引用本文： 盧睿, 楊衛華, 蔣沁, 李秀苗, 王成虎. RS1基因新致病突變c.361C>T引起X連鎖視網膜劈裂癥. 中華眼底病雜志, 2021, 37(11): 854-859. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210305-00124 復制
X連鎖視網膜劈裂癥（XLRS）又稱X連鎖遺傳性視網膜劈裂癥或青少年型視網膜劈裂，多見于男性。該病的特征性臨床表現為黃斑區輻條狀、星狀囊樣劈裂；由于黃斑區受累，患者通常有中到重度的視力損害，可伴有眼球震顫、斜視等，有些可出現新生血管性青光眼、視網膜脫離、玻璃體積血等并發癥并多在兒童時期就出現癥狀[1]。其主要致病基因為RS1基因，定位于X染色體的短臂遠端Xp22區，包含6個外顯子及5個內含子[2]。該基因編碼一段有224個氨基酸的蛋白質稱為視網膜劈裂蛋白（RS1蛋白）。目前已發現330種RS1基因突變，其中多數為錯義或無義突變，這部分中又有超過3/4的突變位點位于編碼RS1蛋白盤狀結構域的4～6號外顯子；其他突變類型包括缺失變異、剪接位點突變和無義突變[3-5]。我們對一個XLRS家系進行了基因突變分析，發現一個新的RS1基因突變位點。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經南京醫科大學眼科醫院倫理委員會審批（批準號：2020013）；嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則；所有受試者或未成年監護人均簽署書面知情同意書。
2020年8月于南京醫科大學眼科醫院就診的一個4代XLRS家系中3例患者及12名家系成員（圖1）納入本研究。其中，患者3例均為男性（Ⅱ1、Ⅲ8、Ⅳ3）；家系成員12名中，男性5名（Ⅲ1、Ⅳ1、Ⅳ5、Ⅳ7、Ⅳ8），女性7名（Ⅱ2、Ⅱ5，Ⅲ2、Ⅲ3，Ⅳ2、Ⅳ4、Ⅳ6）。詳細詢問先證者病史并行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相檢查。3例患者中，行光相干斷層掃描（OCT）檢查2例。
圖1
XLRS患者家系圖。□:正常男性；○：正常女性；采集3例患者及12名家系成員的外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA。采用北京邁基諾基因科技股份有限公司標準文庫構建試劑盒對先證者基因組DNA進行基因組文庫構建，用包含814個已知遺傳性眼病相關候選基因的Panel進行捕獲，獲得目標基因的富集文庫。使用Illumina HiSeq X10測序平臺對富集文庫進行高通量測序，對獲得的原始測序數據去除污染和接頭序列，利用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）將過濾后的序列比對到美國國立生物技術信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫人類基因組參考序列（hg19）上，利用GATK軟件（
對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。Sanger測序中，應用Primer 3.0引物設計軟件設計引物序列。RS1基因第5號外顯子，正向引物5'-GCAGTGACAGGAGCTCGG-3'，反向引物5'-TATAACGGAAGCTGGCCATTC-3'，擴增片段長度為488堿基對。以基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應（PCR）擴增目標片段。PCR擴增產物使用3130XL測序儀進行毛細管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer（美國ABI公司）上進行分析，再在家系成員中進行共分離驗證。
