引用本文： 李輝, 洪亞茹, 劉勃實, 東莉潔, 滕賀. 骨形成蛋白4對人視網膜微血管內皮細胞糖酵解水平的影響. 中華眼底病雜志, 2022, 38(10): 840-845. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210714-00379 復制
激光光凝和抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是目前治療視網膜新生血管的主要方法；激光光凝為破壞性治療，抗VEGF藥物治療也有其可能的副作用[1]。研究表明糖酵解水平在病理性新生血管內皮細胞中顯著升高[2]。正常血管內皮細胞葡萄糖能量代謝的穩態由糖酵解和線粒體氧化磷酸化的動態平衡所決定，當平衡被打破，細胞內的能量代謝由線粒體氧化磷酸化轉為糖酵解時細胞將會向著增生方向發展[3-4]。降低新生血管內皮細胞的糖酵解水平可減少內皮細胞的增生，有效抑制新生血管生成[5]。骨形成蛋白4（BMP4）作為轉化生長因子家族中的一員，在細胞增生、穩定、遷移等方面發揮重要作用[6]。BMP4作用于其細胞膜上的受體后通過磷酸化SMAD家族蛋白而發揮作用[7]。氧化應激狀態下SMAD家族參與細胞的能量代謝，調控細胞糖酵解水平[8]。4-羥基壬烯醛（4-HNE）是脂質過氧化/氧化應激的重要產物，與氧化應激密切相關且可誘導細胞氧化應激[9]。我們既往研究發現BMP4表達上調可促進血管內皮細胞的增生遷移[10]。然而BMP4如何促進人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）的增生和遷移卻知之甚少。本研究采用4-HNE誘導hRMEC建立氧化應激細胞模型，檢測hRMEC內BMP4、SMAD同源物9（SMAD9）表達變化，驗證BMP4對hRMEC增生、遷移作用，明確BMP4對hRMEC內糖酵解水平的影響。從糖酵解調控作用探討視網膜新生血管類疾病的病理機制并為治療提供新的線索。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
hRMEC（本實驗室自行保存）；噻唑藍（MTT）增生檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、兔源BMP4抗體、兔源SMAD9抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Abcam公司）；4-HNE（美國Sigma公司）；Servicebio RT Frist Strand cDNA 合成試劑盒、Seahorse XF糖酵解壓力測定試劑盒（美國Agilent公司）。
1.2 方法
hRMEC在含有10% 胎牛血清和1%聚苯乙烯的Dulbecco改良Eagle培養基中生長，并置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養。hRMEC分為正常組、4-HNE組、BMP4組。BMP4組細胞培養基加入10 μmmol/L 4-HNE，刺激6 h后加入100 ng/ml重組人BMP4。正常組正常培養，不做任何處理。
流式細胞儀檢測各組細胞中活性氧（ROS）水平。各組細胞完全培養基和去除血清的培養基依次培養24 h。待細胞生長融合度約為80%時，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育1 h，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
MTT比色法檢測4-HNE對hRMEC生存力的影響。細胞密度達到70%時，胰酶消化細胞，以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，并將其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h后，加入110 μl/孔 MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h，加入150 μl/孔二甲基亞砜；正常組加入110 μl/孔 MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。每組設3個重復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定4-HNE對hRMEC遷移能力的影響。細胞密度達到70%時，以6×105個/ml的密度接種于6孔板中，并將其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養24 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用Image J軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0－S24）/S0×100%（S0：原始裸區面積，S24：培養24 h時裸區面積）。
