。其原因可能是由于定位于X染色體上的CACNA1F等位基因具有劑量效應。母親攜帶一個野生型正常基因和一個可能致病性變異基因，因此能夠同時表達結構正常和異常的Cav1.4離子通道α1F亞基，導致視網膜Cav1.4離子通道功能雖然受損但并未完全喪失。因此，雖并未表現出臨床可見的癥狀及體征，但ff-ERG檢查結果異常。這也能夠解釋先證者兄長（Ⅱ1）因為僅有一個野生型等位基因，所以臨床表型正常；而先證者（Ⅱ2）因為僅有一個可能致病性突變基因，臨床表現為CSNB典型特征。該推斷將通過我們后續的動物實驗進行驗證。
我們通過詳細的臨床檢查，發現1例眼底正常的Schubert- Bornschein型不完全型CSNB患兒，臨床中該類患者常被誤診為弱視而導致漏診而誤治；基因檢測發現其CACNA1F基因上1個新的突變位點，擴大該基因突變譜，對更深入了解CSNB的發病機制提供了一定幫助。本研究存在的不足：（1）僅1個兩代4個家族成員的核心家系，因此研究的外推性欠佳；（2）僅核心家系成員進行了檢測，未對其他家族成員進行研究，因此不能確認上述新的突變位點分別來源于整個家系的哪些家族成員；（3）僅從樣本中測序發現突變基因，尚缺少圍繞基因功能方面的實驗驗證。
先天性靜止性夜盲（CSNB）是一種少見的主要以視桿細胞功能異常為特征的遺傳性視網膜病變[1-2]。根據臨床表現分為正常眼底CSNB和眼底異常CSNB。正常眼底的CSNB按照遺傳方式可分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳三種[1]。按照視網膜電圖（ERG）特征可分為Riggs型和Schubert-Bornschein型CSNB[1,3]。根據視桿細胞是否存在功能又可將Schubert-Bornschein型CSNB分為完全型和不完全型CSNB[1,3]。目前已發現21個與之相關的致病基因[3-4]，以及超過300個與之相關的致病突變位點[3,5-7]。有研究表明，電壓依賴鈣離子通道α1F亞基（CACNA1F）基因突變與不完全型CSNB有關，該基因編碼視網膜特異表達的L型鈣離子通道的α1亞單位[8]。本研究采用全外顯子測序對一個漢族CSNB家系進行基因突變分析，發現一個新的CACNA1F基因突變位點。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經河南省人民醫院倫理委員會審批［批文號：HNEECKY-2019（15號）］；嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則；所有受試者及未成年受試者監護人均簽署書面知情同意書。
2021年2月在河南省人民醫院眼科經臨床、基因檢查確診的Schubert-Bornschein型不完全型CSNB一家系的1例患者（先證者）和其父母、兄長納入本研究。詳細詢問和記錄家族史，繪制家系圖（圖1）。受試者均行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯合前置鏡、醫學驗光、眼底彩色照相、色覺、頻域光相干斷層掃描（OCT）、全視野ERG（ff-ERG）檢查。先證者眼底檢查采用廣角數碼視網膜成像系統進行。
圖1
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲患者家系圖。□：正常男性；?：女性X連鎖隱性基因攜帶者；↗：先證者；M1：CACNA1F基因c.1761dupC
采集受試者外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。CACNA1F基因取受試者基因組DNA進行文庫構建，采用聚合全外顯子探針進行捕獲，美國Illumina公司NovaSeq6000測序儀進行文庫測序，全外顯子測序超過95%達到20×，深度（100±20）×。測序結果使用Burrows-Wheeler Alignment Tool整理后與人基因組進行比對，使用GATK4消除假陽性、校正質量值并檢測和過濾單核苷酸多態性（SNP）和缺失變異（InDel）結果。使用Annovar對SNP、InDel結果進行注釋并關聯到多個數據庫。對原始變異數據進行正常人群頻率、變異功能等篩選條件進行篩選，篩選出與先證者臨床癥狀相關性的潛在致病性變異位點，并對先證者全外顯子檢測結果進行基于外顯子捕獲測序深度的基因拷貝數多態（CNV）分析。檢測出的可疑致病突變均通過Sanger測序進行驗證。