采用MutationTaster和GERP對異常基因突變進行功能預測；采用美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）和美國分子病理學會基因變異解讀標準和指南[6]對基因變異進行致病性分析。PVS1證據定義為無義突變導致功能喪失；PM2證據定義為正常人群未出現；PP4證據定義為攜帶變異的患者表型高度符合X連鎖青年型視網膜劈裂癥。SWISS-MODEL在線預測軟件進行野生型及突變型RS1蛋白的晶體三維結構預測。
2 結果
先證者（Ⅳ3），3歲。因家長發現患兒視力差伴眼球震顫就診。右眼、左眼BCVA分別為0.1、0.3。雙眼黃斑放射狀囊樣劈裂（圖2A，2B）。OCT檢查，雙眼黃斑區視網膜內核層隆起囊腔樣改變，被垂直或斜形橋狀組織分割（圖2C，2D）；右眼、左眼黃斑中心凹視網膜厚度（CRT）分別為613、600 μm。診斷為雙眼視網膜劈裂癥Ⅰ期。其父母均無視網膜劈裂癥典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳模式。先證者舅舅（Ⅲ8），32歲。因左眼黑影飄動就診。患者自幼視力下降；雙眼恒定性外斜視伴眼球震顫。右眼、左眼BCVA分別為0.1、0.25。就診時診斷為雙眼視網膜劈裂癥。雙眼眼底沿黃斑區下方血管弓處可見增生膜（圖3A，3B）。OCT檢查，左眼黃斑區萎縮；右眼黃斑區囊樣隆起，被垂直或斜形橋狀組織分割，CRT為602 μm（圖3C，3D）。診斷為左眼視網膜劈裂癥Ⅲ期；右眼視網膜劈裂癥Ⅰ期。先證者父母（Ⅲ1、Ⅲ2）及其他家系成員10名（Ⅱ2、Ⅱ5、Ⅲ3，Ⅳ1、Ⅳ2、Ⅳ4～8）眼底檢查均未見異常。
圖2
XLRS家系先證者（Ⅳ3）彩色眼底、OCT像。2A、2B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼黃斑劈裂。2C、2D分別示右眼、左眼OCT像。右眼黃斑區內核層劈裂，左眼神經節細胞層、內核層、外核層劈裂，黃斑中心凹視網膜厚度增加。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥；OCT：光相干斷層掃描
圖3
XLRS家系先證者先證者（Ⅳ3） XLRS家系先證者舅舅彩色眼底、OCT像。3A、3B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼后極部視網膜增生膜，右眼黃斑萎縮，視網膜血管被牽拉變形，左眼黃斑劈裂。3C、3D分別示右眼、左眼OCT像。右眼黃斑區內核層劈裂；左眼神經節細胞層、內核層、外核層劈裂，黃斑中心凹視網膜厚度增加。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥；OCT：光相干斷層掃描
Panel測序結果顯示，先證者（Ⅳ3）及2例患者（Ⅱ1、Ⅲ8）RS1基因第5外顯子上存在c.361C>T/p.Q121X半合子突變（圖4A）；其母親為該基因雜合突變攜帶者，父親無變異（圖4B，4C），父母親表型均正常，該突變在家系中呈共分離。該突變基因導致RS1蛋白提前終止，由原來編碼224個氨基酸突變為120個氨基酸的截短蛋白。家系中其他眼底檢查未見異常者10名中，正常者6名，其中男性4名（Ⅳ1、Ⅳ5、Ⅳ7、Ⅳ8），女性2名（Ⅱ2、Ⅳ6）；該基因突變攜帶者4名（Ⅱ5、Ⅲ3、Ⅳ2、Ⅳ4），均為女性。該突變在千人基因組、gnomAD、ExAC等正常人數據庫以及人類基因突變數據庫（HGMD）、clinVAR均未見收錄，檢索PubMed亦未見相關文獻報道，為RS1基因新發現突變。