Transwell小室法檢測4-HNE對hRMEC遷移能力的影響。細胞密度達到80%時，以5×104個/ml的密度接種于96孔板中，并其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h。細胞培養板上室加入100 μl不含血清的細胞懸液，細胞密度5×104個/孔。下室加入完全培養基，刺激24 h，多聚甲醛固定20 min，擦去上層未遷移細胞，結晶紫染色并拍照。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。384孔板中按說明書依次加樣，以離心半徑13.8 cm、1 500 r/min離心5 min。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參，依照公式2?ΔΔCt計算BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量。
表1
基因擴增測序引物
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9蛋白相對表達量。收集正常組、4-HNE組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。按照說明書配膠，每個樣孔加入20 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。10%脫脂牛奶封閉，1∶1 000 一抗4 ℃孵育24 h，洗膜10 min，重復5次；加入化學發光劑，暗室曝光。
Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定正常組、4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解代謝水平。37 ℃ CO2培養箱中取出細胞培養微孔板，水浴中去除雜質，細胞培養基更換為加溫的檢測培養基，置于37 ℃非CO2培養箱中培養45～60 min。添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脫氧葡萄糖，測定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的細胞外酸化率（ECAR）（圖1）。每個標繪值≥3個一式三份重復孔的平均值，根據基線ECAR和總蛋白水平進行標準化。
圖1
糖酵解測量示意圖
采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
）表示。組間比較采用單因素方差分析；正常組與4-HNE組、BMP4組間兩兩比較采用Dunnetts't檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
4-HNE組ROS水平較正常組顯著升高，差異有統計學意義（F=88.61，P＜0.001）（圖2）。證實hRMEC氧化應激模型建模成功。
圖2
4-HNE組與正常組ROS水平比較（n=6）。2A示流式細胞儀檢測圖；2B示4-HNE組與正常組ROS水平比較。4-HNE組ROS水平較正常組顯著升高，***P＜0.001。4-HNE：羥基壬烯醛；ROS：活性氧
與正常組比較，4-HNE組、BMP4組ROS水平顯著升高，差異有統計學意義（F=53.40、50.30，P＜0.001）。4-HNE組、BMP4組細胞ROS水平比較，差異無統計學意義（F=52.31，P=28.79）（圖3）。
圖3
正常組、4-HNE組、BMP4組hRMEC內ROS水平比較（n=6）。3A示流式細胞儀檢測圖；3B示正常組、4-HNE組、BMP4組細胞中ROS水平比較。與正常組比較，4-HNE組、BMP4組ROS表達水平顯著升高，***P＜0.001。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；ROS：活性氧
正常組、4-HNE組細胞生存力分別為1.05±0.05、1.28±0.05；4-HNE組細胞生存力較正常組提高，差異有統計學意義（F=54.35，P＜0.01）。細胞培養24 h后，正常組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組可見大量細胞遷移進入裸區（圖4）。正常組、4-HNE組細胞遷移率分別為（0.148±0.005）%、（0.376±0.015）%，4-HNE組細胞遷移率較正常組明顯升高，差異有統計學意義（F=52.84，P＜0.001）。正常組、4-HNE組穿過小孔的細胞數分別為（109.0±9.6）、（318.0±6.4）個；4-HNE組穿過小孔細胞數較正常組明顯增多，差異有統計學意義（F=84.35，P＜0.001）（圖5）。