應用蛋白功能預測軟件MutationTaster（http://www.mutationtaster.org/）預測氨基酸突變對蛋白功能的影響。通過美國國家生物技術信息中心數據庫對新發現的變異進行氨基酸保守性分析。應用千人基因組計劃、外顯子組集合聯合數據庫（ExAc）、ESP6500數據庫收錄的信息進行對比。參考美國遺傳學和基因組學學會（ACMG）標準和指南[9]，對所有變異位點進行致病等級評估。PVS1證據定義為無義突變導致功能喪失；PM2證據定義為正常人群未出現。
2 結果
先證者（Ⅱ2），男，5歲。發現眼斜1年就診。否認畏光、夜盲。雙眼眼球運動正常，未見眼球震顫；33 cm角膜映光－15°。右眼、左眼BCVA分別為+0.00/－2.00×180→0.4、－0.75/－2.50×165→ 0.4。色覺檢查，雙眼均不能辨認紅色。雙眼眼前節未見明顯異常。視盤顏色右眼稍淡，左眼正常，邊界均清楚；雙眼視網膜動脈未見明顯變細，靜脈未見明顯紆曲，動靜脈比約2∶3，未見明顯色素沉著，黃斑中心凹反光可見。頻域OCT檢查，雙眼黃斑中心凹外層視網膜厚度變薄（圖2）。ff-ERG檢查，雙眼暗適應0.01b波振幅明顯降低；暗適應3.0、10.0 a波振幅正常，b波振幅明顯降低，呈負波形；暗適應3.0震蕩電位振幅嚴重降低；明適應3.0 a、b波振幅嚴重降低；明適應30 Hz閃爍光反應振幅嚴重降低，呈雙波峰（圖3）。先證者母親（Ⅰ2），35歲。雙眼視力、色覺、眼前節、眼底、OCT檢查均未見明顯異常。ff-ERG檢查，各反應振幅輕度降低；暗適應震蕩電位振幅明顯降低（圖4）。先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1）眼部檢查未見明顯異常。先證者父母及兄長均無CSNB典型臨床特征，符合隱性遺傳模式。
圖2
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者雙眼光相干斷層掃描像。2A示右眼；2B示左眼。雙眼黃斑區視網膜組織形態和組織反射未見明顯異常；黃斑中心凹外層視網膜厚度變薄
圖3
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者全視野視網膜電圖像。雙眼暗適應0.01 b波振幅明顯降低；暗適應3.0、10.0 a波振幅正常，b波振幅明顯降低，呈負波形；暗適應3.0 震蕩電位振幅嚴重降低；明適應3.0 a、b波振幅嚴重降低；明適應30 Hz閃爍光反應振幅嚴重降低，呈雙波峰
圖4
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者母親全視野視網膜電圖像。各反應振幅輕度降低，暗適應震蕩電位振幅降低明顯（未達正常振幅的1/2）
基因突變檢測結果顯示，先證者（Ⅱ2）CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC半合子突變，引起移碼突變；先證者母親（Ⅰ2）CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC （pY588fs）雜合突變；先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1）基因檢測未見異常（圖5）。
圖5
Schubert-Bornschein型不完全型先天性靜止性夜盲家系先證者和家系成員基因測序圖。5A示先證者（Ⅱ2），CACNA1F基因第14號外顯子存在c.1761dupC（pY588fs）移碼突變（紅箭）； 5B示先證者母親（Ⅰ2），攜帶該位點突變（紅箭）；5C、5D分別示先證者父親（Ⅰ1）、兄長（Ⅱ1），該位點不存在突變