圖4
XLRS家系RS1基因測序圖。4A示先證者，RS1基因第5外顯子的c.361C>T/p.Q121X半合子突變（紅箭）；4B示先證者母親，該位點雜合突變（紅箭）；4C示先證者父親，該位點不存在突變（紅箭）。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥
蛋白序列同源性分析結果顯示，RS1基因p.Q121X突變所對應的第121位谷氨酰胺在12種哺乳動物高度保守（圖5）。MutationTaster預測該突變為有害。RS1蛋白三維結構分析結果顯示，突變后的蛋白C端氨基酸序列缺失＞50%（圖6）。根據ACMG指南，該突變具有1個PVS1證據、1個PM2證據、1個PP4證據，滿足致病性證據，判斷為致病性突變。
圖5
RS1蛋白序列在12種哺乳動物中的保守性分析圖。RS1 p.Q121X突變所對應的第121位谷氨酰胺在人（Homo）、黑猩猩（Pongo）、獅尾狒（Theropithecus）、小鼠（Mus）、大鼠（Rattus）、馬（Equus）、狐（Vulpes）、貓（Felis）、牛（Bos）、 抹香鯨（Physeter）、犬（Canis）、豬（Sus）中均高度保守
圖6
RS1蛋白三維結構分析圖。6A示野生型RS1蛋白第121位的谷氨酰胺C端氨基酸序列完整；6B示突變型RS1蛋白第121位谷氨酰胺C端氨基酸序列缺失＞50%
3 討論
XLRS多見于男性，常雙眼對稱發病，也可單眼發病，BCVA為手動～0.8 [7-8]。對于疑似XLRS患者，OCT檢查對鑒別視網膜劈裂癥有重要意義[9]。OCT檢查可見黃斑區視網膜劈裂腔，其典型表現為黃斑區視網膜內核層劈裂、隆起，形成囊腔，近黃斑旁視網膜可見橋樣連接分隔的小囊腔[10-12]。XLRS是一種進行性視網膜退行性疾病[13]，應定期監測以評估疾病的進展并處理潛在并發癥[11]。
目前根據HGMD數據庫統計已經發現330種RS1致病性基因突變，多數為錯義突變，缺失變異、剪接位點突變和無義突變則較少[3-5]。Sauer等[2]發現XLRS的致病基因是位于Xp22的RS1。RS1在光感受器細胞和雙極細胞中表達，包含6個外顯子，編碼RS1蛋白，其由224個氨基酸組成，并含有一個高度疏水的信號肽。這個信號肽被肽酶剪切，形成成熟的蛋白，在細胞核內層充當細胞之間的連接[14]。RS1蛋白包含幾個結構域：由外顯子1、2（氨基酸1～23）編碼的疏水信號序列，由外顯子3（氨基酸23～62）編碼的RS1結構域和由外顯子4～6（氨基酸63~219）編碼的高度保守的盤狀結構域。保守的盤狀蛋白結構域存在于細胞外或跨膜蛋白中，對于穩定視網膜細胞結構和建立適當的突觸連接至關重要[15-17]。
本研究中3例患者經Panel測序均發現RS1基因第5外顯子上存在無義突變（c.361C>T/p.Q121X），導致RS1蛋白提前終止，由原來編碼224個氨基酸突變為120個氨基酸的截短蛋白。RS1蛋白是由光感受器細胞和雙極細胞組裝和分泌的一種同源寡聚蛋白復合物，在視網膜的細胞組織中起著至關重要的作用[18]。RS1蛋白功能域位于68～217位氨基酸，該功能域為FA58C，是凝血因子5/8 C端結構域，在細胞表面附著碳水化合物起著重要作用，本研究中患者攜帶的突變使功能域大部分氨基酸丟失，從而導致疾病的發生。
XLRS臨床檢查結果缺乏特異性，如黃斑區視網膜劈裂需與黃斑水腫鑒別，視網膜脫離需判斷病因為原發性還是繼發性等。因此，基因檢測結合OCT和視網膜電圖（ERG）檢查對XLRS的臨床診斷具有重要意義[19]。本家系患者未行ERG檢查，因此無法對ERG檢查結果與基因突變型進行相關性分析。今后研究中，將對該類疾病患者行ERG檢查，以進一步明確RS1基因型與臨床表型之間的關系。XLRS目前尚無有效治療方法，篩選基因突變對于了解XLRS的發病機制，探索新的有效治療方法至關重要[20]。