圖4
正常組、4-HNE組細胞遷移率比較（n=6）。4A、4B分別示正常組、4-HNE組細胞培養0 h；4C、4D分別示正常組、4-HNE組細胞培養24 h，正常組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組可見大量細胞遷移進入裸區。標尺：200 μm。4-HNE：4-羥基壬烯醛
圖5
正常組、4-HNE組光學顯微鏡像。5A、5B分別示正常組、4-HNE組，4-HNE組穿過小孔細胞數較正常組明顯升高增多 結晶紫 標尺：20 μm 。4-HNE：4-羥基壬烯醛
qRT-PCR檢測結果顯示，BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量，正常組均為1；4-HEN組分別為1.680±0.039、1.760±0.011。與正常組比較，差異有統計學意義（F=53.66、83.54，P＜0.05）（圖6）。Western blot檢測結果顯示，正常組、4-HEN組細胞中BMP4、SMAD9 蛋白相對表達量分別為0.620±0.045、0.860±0.190和0.166±0.049、0.309±0.038；兩組比較，差異有統計學意義（F=24.87、53.84，P＜0.05）（圖7）。
圖6
正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量比較（n=6）。6A、6B分別示BMP4、SMAD9。與正常組比較，**P＜0.01。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；SMAD9：SMAD同源物9
圖7
正常組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白相對表達量比較（n=6）。7A、7B分別示BMP4、SMAD9。4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9蛋白相對表達量較正常組升高， **P＜0.01。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；SMAD9：SMAD同源物9
細胞能量代謝測定結果顯示，正常組、4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR分別為1.21±0.12、2.84±0.24、1.78±0.36，2.59±0.11、5.34±0.32、2.78±0.45和2.64±0.13、5.2±0.28、2.66±0.33；與正常組比較，差異均有統計學意義（4-HNE組：F=86.34、69.75、58.45，P＜0.001；BMP4組：F=56.87、59.35、58.35，P＜0.001、0.001、0.05）（圖8）。4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR比較，差異均無統計學意義（F=48.32、56.33、55.01，P＞0.05）。
圖8
正常組、4-HNE組、 BMP4組細胞中糖酵解的ECAR比較（n=6）。8A～8C分別示糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備。***P＜0.001。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；ECAR：細胞外酸化率
3 討論
新生血管的形成與發展是視網膜血管性疾病發展的關鍵，視網膜血管性疾病一旦進入新生血管形成期即意味著疾病發展加速，嚴重并發癥發生的幾率極大增加。異常增生的新生血管可從視網膜延伸至玻璃體內。新生血管脆弱易出血，可導致玻璃體積血，當積血量大不能吸收時可導致機化條索形成，晚期可引發牽拉性視網膜脫離，嚴重影響視力甚至致盲。當新生血管侵及虹膜時，可向前房角生長、阻塞小梁網，晚期新生血管膜收縮可導致房角關閉，房水流出受阻，眼內壓升高，導致新生血管型青光眼。可見內皮細胞增生以及新生血管形成貫穿于整個視網膜血管疾病的發生發展過程中，對其進行干預可為探索視網膜血管類疾病的病因和治療提供新的研究方向和線索。