與千人基因組計劃、ExAc、ESP6500數據庫對比發現，c.1761dupC（pY588fs）未見收錄。蛋白序列同源性分析結果顯示，CACNA1F pY588fs突變所對應的第588位氨基酸位點在多個物種中均高度保守（圖6）。第14號外顯子發生重復突變c.1761dupC導致移碼突變，其后第10位變成終止密碼子，翻譯提前終止，無法產生結構功能正常的蛋白產物。MutationTaster預測結果顯示該突變為致病突變。根據ACMG指南，該突變具有1個PVS1證據、1個PM2證據，判斷為可能致病性變異。
圖6
CACNA1F蛋白序列在多個物種中的保守性分析圖。CACNA1F基因c.1761dupC突變所對應第588號氨基酸在人類、獼猴、狼、牛、小鼠、大鼠、斑馬魚和爪蟾中高度保守
3 討論
典型的CSNB患者大多臨床表現為視力不同程度低下，合并夜盲、眼球震顫、斜視[1-2]，結合病史、眼科檢查及輔助檢查易于診斷。而對于不合并夜盲、眼球震顫、斜視者，臨床易誤診為其他疾病。因此對于視力低下的患者，我們建議除了常規眼部檢查及驗光外，應增加色覺、OCT、ERG等相應的眼科特殊檢查。根據病史、眼科檢查及輔助檢查綜合分析，本家系先證者符合Schubert-Bornschein型不完全型CSNB的診斷[1,3,10-11]。
本研究在一個X隱性遺傳漢族Schubert-Bornschein型不完全型CSNB家系中發現CACNA1F基因新的致病突變c.1761dupC。CACNA1F基因位于人類染色體Xp11.23，基因全長28×103個堿基，包含48個外顯子，編碼一種由1977個氨基酸組成的Cav1.4離子通道的α1F亞基[8]。Cav1.4是L型電壓門控通道，在光感受器中Cav1.4是鈣離子流入和突觸囊泡融合所必需的，其在光感受器突觸末端介導谷氨酸釋放以及與視覺信號傳輸相關的突觸后反應[12]。Cav1.4離子通道中CACNA1F基因編碼的α1F亞基定位在外叢狀層的錐桿細胞末端[13]，參與維持光感受器突觸的結構和功能，介導了在受到光刺激之后光感受器末端神經遞質的釋放[14]。研究發現，Cav1.4中α1F亞基在控制光感受器末端釋放谷氨酸方面可能起著關鍵作用，CACNA1F基因突變會影響光感受器的突觸信號傳遞，甚至影響視錐細胞結構的正常組裝和維護[15-17]。本研究結果顯示，先證者CACNA1F基因的第14號外顯子存在c.1761dupC（pY588fs）半合子突變，引起移碼突變，導致翻譯提前終止，不能得到完整蛋白質。目前CACNA1F基因的突變包括206個致病突變和42個可能致病突變（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=CACNA1F［gene］），但是本研究中的突變未見報道。綜合生物信息學和致病性分析結果，我們認為c.1761dupC（pY588fs）可能是一個新的致病突變，并將進一步研究其對蛋白質功能影響。
先證者母親（I2）為c.1761dupC（pY588fs）雜合突變攜帶者，雖然視力、色覺、眼前節及眼底檢查未見明顯異常，但ff-ERG表現為各個反應振幅的降低，暗適應3.0震蕩電位振幅未達到正常振幅的1/2。其原因可能是由于定位于X染色體上的CACNA1F等位基因具有劑量效應。母親攜帶一個野生型正常基因和一個可能致病性變異基因，因此能夠同時表達結構正常和異常的Cav1.4離子通道α1F亞基，導致視網膜Cav1.4離子通道功能雖然受損但并未完全喪失。因此，雖并未表現出臨床可見的癥狀及體征，但ff-ERG檢查結果異常。這也能夠解釋先證者兄長（Ⅱ1）因為僅有一個野生型等位基因，所以臨床表型正常；而先證者（Ⅱ2）因為僅有一個可能致病性突變基因，臨床表現為CSNB典型特征。該推斷將通過我們后續的動物實驗進行驗證。
我們通過詳細的臨床檢查，發現1例眼底正常的Schubert- Bornschein型不完全型CSNB患兒，臨床中該類患者常被誤診為弱視而導致漏診而誤治；基因檢測發現其CACNA1F基因上1個新的突變位點，擴大該基因突變譜，對更深入了解CSNB的發病機制提供了一定幫助。本研究存在的不足：（1）僅1個兩代4個家族成員的核心家系，因此研究的外推性欠佳；（2）僅核心家系成員進行了檢測，未對其他家族成員進行研究，因此不能確認上述新的突變位點分別來源于整個家系的哪些家族成員；（3）僅從樣本中測序發現突變基因，尚缺少圍繞基因功能方面的實驗驗證。