本研究對一個XLRS家系進行了分子遺傳學研究，證實了該家系的致病基因為RS1基因，并發現了該基因第5外顯子一個新的無義突變c.361C>T/p.Q121X，不僅擴大了RS1基因的突變譜，還為該疾病的遺傳咨詢、產前診斷以及將來的基因治療等提供了重要依據。
X連鎖視網膜劈裂癥（XLRS）又稱X連鎖遺傳性視網膜劈裂癥或青少年型視網膜劈裂，多見于男性。該病的特征性臨床表現為黃斑區輻條狀、星狀囊樣劈裂；由于黃斑區受累，患者通常有中到重度的視力損害，可伴有眼球震顫、斜視等，有些可出現新生血管性青光眼、視網膜脫離、玻璃體積血等并發癥并多在兒童時期就出現癥狀[1]。其主要致病基因為RS1基因，定位于X染色體的短臂遠端Xp22區，包含6個外顯子及5個內含子[2]。該基因編碼一段有224個氨基酸的蛋白質稱為視網膜劈裂蛋白（RS1蛋白）。目前已發現330種RS1基因突變，其中多數為錯義或無義突變，這部分中又有超過3/4的突變位點位于編碼RS1蛋白盤狀結構域的4～6號外顯子；其他突變類型包括缺失變異、剪接位點突變和無義突變[3-5]。我們對一個XLRS家系進行了基因突變分析，發現一個新的RS1基因突變位點。現將結果報道如下。
1 對象和方法
回顧性臨床研究。本研究經南京醫科大學眼科醫院倫理委員會審批（批準號：2020013）；嚴格遵守《赫爾辛基宣言》原則；所有受試者或未成年監護人均簽署書面知情同意書。
2020年8月于南京醫科大學眼科醫院就診的一個4代XLRS家系中3例患者及12名家系成員（圖1）納入本研究。其中，患者3例均為男性（Ⅱ1、Ⅲ8、Ⅳ3）；家系成員12名中，男性5名（Ⅲ1、Ⅳ1、Ⅳ5、Ⅳ7、Ⅳ8），女性7名（Ⅱ2、Ⅱ5，Ⅲ2、Ⅲ3，Ⅳ2、Ⅳ4、Ⅳ6）。詳細詢問先證者病史并行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相檢查。3例患者中，行光相干斷層掃描（OCT）檢查2例。
圖1
XLRS患者家系圖。□:正常男性；○：正常女性；采集3例患者及12名家系成員的外周靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA提取試劑盒按照標準操作流程提取全基因組DNA。采用北京邁基諾基因科技股份有限公司標準文庫構建試劑盒對先證者基因組DNA進行基因組文庫構建，用包含814個已知遺傳性眼病相關候選基因的Panel進行捕獲，獲得目標基因的富集文庫。使用Illumina HiSeq X10測序平臺對富集文庫進行高通量測序，對獲得的原始測序數據去除污染和接頭序列，利用BWA軟件（http://bio-bwa.sourceforge.net/）將過濾后的序列比對到美國國立生物技術信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫人類基因組參考序列（hg19）上，利用GATK軟件（
對明確的致病突變，采用Sanger測序進行驗證。Sanger測序中，應用Primer 3.0引物設計軟件設計引物序列。RS1基因第5號外顯子，正向引物5'-GCAGTGACAGGAGCTCGG-3'，反向引物5'-TATAACGGAAGCTGGCCATTC-3'，擴增片段長度為488堿基對。以基因組DNA為模板，聚合酶鏈反應（PCR）擴增目標片段。PCR擴增產物使用3130XL測序儀進行毛細管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer（美國ABI公司）上進行分析，再在家系成員中進行共分離驗證。