內皮細胞增生主要依賴糖酵解，且85%的能量供應來自糖酵解[11-12]。研究發現，血管內皮細胞具有更高的糖酵解速率，甚至可與腫瘤細胞的糖酵解速率相當。其糖酵解速率約為其他供能途徑（如谷氨酰胺氧化、脂肪酸氧化等）速率的200倍[11]。糖酵解在內皮細胞的代謝中占主導地位，內皮細胞的分化和增生主要由糖酵解供能。血管發育時，內皮細胞從靜止狀態轉為活躍狀態，其糖酵解量大大提高，從而為血管發育提供能量[13]。在血管發育的過程中，VEGF、成纖維細胞生長因子和缺氧等因素也可驅動內皮細胞的糖酵解。研究發現，VEGF誘導血管內皮細胞的糖酵解通量增加一倍以上[14-15]。除了糖酵解對新生血管的直接作用，其產物乳酸對新生血管也顯示出其顯著的作用[16]。研究發現，酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸（YEP）相關蛋白參與病理性新生血管的形成，通過與糖酵解關鍵調節因子磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3的啟動子結合而啟動新生血管的發生[17]。玻璃體腔內注射YEP相關蛋白的抑制劑可明顯抑制脈絡膜新生血管[18]。綜上，在血管內皮細胞從靜息期轉入活動期，進行血管發生作用的時候，糖酵解是主要供能途徑，對新生血管的生成起關鍵作用，因此通過影響糖酵解來干預新生血管生成是一條值得關注的途徑。
BMP4屬于轉化生長因子β超家族的成員，可誘導血管發生和新生血管生成。BMP4可能通過刺激視網膜色素上皮細胞釋放VEGF，在調節視網膜新生血管生成中發揮作用[19]。有研究顯示，BMP4可誘導SMAD8/9的激活，引起細胞增生和去分化[20-21]。BMP4在細胞能量代謝中也發揮著重要作用，Watanabe等[8]指出BMP4與線粒體功能障礙和（或）細胞能量代謝異常相關，并伴有其下游SMAD信號分子的磷酸化。Shin等[22]發現，BMP4信號通路參與小鼠的能量代謝以及葡萄糖的穩態調節。我們推測在視網膜血管內皮細胞進行血管發生作用時，BMP4可能參與了血管內皮細胞的能量代謝。
本研究重點關注氧化應激條件下，hRMEC中BMP4的表達水平及BMP4對糖酵解的調控作用。4-HNE是脂質過氧化/氧化應激的重要產物，我們應用4-HNE模擬視網膜血管病變的氧化應激反應，結果顯示，4-HNE處理后的hRMEC中BMP4、SMAD9表達升高；MTT細胞增生和細胞劃痕實驗結果證實BMP4對hRMEC增生和遷移作用，BMP4可誘導細胞的增生和遷移。而在BMP4刺激下，SMAD9表達升高，我們推測BMP4在hRMEC模型中通過SMAD9發揮作用。BMP4組糖酵解水平、糖酵解能力和糖酵解儲備較正常組均明顯增高，差異有統計學意義。這提示BMP4可顯著提高hRMEC中的糖酵解水平，從而為血管內皮細胞的增生、遷移和新生血管發生提供能量供給。
本研究結果表明，hRMEC在氧化應激狀態下BMP4表達增高，而BMP4表達增高會激活下游信號分子并提高糖酵解水平。本研究首次在hRMEC中指出BMP4對糖酵解的影響，其或是通過激活其下游SMAD信號通路而實現的，但具體的機制尚不明確，這也將成為我們今后研究的探索方向。
激光光凝和抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是目前治療視網膜新生血管的主要方法；激光光凝為破壞性治療，抗VEGF藥物治療也有其可能的副作用[1]。研究表明糖酵解水平在病理性新生血管內皮細胞中顯著升高[2]。正常血管內皮細胞葡萄糖能量代謝的穩態由糖酵解和線粒體氧化磷酸化的動態平衡所決定，當平衡被打破，細胞內的能量代謝由線粒體氧化磷酸化轉為糖酵解時細胞將會向著增生方向發展[3-4]。降低新生血管內皮細胞的糖酵解水平可減少內皮細胞的增生，有效抑制新生血管生成[5]。骨形成蛋白4（BMP4）作為轉化生長因子家族中的一員，在細胞增生、穩定、遷移等方面發揮重要作用[6]。BMP4作用于其細胞膜上的受體后通過磷酸化SMAD家族蛋白而發揮作用[7]。氧化應激狀態下SMAD家族參與細胞的能量代謝，調控細胞糖酵解水平[8]。4-羥基壬烯醛（4-HNE）是脂質過氧化/氧化應激的重要產物，與氧化應激密切相關且可誘導細胞氧化應激[9]。我們既往研究發現BMP4表達上調可促進血管內皮細胞的增生遷移[10]。然而BMP4如何促進人視網膜微血管內皮細胞（hRMEC）的增生和遷移卻知之甚少。本研究采用4-HNE誘導hRMEC建立氧化應激細胞模型，檢測hRMEC內BMP4、SMAD同源物9（SMAD9）表達變化，驗證BMP4對hRMEC增生、遷移作用，明確BMP4對hRMEC內糖酵解水平的影響。從糖酵解調控作用探討視網膜新生血管類疾病的病理機制并為治療提供新的線索。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要材料