采用MutationTaster和GERP對異常基因突變進行功能預測；采用美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）和美國分子病理學會基因變異解讀標準和指南[6]對基因變異進行致病性分析。PVS1證據定義為無義突變導致功能喪失；PM2證據定義為正常人群未出現；PP4證據定義為攜帶變異的患者表型高度符合X連鎖青年型視網膜劈裂癥。SWISS-MODEL在線預測軟件進行野生型及突變型RS1蛋白的晶體三維結構預測。
2 結果
先證者（Ⅳ3），3歲。因家長發現患兒視力差伴眼球震顫就診。右眼、左眼BCVA分別為0.1、0.3。雙眼黃斑放射狀囊樣劈裂（圖2A，2B）。OCT檢查，雙眼黃斑區視網膜內核層隆起囊腔樣改變，被垂直或斜形橋狀組織分割（圖2C，2D）；右眼、左眼黃斑中心凹視網膜厚度（CRT）分別為613、600 μm。診斷為雙眼視網膜劈裂癥Ⅰ期。其父母均無視網膜劈裂癥典型臨床特征，符合常染色體隱性遺傳模式。先證者舅舅（Ⅲ8），32歲。因左眼黑影飄動就診。患者自幼視力下降；雙眼恒定性外斜視伴眼球震顫。右眼、左眼BCVA分別為0.1、0.25。就診時診斷為雙眼視網膜劈裂癥。雙眼眼底沿黃斑區下方血管弓處可見增生膜（圖3A，3B）。OCT檢查，左眼黃斑區萎縮；右眼黃斑區囊樣隆起，被垂直或斜形橋狀組織分割，CRT為602 μm（圖3C，3D）。診斷為左眼視網膜劈裂癥Ⅲ期；右眼視網膜劈裂癥Ⅰ期。先證者父母（Ⅲ1、Ⅲ2）及其他家系成員10名（Ⅱ2、Ⅱ5、Ⅲ3，Ⅳ1、Ⅳ2、Ⅳ4～8）眼底檢查均未見異常。
圖2
XLRS家系先證者（Ⅳ3）彩色眼底、OCT像。2A、2B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼黃斑劈裂。2C、2D分別示右眼、左眼OCT像。右眼黃斑區內核層劈裂，左眼神經節細胞層、內核層、外核層劈裂，黃斑中心凹視網膜厚度增加。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥；OCT：光相干斷層掃描
圖3
XLRS家系先證者先證者（Ⅳ3） XLRS家系先證者舅舅彩色眼底、OCT像。3A、3B分別示右眼、左眼彩色眼底像。雙眼后極部視網膜增生膜，右眼黃斑萎縮，視網膜血管被牽拉變形，左眼黃斑劈裂。3C、3D分別示右眼、左眼OCT像。右眼黃斑區內核層劈裂；左眼神經節細胞層、內核層、外核層劈裂，黃斑中心凹視網膜厚度增加。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥；OCT：光相干斷層掃描
Panel測序結果顯示，先證者（Ⅳ3）及2例患者（Ⅱ1、Ⅲ8）RS1基因第5外顯子上存在c.361C>T/p.Q121X半合子突變（圖4A）；其母親為該基因雜合突變攜帶者，父親無變異（圖4B，4C），父母親表型均正常，該突變在家系中呈共分離。該突變基因導致RS1蛋白提前終止，由原來編碼224個氨基酸突變為120個氨基酸的截短蛋白。家系中其他眼底檢查未見異常者10名中，正常者6名，其中男性4名（Ⅳ1、Ⅳ5、Ⅳ7、Ⅳ8），女性2名（Ⅱ2、Ⅳ6）；該基因突變攜帶者4名（Ⅱ5、Ⅲ3、Ⅳ2、Ⅳ4），均為女性。該突變在千人基因組、gnomAD、ExAC等正常人數據庫以及人類基因突變數據庫（HGMD）、clinVAR均未見收錄，檢索PubMed亦未見相關文獻報道，為RS1基因新發現突變。
圖4
XLRS家系RS1基因測序圖。4A示先證者，RS1基因第5外顯子的c.361C>T/p.Q121X半合子突變（紅箭）；4B示先證者母親，該位點雜合突變（紅箭）；4C示先證者父親，該位點不存在突變（紅箭）。XLRS：X連鎖視網膜劈裂癥
蛋白序列同源性分析結果顯示，RS1基因p.Q121X突變所對應的第121位谷氨酰胺在12種哺乳動物高度保守（圖5）。MutationTaster預測該突變為有害。RS1蛋白三維結構分析結果顯示，突變后的蛋白C端氨基酸序列缺失＞50%（圖6）。根據ACMG指南，該突變具有1個PVS1證據、1個PM2證據、1個PP4證據，滿足致病性證據，判斷為致病性突變。
圖5
RS1蛋白序列在12種哺乳動物中的保守性分析圖。RS1 p.Q121X突變所對應的第121位谷氨酰胺在人（Homo）、黑猩猩（Pongo）、獅尾狒（Theropithecus）、小鼠（Mus）、大鼠（Rattus）、馬（Equus）、狐（Vulpes）、貓（Felis）、牛（Bos）、 抹香鯨（Physeter）、犬（Canis）、豬（Sus）中均高度保守
圖6
RS1蛋白三維結構分析圖。6A示野生型RS1蛋白第121位的谷氨酰胺C端氨基酸序列完整；6B示突變型RS1蛋白第121位谷氨酰胺C端氨基酸序列缺失＞50%
3 討論
XLRS多見于男性，常雙眼對稱發病，也可單眼發病，BCVA為手動～0.8 [7-8]。對于疑似XLRS患者，OCT檢查對鑒別視網膜劈裂癥有重要意義[9]。OCT檢查可見黃斑區視網膜劈裂腔，其典型表現為黃斑區視網膜內核層劈裂、隆起，形成囊腔，近黃斑旁視網膜可見橋樣連接分隔的小囊腔[10-12]。XLRS是一種進行性視網膜退行性疾病[13]，應定期監測以評估疾病的進展并處理潛在并發癥[11]。
目前根據HGMD數據庫統計已經發現330種RS1致病性基因突變，多數為錯義突變，缺失變異、剪接位點突變和無義突變則較少[3-5]。Sauer等[2]發現XLRS的致病基因是位于Xp22的RS1。RS1在光感受器細胞和雙極細胞中表達，包含6個外顯子，編碼RS1蛋白，其由224個氨基酸組成，并含有一個高度疏水的信號肽。這個信號肽被肽酶剪切，形成成熟的蛋白，在細胞核內層充當細胞之間的連接[14]。RS1蛋白包含幾個結構域：由外顯子1、2（氨基酸1～23）編碼的疏水信號序列，由外顯子3（氨基酸23～62）編碼的RS1結構域和由外顯子4～6（氨基酸63~219）編碼的高度保守的盤狀結構域。保守的盤狀蛋白結構域存在于細胞外或跨膜蛋白中，對于穩定視網膜細胞結構和建立適當的突觸連接至關重要[15-17]。
本研究中3例患者經Panel測序均發現RS1基因第5外顯子上存在無義突變（c.361C>T/p.Q121X），導致RS1蛋白提前終止，由原來編碼224個氨基酸突變為120個氨基酸的截短蛋白。RS1蛋白是由光感受器細胞和雙極細胞組裝和分泌的一種同源寡聚蛋白復合物，在視網膜的細胞組織中起著至關重要的作用[18]。RS1蛋白功能域位于68～217位氨基酸，該功能域為FA58C，是凝血因子5/8 C端結構域，在細胞表面附著碳水化合物起著重要作用，本研究中患者攜帶的突變使功能域大部分氨基酸丟失，從而導致疾病的發生。
XLRS臨床檢查結果缺乏特異性，如黃斑區視網膜劈裂需與黃斑水腫鑒別，視網膜脫離需判斷病因為原發性還是繼發性等。因此，基因檢測結合OCT和視網膜電圖（ERG）檢查對XLRS的臨床診斷具有重要意義[19]。本家系患者未行ERG檢查，因此無法對ERG檢查結果與基因突變型進行相關性分析。今后研究中，將對該類疾病患者行ERG檢查，以進一步明確RS1基因型與臨床表型之間的關系。XLRS目前尚無有效治療方法，篩選基因突變對于了解XLRS的發病機制，探索新的有效治療方法至關重要[20]。
本研究對一個XLRS家系進行了分子遺傳學研究，證實了該家系的致病基因為RS1基因，并發現了該基因第5外顯子一個新的無義突變c.361C>T/p.Q121X，不僅擴大了RS1基因的突變譜，還為該疾病的遺傳咨詢、產前診斷以及將來的基因治療等提供了重要依據。