hRMEC（本實驗室自行保存）；噻唑藍（MTT）增生檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、兔源BMP4抗體、兔源SMAD9抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Abcam公司）；4-HNE（美國Sigma公司）；Servicebio RT Frist Strand cDNA 合成試劑盒、Seahorse XF糖酵解壓力測定試劑盒（美國Agilent公司）。
1.2 方法
hRMEC在含有10% 胎牛血清和1%聚苯乙烯的Dulbecco改良Eagle培養基中生長，并置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養。hRMEC分為正常組、4-HNE組、BMP4組。BMP4組細胞培養基加入10 μmmol/L 4-HNE，刺激6 h后加入100 ng/ml重組人BMP4。正常組正常培養，不做任何處理。
流式細胞儀檢測各組細胞中活性氧（ROS）水平。各組細胞完全培養基和去除血清的培養基依次培養24 h。待細胞生長融合度約為80%時，無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針（終濃度2.5 μmol/L），孔板中孵育1 h，流式細胞儀檢測各組細胞中ROS水平。實驗重復3次。
MTT比色法檢測4-HNE對hRMEC生存力的影響。細胞密度達到70%時，胰酶消化細胞，以1×104個/ml的密度接種于96孔板中，并將其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h后，加入110 μl/孔 MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h，加入150 μl/孔二甲基亞砜；正常組加入110 μl/孔 MTT， 37 ℃敷箱中孵化4 h。采用酶鏈免疫檢測儀測量波長490 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。每組設3個重復孔，實驗重復3次。
細胞劃痕實驗測定4-HNE對hRMEC遷移能力的影響。細胞密度達到70%時，以6×105個/ml的密度接種于6孔板中，并將其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h。于孔板中央作“十”字狀劃痕，并將此時計作0 h，繼續培養24 h后在相同劃痕位置拍照記錄。應用Image J軟件計算細胞遷移面積，遷移率=（S0－S24）/S0×100%（S0：原始裸區面積，S24：培養24 h時裸區面積）。
Transwell小室法檢測4-HNE對hRMEC遷移能力的影響。細胞密度達到80%時，以5×104個/ml的密度接種于96孔板中，并其分為正常組、4-HNE組。4-HNE組加入4-HNE刺激細胞6 h。細胞培養板上室加入100 μl不含血清的細胞懸液，細胞密度5×104個/孔。下室加入完全培養基，刺激24 h，多聚甲醛固定20 min，擦去上層未遷移細胞，結晶紫染色并拍照。
實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。384孔板中按說明書依次加樣，以離心半徑13.8 cm、1 500 r/min離心5 min。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參，依照公式2?ΔΔCt計算BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量。
表1
基因擴增測序引物
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9蛋白相對表達量。收集正常組、4-HNE組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。按照說明書配膠，每個樣孔加入20 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；80 V 恒壓0.5 h，樣品進入分離膠后100 V恒壓2 h，300 mA轉膜2 h。10%脫脂牛奶封閉，1∶1 000 一抗4 ℃孵育24 h，洗膜10 min，重復5次；加入化學發光劑，暗室曝光。
Seahorse XFe96細胞能量代謝分析儀測定正常組、4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解代謝水平。37 ℃ CO2培養箱中取出細胞培養微孔板，水浴中去除雜質，細胞培養基更換為加溫的檢測培養基，置于37 ℃非CO2培養箱中培養45～60 min。添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脫氧葡萄糖，測定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的細胞外酸化率（ECAR）（圖1）。每個標繪值≥3個一式三份重復孔的平均值，根據基線ECAR和總蛋白水平進行標準化。
圖1
糖酵解測量示意圖
采用SPSS22.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（）表示。組間比較采用單因素方差分析；正常組與4-HNE組、BMP4組間兩兩比較采用Dunnetts't檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
4-HNE組ROS水平較正常組顯著升高，差異有統計學意義（F=88.61，P＜0.001）（圖2）。證實hRMEC氧化應激模型建模成功。
圖2
4-HNE組與正常組ROS水平比較（n=6）。2A示流式細胞儀檢測圖；2B示4-HNE組與正常組ROS水平比較。4-HNE組ROS水平較正常組顯著升高，***P＜0.001。4-HNE：羥基壬烯醛；ROS：活性氧
與正常組比較，4-HNE組、BMP4組ROS水平顯著升高，差異有統計學意義（F=53.40、50.30，P＜0.001）。4-HNE組、BMP4組細胞ROS水平比較，差異無統計學意義（F=52.31，P=28.79）（圖3）。
圖3
正常組、4-HNE組、BMP4組hRMEC內ROS水平比較（n=6）。3A示流式細胞儀檢測圖；3B示正常組、4-HNE組、BMP4組細胞中ROS水平比較。與正常組比較，4-HNE組、BMP4組ROS表達水平顯著升高，***P＜0.001。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；ROS：活性氧
正常組、4-HNE組細胞生存力分別為1.05±0.05、1.28±0.05；4-HNE組細胞生存力較正常組提高，差異有統計學意義（F=54.35，P＜0.01）。細胞培養24 h后，正常組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組可見大量細胞遷移進入裸區（圖4）。正常組、4-HNE組細胞遷移率分別為（0.148±0.005）%、（0.376±0.015）%，4-HNE組細胞遷移率較正常組明顯升高，差異有統計學意義（F=52.84，P＜0.001）。正常組、4-HNE組穿過小孔的細胞數分別為（109.0±9.6）、（318.0±6.4）個；4-HNE組穿過小孔細胞數較正常組明顯增多，差異有統計學意義（F=84.35，P＜0.001）（圖5）。
圖4
正常組、4-HNE組細胞遷移率比較（n=6）。4A、4B分別示正常組、4-HNE組細胞培養0 h；4C、4D分別示正常組、4-HNE組細胞培養24 h，正常組僅有少量細胞遷移進入裸區，4-HNE組可見大量細胞遷移進入裸區。標尺：200 μm。4-HNE：4-羥基壬烯醛
圖5
正常組、4-HNE組光學顯微鏡像。5A、5B分別示正常組、4-HNE組，4-HNE組穿過小孔細胞數較正常組明顯升高增多 結晶紫 標尺：20 μm 。4-HNE：4-羥基壬烯醛
qRT-PCR檢測結果顯示，BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量，正常組均為1；4-HEN組分別為1.680±0.039、1.760±0.011。與正常組比較，差異有統計學意義（F=53.66、83.54，P＜0.05）（圖6）。Western blot檢測結果顯示，正常組、4-HEN組細胞中BMP4、SMAD9 蛋白相對表達量分別為0.620±0.045、0.860±0.190和0.166±0.049、0.309±0.038；兩組比較，差異有統計學意義（F=24.87、53.84，P＜0.05）（圖7）。
圖6
正常組、4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9 mRNA相對表達量比較（n=6）。6A、6B分別示BMP4、SMAD9。與正常組比較，**P＜0.01。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；SMAD9：SMAD同源物9
圖7
正常組、4-HNE組細胞中BMP4蛋白相對表達量比較（n=6）。7A、7B分別示BMP4、SMAD9。4-HNE組細胞中BMP4、SMAD9蛋白相對表達量較正常組升高， **P＜0.01。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；SMAD9：SMAD同源物9
細胞能量代謝測定結果顯示，正常組、4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR分別為1.21±0.12、2.84±0.24、1.78±0.36，2.59±0.11、5.34±0.32、2.78±0.45和2.64±0.13、5.2±0.28、2.66±0.33；與正常組比較，差異均有統計學意義（4-HNE組：F=86.34、69.75、58.45，P＜0.001；BMP4組：F=56.87、59.35、58.35，P＜0.001、0.001、0.05）（圖8）。4-HNE組、BMP4組細胞內糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備的ECAR比較，差異均無統計學意義（F=48.32、56.33、55.01，P＞0.05）。
圖8
正常組、4-HNE組、 BMP4組細胞中糖酵解的ECAR比較（n=6）。8A～8C分別示糖酵解、糖酵解能力、糖酵解儲備。***P＜0.001。4-HNE：4-羥基壬烯醛；BMP4：骨形成蛋白4；ECAR：細胞外酸化率
3 討論
新生血管的形成與發展是視網膜血管性疾病發展的關鍵，視網膜血管性疾病一旦進入新生血管形成期即意味著疾病發展加速，嚴重并發癥發生的幾率極大增加。異常增生的新生血管可從視網膜延伸至玻璃體內。新生血管脆弱易出血，可導致玻璃體積血，當積血量大不能吸收時可導致機化條索形成，晚期可引發牽拉性視網膜脫離，嚴重影響視力甚至致盲。當新生血管侵及虹膜時，可向前房角生長、阻塞小梁網，晚期新生血管膜收縮可導致房角關閉，房水流出受阻，眼內壓升高，導致新生血管型青光眼。可見內皮細胞增生以及新生血管形成貫穿于整個視網膜血管疾病的發生發展過程中，對其進行干預可為探索視網膜血管類疾病的病因和治療提供新的研究方向和線索。
內皮細胞增生主要依賴糖酵解，且85%的能量供應來自糖酵解[11-12]。研究發現，血管內皮細胞具有更高的糖酵解速率，甚至可與腫瘤細胞的糖酵解速率相當。其糖酵解速率約為其他供能途徑（如谷氨酰胺氧化、脂肪酸氧化等）速率的200倍[11]。糖酵解在內皮細胞的代謝中占主導地位，內皮細胞的分化和增生主要由糖酵解供能。血管發育時，內皮細胞從靜止狀態轉為活躍狀態，其糖酵解量大大提高，從而為血管發育提供能量[13]。在血管發育的過程中，VEGF、成纖維細胞生長因子和缺氧等因素也可驅動內皮細胞的糖酵解。研究發現，VEGF誘導血管內皮細胞的糖酵解通量增加一倍以上[14-15]。除了糖酵解對新生血管的直接作用，其產物乳酸對新生血管也顯示出其顯著的作用[16]。研究發現，酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸（YEP）相關蛋白參與病理性新生血管的形成，通過與糖酵解關鍵調節因子磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3的啟動子結合而啟動新生血管的發生[17]。玻璃體腔內注射YEP相關蛋白的抑制劑可明顯抑制脈絡膜新生血管[18]。綜上，在血管內皮細胞從靜息期轉入活動期，進行血管發生作用的時候，糖酵解是主要供能途徑，對新生血管的生成起關鍵作用，因此通過影響糖酵解來干預新生血管生成是一條值得關注的途徑。
BMP4屬于轉化生長因子β超家族的成員，可誘導血管發生和新生血管生成。BMP4可能通過刺激視網膜色素上皮細胞釋放VEGF，在調節視網膜新生血管生成中發揮作用[19]。有研究顯示，BMP4可誘導SMAD8/9的激活，引起細胞增生和去分化[20-21]。BMP4在細胞能量代謝中也發揮著重要作用，Watanabe等[8]指出BMP4與線粒體功能障礙和（或）細胞能量代謝異常相關，并伴有其下游SMAD信號分子的磷酸化。Shin等[22]發現，BMP4信號通路參與小鼠的能量代謝以及葡萄糖的穩態調節。我們推測在視網膜血管內皮細胞進行血管發生作用時，BMP4可能參與了血管內皮細胞的能量代謝。
本研究重點關注氧化應激條件下，hRMEC中BMP4的表達水平及BMP4對糖酵解的調控作用。4-HNE是脂質過氧化/氧化應激的重要產物，我們應用4-HNE模擬視網膜血管病變的氧化應激反應，結果顯示，4-HNE處理后的hRMEC中BMP4、SMAD9表達升高；MTT細胞增生和細胞劃痕實驗結果證實BMP4對hRMEC增生和遷移作用，BMP4可誘導細胞的增生和遷移。而在BMP4刺激下，SMAD9表達升高，我們推測BMP4在hRMEC模型中通過SMAD9發揮作用。BMP4組糖酵解水平、糖酵解能力和糖酵解儲備較正常組均明顯增高，差異有統計學意義。這提示BMP4可顯著提高hRMEC中的糖酵解水平，從而為血管內皮細胞的增生、遷移和新生血管發生提供能量供給。
本研究結果表明，hRMEC在氧化應激狀態下BMP4表達增高，而BMP4表達增高會激活下游信號分子并提高糖酵解水平。本研究首次在hRMEC中指出BMP4對糖酵解的影響，其或是通過激活其下游SMAD信號通路而實現的，但具體的機制尚不明確，這也將成為我們今后研究的探索方向。
